ESCUELA SUPERIOR POLITÉCNICA DE CHIMBORAZO

FACULTAD: CIENCIAS

ESCUELA DE BIOQUÍMICA Y FARMACIA

CARRERA: BIOQUÍMICA Y FARMACIA

ANÁLISIS QUÍMICO INSTRUMENTAL II

TEMA: RESUMENES DE LAS GUÍAS DE LABORATORIO

NOMBRES: CÓDIGOS:

ALLAUCA MARÍA BELÉN 3601

CHICAIZA YULISSA 3562
GUAILLA ELIANA 3540
REINOSO DEYANEYRA 3737
VARGAS VALERIA 3685

DOCENTE: BQF. JOHN QUISPILLO

NIVEL: QUINTO PARALELO: “B”

LUGAR DE REALIZACIÓN: LABORATORIO DE QUÍMICA INSTRUMENTAL

FECHA DE REALIZACIÓN: FECHA DE ENTREGA:

2022/02/08 2022/02/10
 METODOLÓGIA

Rotule cuatro tubos

de ensayo con el
nombre del
disolvente que se va
ensayar.

Coloque 5 mL de la
Observe y anote los solución de lugol en
resultados. los 4 tubos de
ensayo.

Actividad 1.
Selección del
disolvente para la
extracción.

Adicione 3 mL de
disolvente (Hexano,
Agite levemente los Cloroformo, Acetato de
tubos, colóquelos en etilo y Tolueno), de
una gradilla. acuerdo a lo que
corresponda según el
rotulo de cada tubo.
 Coloque 30 mL de la
En el primer embudo
solución de lugol en
(A), adicione 30 mL
Actividad 2. cada uno de dos
del disolvente
Extracción. embudos (A y B) de
seleccionado en la
separación de 100
actividad 1
mL.

Después de los
primeros 5 a 10
En el segundo
segundos de
embudo (B), adicione
agitación, colocar el Tape el embudo y
15 mL del disolvente
embudo en posición agite vigorosamente.
seleccionado en la
vertical con la punta
actividad 1.
apuntando hacia
arriba.

Cierre la llave y agite Coloque el embudo

Abrir la llave para por dos minutos, en posición vertical
liberar la presión. liberando la presión normal sobre un
de forma periódica. soporte.

En la fase acuosa
obtenida en el
Recoja en vasos de Quite la tapa del
segundo embudo (B),
precipitación embudo de separación
realice una segunda
diferentes la fase y espere hasta la
extracción con 15 mL
orgánica y la fase separación de las
de disolvente y repita
acuosa. fases.
los pasos descritos de
(d a j).

Observe y anote los

resultados.
 CLASIFICACIÓN DE EQUIPOS DE EXTRACCIÓN LÍQUIDA–LÍQUIDA

Extracción líquido – líquido simple

• Embudo de separación de 100ml con tapa

Instrumento especialmente indicado para separar
líquidos inmiscibles que se separan, por diferencia
de densidades y propiedades moleculares mediante
una interface bien diferenciada.

• Vasos de precipitación
Recipiente cilíndrico de vidrio borosilicatado fino
que se utiliza muy comúnmente en el laboratorio,
sobre todo, para preparar o calentar sustancias,
medir o traspasar líquidos. Aquí se recuperar el
producto extraído a partir de las fases orgánicas
reunidas.

• Soporte universal
Es una es una pieza del equipamiento de laboratorio
donde se sujetan las pinzas de laboratorio, mediante
dobles nueces y que sirve para sujetar tubos de
ensayo, buretas, embudos de filtración y en este
caso embudos de decantación, etc

• Pinzas de Laboratorio
Se unen a la varilla por medio de las dobles
nueces, forman dos brazos que sujetan
diferentes instrumentos.

• Doble nueces
Son piezas que sujetan otros instrumentos.
Están compuestas por dos agujeros unidos a
dos tornillos. Se enganchan en la varilla y
sujetan aros, pinzas y otros soportes.
(Molina, 2015)
Extracción Líquido – Líquido continúa

• El equipo utiliza un sistema de extractor giratorio, de

alimentación continua con caudal en contracorriente y
de múltiples etapas, del tipo habitualmente usado en
aplicaciones industriales.

