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UNIVERSIDAD AUTNOMA DE CIUDAD JUREZ

INSTITUTO DE CIENCIAS BIOMDICAS

BIOQUMICA GENERAL

Mdico cirujano (PLAN 2014).

Mayra Anglica Galvn Garca 144289

PRCTICA # 4

CINTICA ENZIMTICA 1: EFECTO DE LA CONCENTRACIN DEL


SUSTRATO SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA

Laboratorio Jueves 7-9 am

PRCTICA # 4
CINTICA ENZIMTICA 1: EFECTO DE LA CONCENTRACIN DEL
SUSTRATO
SOBRE LA ACTIVIDAD ENZIMTICA

OBJETIVOS:
El alumno observar el comportamiento de la actividad enzimtica de acuerdo a
los parmetros de concentracin tanto del sustrato determinando los valores de:
a) Vmax (velocidad mxima de la reaccin).
b) 1/2 Vmax
c) Km (constante de Michaelis).
d) [S] ptima (concentracin ptima de sustrato).
PRERREQUISITOS:
1. Describir el mecanismo de accin de las enzimas en las reacciones
qumicas.
las enzimas son catalizadores biolgicos que modifican la energa
necesaria para que se inicie una reaccin;
la presencia de enzimas en las clulas permite que las reacciones qumicas
progresen a gran velocidad y a temperaturas relativamente bajas;
entre los factores que influyen en el comportamiento de las enzimas se
encuentran la temperatura y el pH;
las enzimas participan en procesos de degradacin o de sntesis. En todos
los casos forman temporalmente parte de la reaccin. Luego de la reaccin,
la enzima se recupera inalterada.
Agregan cargas a los sustratos: las cadenas laterales (R) de los
aminocidos de las enzimas pueden participar directamente haciendo a los
sustratos
qumicamente
ms
reactivos.
Inducen la deformacin en el sustrato: cuando una sustancia se une al
sitio activo, la enzima puede causar que los los enlaces se estiren,
ponindolo
en
un
estado
de
transicin
inestable.
Cambio de forma de la enzima al unirse al sustrato: el modelo de llavecerradura de Fisher fue actualizado cuando se descubri que las enzimas
son flexibles y sus sitios activos pueden cambiar (expandirse) para

acomodarse a sus sustratos. Este cambio de forma causado por la unin al


sustrato se denomina ajuste inducido.
2. Cul es la relacin que existe entre la velocidad de una reaccin catalizada
y
la
concentracin
de
enzima.
En una reaccin de orden cero, la velocidad de formacin del producto es
independiente de la concentracin de sustrato: v = k
En una reaccin de primer orden la velocidad de formacin de los productos es
directamente proporcional a la concentracin del sustrato: v = k [A].
Una reaccin de segundo orden es aquella en la que la velocidad de formacin del
producto depende
de la concentracin de dos sustratos (como en una reaccin de condensacin): v
= k [A1] [A2]
del cuadrado de la concentracin de un nico sustrato (reaccin de dimerizacin):
v = k [A]2
3. Definir la relacin entre la concentracin de sustrato y la velocidad de la
reaccin enzimtica.
En cualquier momento en una reaccin catalizada por una enzima, la enzima
existe en dos formas, la forma libre o sin combinar E y la forma combinada ES.
A baja [S], la mayor parte de la enzima estar en la forma sin combinar E.
Aqu la velocidad ser proporcional a [S] porque el equilibrio se desplaza hacia la
formacin de ms ES a medida que [S] aumenta. La mxima velocidad inicial de
la reaccin catalizada (V max) se observar cuando todo la enzima est
prcticamente en forma de complejo ES y la concentracin de E sea
extremadamente pequea.
En estas condiciones, la enzima est "saturada" con su sustrato de modo que el
aumento adicional de [S] no tendr efecto sobre la velocidad. Esta condicin se
producir cuando [S] sea suficientemente alta de modo que prcticamente todo la
enzima libre se haya convertido en la forma ES. Cuando el complejo ES se
descompone dando el producto P, la enzima queda libre para catalizar la reaccin
de otra molcula de sustrato. El efecto de saturacin es una caracterstica
distintiva de la catlisis enzimtica Cuando la enzima se mezcla con un gran
exceso de sustrato, existe un perodo inicial denominado estado preestacionario,
durante el cual aumenta la concentracin del complejo ES.
Al seguir la velocidad de aparicin de producto (o de desaparicin del sustrato) en
funcin del tiempo se obtiene la llamada curva de avance de la reaccin, o
simplemente, la cintica de la reaccin. A medida que la reaccin transcurre, la
velocidad de acumulacin del producto va disminuyendo porque se va
consumiendo
el
sustrato
de
la
reaccin

