DETERMINACIN DE HEMOGLOBINA GLICOSILADA 1.

FUNDAMENTO DE LA PRUEBA La Hemoglobina Glicosilada es conocida tambin como Hemoglobina A1c, HbA1c, Glicohemoglobina o Hemoglobina glicada. En el laboratorio de anlisis clnicos se realiza la determinacin de hemoglobina glicosilada para el seguimiento de los pacientes afectados de diabetes y como ayuda en la toma de decisiones durante el tratamiento. La hemoglobina es una protena que se encuentra en los glbulos rojos de la sangre (hemates) y sirve para aprovisionar de oxgeno al resto de nuestras clulas y tejidos. Existen varios tipos de hemoglobina en adultos, la Hb A, que constituye el 97% del total, la Hb A2, ( un 2,5%) y la hemoglobina fetal, la Hb F, que constituye el 0,5% del total. Una parte de la Hemoglobina A se une a la glucosa que circula por el torrente sanguneo. El porcentaje de esta hemoglobina A unida a glucosa es lo que se denomina hemoglobina glicosilada. Esto sucede tambin en las personas sin diabetes. Glucosa en sangre + Protenas (hemoglobina) Protenas glicadas (hemoglobina glicada o glicosilada) La hemoglobina glicosilada tiene varias fracciones (Hb A1a, Hb A1b y Hb A1c) y, de ellas, la ms estable, la que tiene una unin con la glucosa ms especfica, es la fraccin HbA1C. Los valores normales de hemoglobina glicosilada en un adulto sano oscilan entre 3 y 6%. Cuanto mayor es la cantidad de glucosa en sangre ms se une a las protenas y su porcentaje de unin indica cual ha sido la cantidad media de glucosa circulante durante el tiempo de vida de la protena en cuestin. La HbA1c no se ve alterada por cambios agudos o recientes de las glucemias y depende de la concentracin de glucosa del entorno y de la vida media de los glbulos rojos en el organismo. Como la vida media de estos hemates es aproximadamente de 90-120 das, conocer como estn marcados por la glucosa que circula junto con ellos nos indica como ha sido el control metablico durante ese periodo de tiempo.
1

En conclusin, la prueba determina el promedio de glucosa en sangre de los ltimos 2-3 meses.

2. OBJETIVO El objetivo de esta determinacin es conseguir que, en estos pacientes diabticos, las concentraciones de glucosa se mantengan dentro de los lmites de referencia, siempre que sea posible. De esta forma se consigue minimizar las complicaciones causadas por las concentraciones de glucosa elevadas como, por ejemplo la lesin progresiva en distintos rganos como los riones, los ojos, el sistema cardiovascular y el sistema nervioso. La determinacin de hemoglobina glicosilada es una forma de representar las concentraciones de glucosa en los ltimos meses. Se permite as al paciente y a su mdico conocer si el control de la diabetes es satisfactorio. Esta prueba es frecuentemente solicitada en el momento del diagnstico de la diabetes, para conocer el desajuste de las concentraciones de glucosa. Adems, debe practicarse de forma regular para as conocer si las concentraciones de glucosa se encuentran bajo control. Suele ser solicitada entre 2 y 4 veces al ao.

3. MTODOS DE DETERMINACIN DE HbA1c Existen diversos mtodos para determinar las hemoglobinas glicosiladas:
-

Electroforesis, Cromatografia de intercambio inico, Inmunoensayo, Cromatografia de afinidad.

El mtodo de referencia propuesto en EEUU por el Programa Nacional para la Estandarizacin de la Hemoglobina Glicosilada (NGSP) es el de cromatografa lquida de alta resolucin (HPLC), basada en una cromatografa de intercambio catinico. Este mtodo permite la separacin y determinacin del porcentaje relativo de hemoglobinas normales y anormales.

4. DETERMINACIN DE HbA1c MEDIANTE HPLC Entendemos por cromatografa aquellas "tcnicas de separacin de solutos disueltos en disolventes basadas en las diferentes afinidades que muestran dichas sustancias por dos fases distintas denominadas mvil y estacionaria". Dicho de otra forma, la cromatografa es una tcnica de separacin que se
2