• Se dividide en compartimentos, donde la materia prima

se alimenta a estos compartimentos desde la tolva de
entrada.

• El material pasa luego por debajo de tres difusores de

disolvente y el producto disuelto se recoge en tres
compartimentos de drenaje.

• También hay bombas para bombear el producto desde

el compartimento de drenaje de una etapa al difusor de
la etapa siguiente.

• El material portador agotado irá a un recipiente de recogida.

• El portador sólido puede ser un material ligero y poroso.

• Puede impregnarse con una sal, como bicarbonato sódico o bicarbonato potásico,
que se extrae luego por el proceso. (Carbajal, 2015)

Extracción en etapas múltiples en contracorriente

• Mezcladores-Sedimentadores.

Este tipo de equipo puede variar desde un solo tanque, con agitador, que provoca la
mezcla de las fases y después se dejan sedimentar, hasta una gran estructura horizontal o
vertical compartimentada, ya que la mezcla puede realizarse de formas diferentes, como
por impacto en un mezclador de chorro.

• Torres de pulverización.
La dispersión en la fase continua limita la aplicación de este equipo a los casos en los que
solamente se requiere una o dos etapas.

• Torres de relleno.

Para extracción líquido-líquido se utilizan los

mismos tipos de relleno que en absorción y
destilación, por eso es preferible utilizar un material
que sea preferentemente mojado por la fase
continua.

• Torres de platos.

En este caso se prefieren los platos perforados. La

separación entre los platos es mucho menor que en
destilación: 10-15 cm para la mayor parte de las
aplicaciones con líquidos de baja tensión
interfacial. Cuando se opera con un régimen de flujo
adecuado, las velocidades de extracción en columnas de platos perforados son elevadas
debido a que las gotas de la fase dispersa coalescen y se vuelven a formar en cada etapa.
Esto favorece la destrucción de gradientes de concentración que se pueden formar cuando
las gotas pasan sin perturbación a través de toda la columna.

• Equipo de gravedad asistido mecánicamente.

Si las diferencias de densidad entre las dos fases líquidas son bajas, las fuerzas de
gravedad resultan insuficientes para una adecuada dispersión de las fases y creación de
turbulencia. Se incluye agitadores rotatorios accionados por un eje que se extiende
axialmente a lo largo de la columna con el fin de crear zonas de mezcla que alternan con
zonas de sedimentación en la columna.

• Extractores centrífugos.

Las fuerzas centrífugas, que pueden ser miles de veces superiores a las de la gravedad,
pueden facilitar las separaciones cuando se presentan problemas de emulsificación, las
diferencias de densidades son muy bajas, o cuando se requieren tiempos de residencia
muy pequeños debido a un rápido deterioro del producto, como ocurre en la industria de
antibióticos. (EcuRed contributors, 2019 )

Contactores por etapas:

Columna de platos.

El líquido liviano filtra por los orificios de los platos, de

esta manera se propaga en gotas y se elevan por la fase
continua. El líquido pesado atraviesa horizontalmente por
los platos y sigue al plato inferior por el tubo de descenso.

• Mezcladores sedimentadores.
En este extractor las fases líquidas se mezclan y
posteriormente por sedimentación se separan, esta etapa es
por gravedad en un sedimentador.

• Columna de Pulsos
En estos extractores se le da un movimiento oscilado breve al
líquido contenido, ya que esta agitación hace que las velocidades
extracción mejoren. Debido a que no hay partes móviles dentro de
la columna, estos extractores son utilizados en trabajos de energía
atómica cuando se trabajan con soluciones radiactivas

• Columna de Scheibel.
Consta de dos entradas una en la parte superior en donde ingresa el líquido pesado y una
entrada en la parte inferior donde ingresa el líquido ligero, de modo que el proceso se da
en contracorriente, de igual forma consta de dos salidas por la parte superior sale el
líquido ligero y por la parte inferior sale el líquido pesado, atravesando la columna existe
un eje rotatorio con agitadores que sirven para que se mezclen los líquidos. (Nuenze,
2013)
 PROCEDIMIENTO

5 rectángulos de papel cromatográfico

3,5cm A x 8cm L

Distancia del borde inferior

Trazar una línea 1cm

Con un capilar aplicar la

muestra sobre la línea base de
cada papel.