La velocidad de accin de un enzima tambin se puede ver afectada por la


presencia de inhibidores

4. Interpretar la cintica de Michaelis-Menten y la de Lineweaver-Burk.


5.
En bioqumica, el diagrama de Lineweaver-Burk se emplea como herramienta
grfica para calcular los parmetros cinticos de una enzima.
Su utilidad consiste en que el recproco de la cintica de Michaelis-Menten es
fcilmente representable y que de l emanan mucha informacin de inters.
Para explicar la relacin oservada entre la velocidad inicial (v0) y la concentracin
inicial
de
sustrato
([S]0) Michaelis y Menten propusieron
que
las
reacciones catalizadas enzimticamente ocurren en dos etapas: En la primera
etapa se forma el complejo enzima-sustrato y en la segunda, el complejo enzimasustrato da lugar a la formacin del producto, liberando el enzima libre.
Este modelo cintico adopta la hiptesis del estado estacionario, segn la cual la
concentracin del complejo enzima-sustrato es pequea y constante a lo largo de la reaccin
(Figura de la derecha). Por tanto, la velocidad de formacin del complejo enzima-sustrato (v 1)
es igual a la de su disociacin (v2+ v3):
v1 = v2 + v3 Adems, como [ES] es constante, la velocidad de formacin de los productos es
constante:
v = v3 = k3 [ES] = constante.
Como v1=v2+v3, podemos decir que:
k1[S] [ET] - k1 [S] [ES] = k2 [ES] + k3 [ES]

Despejando [ES], queda que:


, siendo
, en donde la
expresin (k2+k3)/k1 se ha sustitudo por KM, o constante de Michaelis-Menten. Este enlace nos
aporta una explicacin sobre las razones que hacen de la KM un parmetro cintico importante.
Por lo tanto, en el estado estacionario, la velocidad de formacin del producto es:
v =
k3 [ES] =

v3 =

Lineweaver-Burk: Cuando se grafica la velocidad de la reaccin, v 0, contra la


concentracin de substrato, S, no siempre es posible determinar la condicin
en que se ha llegado a la velocidad mxima, Vmax, debido al incremento de la
pendiente en la hiprbola a concentraciones de substrato elevadas.
Se presentan los valores experimentales y los resultados del ajuste al modelo
de Michaelis.
Aun as, si se grafica una doble recproca, es decir, el inverso de la velocidad (1/v 0)
contra el inverso de la concentracin de substrato (1/ S ), se obtiene una lnea

recta. El regrficode Lineweaver-Burke, tambin se denomina de dobles


recprocas y se utiliza para calcular la Km y la Vmax as como para determinar el
mecanismo de accin de los diversos tipos de inhibidores.
La ecuacin que describe a la grfca de Lineweaver-Burke es:

INTRODUCCIN:
El cambio de concentracin, ya sea de reactante o producto, por unidad de tiempo
se conoce como velocidad de reaccin. El estudio de la cuantificacin de estas
velocidades de reaccin bioqumicas se conoce como cintica enzimtica, el cual,
es el mtodo principal para medir como la velocidad cambia en parmetros
experimentales. Este estudio tambin tiene como finalidad cuantificar la afinidad
de enzimas, sustratos e inhibidores dando como resultado los mecanismos de
reaccin. La cintica enzimtica tiene diversas aplicaciones, como por ejemplo,
conocer como las fuerzas regulan las rutas metablicas y como debe ser su
funcionamiento adecuado. Los factores que afectan la actividad de las enzimas
son: concentracin de enzima, concentracin de sustrato, pH y temperatura. 1
La cintica enzimtica da informacin directa sobre el mecanismo de la
especificidad enzimtica y la reaccin de catlisis. En la mayora de los casos no
se necesita aislar o purificar la enzima para medir la velocidad de reaccin. Para
que pueda haber una correcta cuantificacin debe de haber condiciones ptimas
de temperatura, pH, presencia de cofactores, concentracin de sustrato, enzima,
etc. Y se utilizan las concentraciones saturantes de sustrato. Si estas condiciones
se cumplen la velocidad de reaccin ser mxima (V max).
Al seguir la velocidad de desaparicin del sustrato, despus de tiempo, se obtiene
la curva de avance de la reaccin. Mientras ocurre la reaccin va disminuyendo la
velocidad de acumulacin de producto debido a que el sustrato de la reaccin se
va consumiendo. Antes de que se consume el 10% de sustrato, la cuantificacin
o medida de velocidad inicial se realiza. Esto para que el sustrato se pueda
considerar constante durante el experimento. En este caso no ser necesaria la
reaccin inversa. Ya que esta apenas ocurre por la pequea cantidad formada de
producto
es
demasiado
pequea.
2
La concentracin de sustrato es uno de los factores ms importantes que afectan
la velocidad de una reaccin. El sustrato cambia durante la reaccin, en lo que se
convierte en producto, lo que provoca que se complique el estudio experimental.
Uno de los pasos de la cintica enzimtica es medir la velocidad inicial V 0 cuando
el sustrato tiene mayor concentracin que la enzima. En 1903 y gracias a un
patrn cintico, Victor Henri propuso que para la catlisis enzimtica es
necesario combinar una enzima con su molcula de sustrato. Aos ms tarde
Leonor Michaelis y Maud Menten crearon la teora general de accin enzimtica.
Esta teora hablaba acerca de que primeramente la enzima se combina con su