fundamenta en la distinta distribucin de las sustancias estudiadas en dos fases, una mvil y otra estacionaria. Al aplicar una tcnica cromatogrfica sobre una mezcla de sustancias cualquiera, la fase mvil "empuja" dicha mezcla a travs de la fase estacionaria de tal forma que aquellos componentes que tengan ms afinidad por la fase estacionaria, se "retrasarn" en su avance a travs de esta, mientras que los componentes con poca afinidad por la fase estacionaria la atravesarn rpidamente. De esta manera, cada uno de los componentes progresa a lo largo de la fase estacionaria con una velocidad distinta. Como consecuencia, una vez que la fase mvil ha atravesado a la fase estacionaria, los componentes de la muestra han quedado separados unos de otros en una serie de bandas.) Segn el mecanismo fsico que lleva a cabo la separacin de los solutos entre las dos fases (mvil y estacionaria), existen diversas clases de cromatografa, una de ellas es la cromatografa de intercambio inico. La cromatografa de intercambio inico se realiza en columnas dentro de las cuales va empaquetada la fase estacionaria (resinas de intercambio inico). El fundamento de la separacin de solutos es de tipo electrosttico (interacciones electrostticas que se producen entre los grupos ionizados de las sustancias a separar y los grupos ionizados unidos a la resina de intercambio inico; dichas interacciones permiten la sustitucin de unos por otros). Efectivamente, cuando se produce el paso de la fase mvil (arrastrando la muestra a separar) a travs de la fase estacionaria, los iones de la muestra compiten con los de la fase estacionaria por ciertos lugares de fijacin, de manera que acaban desplazndolos; aquellos que tienen mayor fuerza de unin son ms retenidos y tardarn ms tiempo en atravesar la columna. Las resinas de intercambio inico pueden ser catinicas (que intercambian iones de la muestra con carga positiva cationes) y aninicas (que intercambian iones de la muestra con carga negativa aniones). La cromatografa lquida de alta resolucin usada para determinar HbA1c es en definitiva una cromatografa de intercambio catinico en columna a la cual se aplica una sobrepresin que permite acelerar el proceso de separacin. Su gran ventaja es la disminucin del tiempo de anlisis. El mtodo de intercambio inico en microcolumnas separa las variantes de hemoglobina por la carga elctrica. La resina de intercambio catinico (cargada negativamente) atrae a la hemoglobina cargada positivamente. El tampn utilizado para elur tiene un pH y fuerza inica seleccionado de forma que las hemoglobinas glicadas se cargan menos positivamente que la HbA y
3

por lo tanto al no unirse fuertemente a la resina, eluye primero. En esencia, la fase mvil lquida (constituida por un disolvente adecuado que vehicula a la muestra) se bombea a travs de un sistema de separacin compuesto por un prefiltro y una columna, esta ltima conteniendo la fase estacionaria, a una elevada presin. Por su distinta interaccin entre las dos fases, la muestra es retenida con variable intensidad, eluyendo separada de la columna. Caber resear que para el anlisis de hemoglobinas, la muestra (sangre total-EDTA) deber ser hemolizada previamente. Adems, el empleo de varios eluyentes permite la separacin de las distintas fracciones de hemoglobina. Los distintos tipos de hemoglobina que se pueden separar son: -

Hemoglobina glicosilada (HbA1c) Hemoglobina fetal (HbF) Hemoglobina A2 (HbA2) Hemoglobinas anormales S y C (HbS y HbC)

5. BIO RAD D-10 El equipo de HPLC utilizado en este laboratorio se denomina BIO RAD D-10 (DUAL PROGRAM). El Bio-Rad D-10 Dual Program ha sido diseado para uso exclusivamente profesional. Para uso en diagnstico in vitro. Consta de dos programas: Programa corto: El Bio-Rad D-10 Dual Program ha sido diseado para la determinacin porcentual de los niveles de hemoglobina A1c en sangre humana utilizando la cromatografa lquida de alta resolucin por intercambio inico (HPLC). Programa ampliado: El Bio-Rad D-10 Dual Program ha sido diseado para la determinacin porcentual de los niveles de hemoglobina A2, F y A1c, as como para la deteccin de variantes anormales de hemoglobinas en sangre humana utilizando la cromatografa lquida de alta resolucin por intercambio inico (HPLC).
4

6. INTERPRETACIN DE RESULTADOS La hemoglobina glicosilada refleja la concentracin de glucosa en los ltimos 120 das (tiempo de vida de los glbulos rojos). El porcentaje de HbA1c se aumenta en proporcin a las cifras de glucemia que han precedido en las ltimas 6-8 semanas. En general, por cada 1% de aumento en la HbA1c evidencia un incremento en los promedios de glucemia de aproximadamente 30 mg/dl. Una HbA1c de 6% refleja un promedio de glucemia de 120 mg/dl.

Es deseable que las personas con diabetes mantengan un promedio de HbA1c inferior a 7%. ------------------------------------------------------------------------------Trabajo realizado por:
-

Luis Medina Quesada Inmaculada Rodrguez Rueda