Verter la fase móvil en el

frasco y tapar

Introduzca cada uno de los

rectángulos de papel

El disolvente debe subir por Ascenso del

capilaridad a través del PC disolvente a 1 cm del Separación de los
colores
borde

Saque el papel del Marque una línea el

Señale las manchas que
frasco punto donde llegó el
encuentre.
disolvente

Deseche en un contenedor Vierta los disolventes en

de residuos el papel un frasco para residuos

Calcule los Rf para cada cromatografía

Realice los cálculos
en la cual se haya dado una separación
FUNDAMENTO

La cromatografía en papel es la técnica de separación de identificación de sustancias

químicas en la cual la fase estacionaria es el agua absorbida y adsorbida que hay en
el papel (papel filtro hecho de celulosa) y el soporte es el mismo papel. La fase móvil
es una solución que consiste en un disolvente o de una mezcla de varios líquidos que
contiene agua. (Eunice, 2011)

Todas estas sustancias presentan un grado diferente de solubilidad en disolventes

apolares, lo que permite su separación cuando una solución de estas asciende por
capilaridad a través de una tira de papel poroso (papel de cromatografía o de filtro)
dispuesta verticalmente sobre una película de un disolvente orgánico (etanol), ya que
las más solubles se desplazaran a mayor velocidad, pues acompañaran fácilmente al
disolventes a medida que este asciende. Las menos solubles avanzaran menos en la
tira de papel de filtro. Aparecerán, por tanto, varias bandas de diferentes colores (hasta
siete o más, dependiendo del material utilizado) que estarán más o menos alejados de
la disolución alcohólica según la mayor o menor solubilidad de los pigmentos. Estas
bandas poseerán diferente grosor, dependiendo de la abundancia del pigmento en la
disolución. (Mendoza, 2016)

En todo proceso cromatográfico la fase móvil es la que provoca un movimiento de las

distintas especies para que abandonen el medio soporte (papel), y la fase estacionaria
la que suministra el efecto retardador, selectivo para cada componente, que
condiciona que cada uno de ellos se desplace con distinta velocidad. La movilidad de
los componentes de la mezcla a separar depende de la afinidad química o propiedades
similares entre estos componentes y cada una de las fases del sistema cromatográfico.
Si uno de los componentes de la mezcla presenta propiedades químicas muy similares
a la fase móvil tendrá gran movilidad, es decir, el efecto de retención que provocaría
la fase estacionaria sería nulo. Lo contrario sucedería con un componente de la mezcla
que tenga una gran afinidad con la fase estacionaria. (Eunice, 2011)

Por lo tanto, la técnica se basa en la velocidad de desplazamiento diferencial de los

solutos al ser arrastrados por una fase móvil sobre una estacionaria. Esta diferencia
será la que nos permita identificar cuantos componentes tiene una disolución y cómo
separarlos. (Eunice, 2011)
 CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA CLÁSICA DE PIGMENTOS VEGETALES

Cromatografía en columna de
pigmentos vegetales
Columna cromatografía
clásica de pigmentos
vegetales

1.. EXTRACCIÓN DE
PIGMENTOS DE
ACELGA

5 g de acelga en un mortero y 2.. PREPARACIÓN DE 3...PREPARACIÓN DE COLUMNA

añadir 1g de carbonato cálcico ELUYENTES CROMATOGRÁFICA

Triturar probeta /vasos de precipitación Introducir

Añadir 10 ml Dejar 100ml de 50ml Poner porción de algodón en forma de disco en la

acetona macerar hexano hexano/acet columna, evitar tapar el orificio de la llave de la
ona (7:3) colmna.