sustrato de forma reversible, formando as un complejo enzima- sustrato en un


paso reversible rpido. 3
En general, en el estudio de la cintica enzimtica se mide la accin de la
concentracin inicial de sustrato sobre la velocidad de reaccin, esto teniendo
siempre la cantidad de enzima constante.
MATERIAL:
Tubos de ensaye
Vasos de precipitado
Gradillas
Pipetas
Propipetas
Celdas de espectrofotmetro
EQUIPO:
Espectrofotmetro de luz visible
Platina caliente
REACTIVOS:
Solucin de Invertasa 0.001%
Buffer de fosfatos pH 4.7
Sacarosa 0.02M, 0.03M, 0.05M, 0.1M, 0.3M y 0.5M
Solucin de 3,5 Dinitrosalicilato
PROCEDIMIENTO:
La invertasa es una enzima hidroltica que acta sobre sacarosa (un disacrido)
liberando glucosa y fructosa. La actividad de la enzima se detiene al aadir una
solucin alcalina y el poder reductor de los productos se mide hacindolos
reaccionar con el reactivo de 3,5-dinitrosalicilato.
Preparar una serie de tubos como se muestra en la siguiente tabla:
Tubo

Invertasa

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

1.0

Amortiguador

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

0.5

Sacarosa 0.02
1.0
M

Sacarosa 0.03
0
M

1.0

Sacarosa 0.05 0

1.0

M
Sacarosa 0.10
0
M

1.0

Sacarosa 0.30
0
M

1.0

Sacarosa 0.5M

1.0

Agua destilada

1.0

Mezclar e incubar a 35 C durante 20 min, sacar los tubos y agregarles 1 ml de


Dinitrosalicilato. Mezclar y calentar en bao de agua a ebullicin hasta que
cambien de color. Enfriar y leer a 540 nm ajustando a cero con el tubo No. 7

RESULTADOS:
1.- Graficar los valores de As vs. [S]
2.- Graficar los valores de 1/As vs. 1/[S]
3.- Determinar los valores de:
Grfica de M - M
Vmx
Km
Vmx
[S] ptimo

DISCUSIN:

Grfica de L - B

La km nos dice la afinidad que tiene una enzima por su sustrato (es inversamente
proporcional). La velocidad mxima cuantifica los centros activos de la enzima;
gracias a la Vmax podemos saber la velocidad de la enzima cuando se encuentra
unida al sustrato. 4
La funcin de la sacarasa o invertasa es una enzima que se encarga convertir a la
sacarosa en fructosa y glusosa. Se suele usar como agente de reblandecimiento
de alimentos con azcar que tienen tendencia a evaporar el agua y cristalizar la
sacarosa, esto afecta su consistencia y aspecto. Tambin tiene funcin
humectante. El pH ptimo para el correcto funcionamiento de la invertasa es de
4,5 a 5,0. La temperatura debe estar entre 25 y 55C y no se le deben de agregar
productos con 65C o con ms de 20% de alcohol. 5
El dinitrosalicilato (DNS) es un reactivo que fue introducido por Summer en 1921
para la determinacin de sustancias reductoras en sangre y orina. Es un mtodo
para cuantificar azcares reductores. Slido amarillo; qumicamente se trata de un
anillo bencnico tetrasubstituido por dos grupos nitro, un hidroxilo y un carboxilo.
Se utiliza en laboratorios de anlisis clnicos como reactivo de identificacin de
azcares reductores. 6
Azcares reductores son aquellos azcares que poseen que poseen su grupo
carbonilo (grupo funcional) intacto, y que a travs del mismo pueden reaccionar
como reductores con otras molculas ya que al menos tienen un -OH
hemiacetlico libre. Es un azcar que tiene un grupo aldehdo o un grupo hidroxicetona.7 Los tubos donde la concentracin de azcar reductor, en este caso
la sacarosa, eran ms altos, el color de la sustancia era ms oscuro.
CONCLUSIN:
Es importante saber cuantificar la velocidad de reacciones catalizadas por
enzimas. Como en cada reaccin se usa diferente sustrato o enzima en diferentes
condiciones (ph, temperatura, cantidad, etc.) pueden obtenerse diferentes
resultados, para eso se crean las grficas, as se puede saber qu es lo que
continuar pasando con esa reaccin.
La catlisis de las enzimas comienza formndose el complejo enzima-sustrato,
despus, este libera el producto y se transforma en la enzima.
La velocidad de reaccin = la velocidad de formacin del producto
La velocidad mxima (Vmax) se obtiene cuando el enzima est saturada por el S.
Si introducimos el parmetro Vmax en la ecuacin general de la velocidad
obtenemos la expresin ms conocida de la ecuacin de Michaelis-Menten. La
representacin grfica de la ecuacin de Michaelis-Menten (v frente a [S]) es una
hiprbola

KM es la concentracin de sustrato para la cual la velocidad de reaccin es la


mitad de la velocidad mxima.
Para determinar grficamente los valores de K M y Vmax es ms sencillo utilizar la
representacin doble recproca, ya que es una lnea recta. Esta representacin
doble recproca recibe el nombre de representacin de Lineweaver-Burk.

CUESTIONARIO:
1.- La velocidad inicial de una reaccin enzimtica es dependiente exclusivamente
de la cantidad de sustrato presente, si, no, por qu? S, aumenta la
concentracin de sustrato la velocidad no aumenta linealmente, aparece un efecto
de saturaci. La velocidad depende de la cantidad de enzima con sustrato
suficiente.
2.- Cul es la diferencia entre los cambios de energa libre que existen entre un
proceso catalizado por una enzima y el mismo proceso no catalizado.?
El mximo de energa representa el estado de transicin en el cual se forma el
intermediario rico en energa durante la conversin de los reactivos en los
productos. Debido a la gran energa de activacin que separa a los reactivos de
los productos, a menudo la misma reaccin es ms lenta si no es catalizada, que
si la cataliza una enzima.
3.- Por qu a concentraciones de sustrato mucho mayores que el valor de la Km
la velocidad de la reaccin es independiente de la concentracin de sustrato?
El valor de KM da idea de la afinidad del enzima por el sustrato: A menor KM,
mayor afinidad del enzima por el sustrato, y a mayor KM, menor afinidad.
KM es la concentracin de sustrato para la cual la velocidad de reaccin es la
mitad de la velocidad mxima. En efecto, si KM = [S], la ecuacin de MichaelisMenten se reduce a: v = Vmax/2.

4.- La Km de una enzima vara con la concentracin de enzima, si, no, por qu?
No. porque es independiente de concentracin, la afinidad depende del
comportamiento del sustrato con la enzima. La Km nos da una idea la afinidad que
tiene el enzima por su sustrato, cuanto mayor es Km menor es la afinidad
(predominan las formas E y S libres), cuanto menor es Km mayor es la afinidad
(predomina la forma ES).
Bibliografa

1. Mckee, T. & Mckee J. (2003). BIOQuMICA: LA BASE MOLECULAR DE LA


VIDA
.
Espaa:
MeGRAW-HILL.
2. http://www.ehu.eus/biomoleculas/enzimas/enz3.htm
3. Lehninger,

A..

(2005).

Principios

de

bioqumica.

Espaa:

Omega

4. http://www.biorom.uma.es/contenido/UIB/Jmoldesarrollo/enzimas/enzima5.h
tml
5. http://mazinger.sisib.uchile.cl/repositorio/lb/ciencias_quimicas_y_farmaceuti
cas/schmidth02/parte07/02.html
6.

http://www.cosmos.com.mx/wiki/fh4w/Acido-35-dinitrosalicilico

7.

http://es.slideshare.net/nataliamontenegro104/azucares-reductores-y-noreductores