Añadir

Abrir
50ml 5ml de hexano en la la llave
Filtrar el extracto Decoloracion 50ml acetona/metanol colmna
embudo Buchner es hojas acetona (8:2)

Filtrado resultante Dejar fluir lentamente el

hexano hasta que la
altura de éste quede 10
contiene las clorofilas a 15g de silica gel y
mm por encima de la
y b, los carotenoides, hexano (30ml) favorecer
silica.
las xantofilas el flujo golpe, evitar
burbujas.
Al inicio silica debe sedimentar 1.Compacta la
2.Añadir hexano en
al final debe ser de aspecto columna sembrar 1l
la superficie libre de
uniforme, superficie lisa al eje de muestra sobre la columna, abrir
longitudinal de la columna. superficie de arena. llave

Recoger cada uno de los

4. Repetir hasta que la
No dejar secar la fase 3.Añadir 1,5 ml de hexano, pigmentos separados en
estacionaria, colocar algodón muestra penetre la
abrir llave llegue a la altura de silícea llenar con
diferentes vasos de
por encima de la silica. precipitación.
algodón hexano la columna

5.Se observa Si la fase estacionaria

Abrir la llave y dejar fluir 6.En 2mm colocar, sln
separación de ocupa el 80% de la
el hexano, hastq 10mm de acetona, final
columna y el caudal
por encima de silica pigmentos a lo largo acetona:metanol.
es de 3mL/min.
de la columna.
Hexano en 2mm 02
El tr del 1 compuesto
cn factor de
Añadir 20ml de hexano por las retención de 10.0
paredes de la columna 4.. PROCESO DE
acarreando las partículas de SIEMBRA DE LA
silica MUESTRA Y
DESARROLLO
01 03
Cálculos K= factor de retencio
tr= tiempo de retención
tm= tiempo muerto

Cromatografía en
columna de
pigmentos vegetales
EQUIPO CROMATOGRAFÍA EN COLUMNA
CLÁSICA
Componentes de la cromatografía en columna Una fase móvil y
un sistema de administración: complementan la fase estacionaria
para discriminar entre los analitos de la muestra y administrar una
velocidad de flujo constante en la columna. Un sistema inyector:
para entregar muestras de prueba en la parte superior de la
columna de manera reproducible. Un detector y registrador
gráfico: un pico en el registrador gráfico representa cada
analito. Un colector de fracciones: para recolectar los analitos
separados para estudios bioquímicos adicionales.
• La cromatografía de capa de columna es una técnica de cromatografía utilizada
para separar la mezcla de sustancias químicas en sus compuestos individuales.
• La cromatografía consta de dos fases: una fase móvil y una fase estacionaria
contigua.
• La columna se prepara mezclando la sílice con un disolvente adecuado y se vierte
en una columna de vidrio.
• Se mueve un disolvente adecuado (fase móvil) junto con la mezcla de
compuestos a través de la columna según la polaridad.
TECPRO - DIGITAL
 ANÁLISIS DE VITAMINA C POR HPLC

1. ACTIVIDADES POR DESARROLLAR

PREPARACIÓN DE FASE MÓVIL

PREPARACIÓN DE
FASE MÓVIL

Preparara una solución de ácido orto

fosfórico al 0,2 % en agua tipo I

Filtre la fase móvil por un filtro de membrana

de 0,45 um.

Desgasificar la fase móvil por 10 minutos en el baño

ultrasónico
 Preparación del estándar madre de vitamina-C

PREPARACIÓN DEL
ESTÁNDAR MADRE DE
VITAMINA-C

1
Pesar 25 mg de vitamina-C y disolverlo
con la fase móvil en un matraz aforado
de 50 mL.
Estándar preparado
tiene una Si no se pesa
concentración de 500 exactamente 25 mg,
mg/L de vitamina-C 2
Aforar con la fase móvil.

Realizar cálculos para

saber la concentración
3 del estándar madre.
Tapar el matraz

Mezclar por
inversión

Preparación de los estándares de calibración

PREPARACIÓN DE LOS
ESTÁNDARES DE
CALIBRACIÓN
1

Con una pipeta, matraces En 5 estándares de

aforados y el disolvente la fase Preparar 25 mL calibración de 2,5; 10; 20 y
móvil 50 mg/L

A partir del estándar madre de

vitamina-C de 500 mg/L.
 Preparación del HPLC

PREPARACIÓN DEL HPLC

1
Encender los módulos del Al último el
HPLC controlador

2
Purguar las líneas con
metanol. Abrir la válvula de
purgado

Antes
del
Análisis

Purguar la línea que va

desde el recipiente de la fase
móvil hasta el mezclador.

Cuando se haya eliminado todo

el aire de la línea, parara la
purga y cerrar la válvula.
Configurar el flujo de la fase
móvil a 1 mL/min.
Desde el controlador del
HPLC

Activara la bomba Acondicionar el sistema por 15 Parar la bomba

minutos con metanol

Active la bomba y acondicione Colocar la fase móvil para

el equipo con la fase móvil de el análisis, ácido orto
trabajo por lo menos por 15 fosfórico al 0.2% en agua
minutos. tipo I.
 Flujo de fase móvil: 1,2 mL/min
Longitud de onda: 245 nm
Configurara el equipo en las Temperatura de horno: 30 °C
siguientes condiciones: Volumen de inyección: 30 uL
Tiempo de análisis: 7 min
Columna utilizada: C18

Cree la secuencia de análisis y Colocar los estándares y la

el método en el software del Corra la
muestra en la bandeja del
computador. secuencia.
automuestreador

PARTES DEL EQUIPO DE PHLC

DEPÓSITVOS PARA LA FASE MÓVIL

Recipientes inertes que suelen ser botellas de vidrio y tubos de teflón provistos de
aditamentos indispensables para eliminar los gases disueltos y partículas que pudiera
tener la fase móvil. (Grillo, 2022)

Tipos de elución

• Elución isocrática: Separación con disolvente de composición constante

• Elución con gradiente: Se utilizan dos o tres disolventes de distinta polaridad y
se varía la composición de forma continua o mediante etapas escalonadas.
ELUYENTES TÍPICOS

SISTEMAS DE BOMBEO
Son necesarios para conseguir y regular la presión y velocidad de flujo de la fase móvil.
Cuando la fase móvil es una mezcla de solventes, la bomba se programa para tomar los
diferentes solventes en una proporción determinada

Características

• Generar presiones por encima de 6000 psi

• Libre de pulsiones
• Intervalo de caudales de 0.1 a 10 mL/min.
• Reproducible
• Resistente a la corrosión

Tipos:
• Bombas reciprocas
• Bombas de desplazamiento
• Bombas neumáticas
SISTEMAS DE INYECCIÓN
Son válvulas dosificadoras que permiten regular la aplicación de la muestra en
volúmenes de 5 a 500 μl..

COLUMNA
Contiene a las partículas de la fase estacionaria
Columnas analíticas
• Acero inoxidable (hasta 10000 psi)
• 10-30 cm longitud
• 4-10mm diámetro interno
• 1-10μm tamaño de partícula
Precolumnas
• Se colocan delante de la columna para eliminar la materia en suspensión y
contaminantes del disolvente.
• La composición del relleno debe ser semejante a la columna analítica
TIPOS DE RELLENOS DE LA COLUMNA
Pelicular
• Bolas de vidrio o polímero, no porosas y esféricas
• Sobre su superficie se deposita una capa delgada y porosa de sílice, alúmina o
una resina de intercambio iónico
• Se utilizan ampliamente en las precolumnas
Partícula porosa
• Micro-particulas de sílice

DETECTORES
Responderán a una propiedad de la fase móvil
Características deseadas
• Sensibilidad adecuada
• Estabilidad y reproducibilidad buenas
• Respuesta lineal extendida a varios órdenes de magnitud
• Tiempo de respuesta corto
• Respuesta rápida e independiente del caudal
• Manejo sencillo
• Respuesta selectiva a algunos analitos
Tipos de detectores
• Detector de absorbancia
• Detector de fluorescencia
• Detector de índice de refracción
• Detector de dispersión de luz
• Detector electroquímico
• Detector por espectroscopia de masas
DETECTORES DE ABSORBANCIA (UV-VIS)
Celda de flujo en forma de Z Para minimizar el ensanchamiento de banda extra-columna,
el volumen de las cubetas debe ser lo menor posible de 1 a 10 micrómetros
Espectro de absorción de un efluente que contiene una mezcla de tres esteroides tomado
a intervalos de 5 segundos mediante un detector de series de diodos. (Paedes 2022)

DETECTORES DE ÍNDICE DE REFRACCIÓN

El disolvente pasa a través de la mitad de una celda y el efluente de la columna pasa por
la otra mitad.
Características
• Los dos compartimentos están separados por una placa de vidrio montada a un
• ángulo tal que si las dos disoluciones diferen en índice de refracción se produce
una desviación del haz incidente.
• Responden a casi todos los solutos
• Son muy sensibles a la temperatura

SISTEMA PARA EL TRATAMIENTO DE DATOS

Es indispensable para registrar los cambios en alguna propiedad en función del tiempo.
La representación gráfica de estos registros se llama cromatograma.
En estos registros aparece una serie de picos simétricos sobre el eje de los tiempos para
la identificación cuantitativa (área bajo los picos) y cualitativa (posición en el eje) de los
componentes de una muestra. (MC Antonio Camacho, 2017)
 Prepare 50 mL de cuatro
2. Preparación de los estándares de calibración de
INICIO 1. Preparación del estándar madre
estándares de calibración de
de Benceno y Tolueno 100, 200, 400 y 800 mg/L a
Benceno y Tolueno
partir del estándar madre de
Pese y mezcle 0,1 gramos de Benceno y Benceno y Tolueno.
0,1 gr de Tolueno .

Afore con acetona.

Verifique en la
Afore con acetona.Tape el matraz
central de gases que
la presión de salida
Agregue 0,25
de gases
Abra la llave de paso de los y 0,5 mL
gases (nitrógeno, aire e 4.Manejo del equipo 3.Preparación de la muestra
Verifique en el problema respectivame
hidrógeno) de la central de cromatógrafo de gases
puesto de nte de la
gases.
trabajo solución
estándar
madre de
Benceno y
Tolueno en un
matraz
Acondicione la columna aforado de
Conecte el cromatográfica por una hora a una Espere a que el equipo alcance
equipo y sus Encienda la llama del temperatura menor en 20 °C de la las condiciones de trabajo 500 mL que
detector FID para lo cual la programadas y propafe el inicio
componente
temperatura.
máxima temperatura de trabajo
del sofwar del sistema FIN
contiene la
muestra de
s a una Programe las condiciones de
Abra el software Totalchrom trabajo para el método desde el 5. Anote y registre la lectura de agua hasta la
fuente de
del computador software. acetona. los estandares y de la muestra
110 V mitad.
EQUIPO

CROMATÓGRAFO DE GASES CON DETECTOR FID

En cromatografía de gases, el detector de ionización

de llama (FID) es uno de los detectores más
extensamente utilizado y, por lo general, uno de los
más aplicables. En un quemador, el efluente de la
columna se mezcla con hidrógeno y con aire para
luego encenderse eléctricamente.

La mayoría de los compuestos orgánicos, cuando se

pirolizan a la temperatura de una llama de
hidrógeno/aire, producen iones y electrones que pueden conducir la electricidad a través
de la llama. Entre el extremo del quemador y un electrodo colector situado por encima de
la llama, se aplica una diferencia de potencial de unos pocos cientos de voltios, y para la
medición de la corriente que resulta (de unos 10-12A) se utiliza un amplificador
operacional de alta impedancia.

La ionización en la llama de los compuestos que

contienen carbono no es un proceso bien
establecido, aunque se observa que el número
de iones que se produce es aproximadamente
igual al de átomos de carbono transformados en
la llama.

El detector de ionización de llama debido

a que es un detector que responde al
número de átomos de carbono que entra
en el detector por unidad de tiempo, es un
detector sensible a la masa, más que un
sistema sensible a la concentración.

En consecuencia, tiene la ventaja de que los cambios en el caudal de la fase móvil tienen
poco efecto sobre la respuesta del detector.
 • Grupos funcionales, tales como carbonilo, alcohol, halógeno y amina, originan
en la llama pocos iones o prácticamente ninguno.
• Además, el detector es insensible a los gases no combustibles como H2O, CO2,
SO2, y NOx. Esas propiedades hacen del detector de ionización de llama uno de
los detectores generales más utilizado para el análisis de la mayoría de
compuestos orgánicos, incluyendo aquellos que están contaminados con agua y
con óxidos de nitrógeno y de azufre.
• El detector de ionización de llama posee una elevada sensibilidad (del orden de
10-13 g/s), un gran intervalo lineal de respuesta (de 107), y un bajo ruido.
Por lo general, es resistente y fácil de utilizar. Una desventaja del detector de ionización
de llama es que se trata de un detector destructivo de la muestra. (Sanchez & Noriega,
2017)

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