UNIVERSIDAD AUTÓNOMA

METROPOLITANA
UNIDAD XOCHIMILCO

Tronco Divisional de Ciencias Biológicas y de la Salud

Los Fármacos como Modificadores de las Funciones Biológicas

SIMULACIÓN IN SILICO DEL NERVIO FRÉNICO/HEMIDIAFRAGMA

SOBRE LOS EFECTOS FARMACOLÓGICOS DE FÁRMACOS
AGONISTAS Y ANTAGONISTAS

Presentado por
Cárcamo Hernández Lesly del Carmen
Carrillo Sosa Dylan Caleb
Castro Moro Valeria Yarentzi
García Aguilar Kevin Eduardo
Segura Córdova José Luis
Silva Nava Rogelio Andrés

Asesores
Dr. Luis Alfonso Moreno Rocha

Ciudad de México, México Trimestre 21-p 24/09/2021

 INDICE
INTRODUCCIÓN…………………………………………………………………………..………………………………3
CAPITULO PRIMERO - Marco Teórico

1. ESTIMULACIÓN MUSCULAR
A. POR FIBRA MUSCULAR……………………………………………………………………………………….....4
B. POR NERVIO FRÉNICO………………………………............................................................................4
2. CÁMARA DE ORGANO AISLADO……………………………………………………………………………………….…5
3. FÁRMACOS DE EFECTO ESTIMULANTE NEUROMUSCULAR

A. TUBOCURARINA…………………………………………………………………………………………….……………6

B. NEOSTIGMINA……………………………………………………………………………………….…………….……...7

C. 4-AMINOPIRIDINA……………………………………………………………………………………….…….………..8

D. ATROPINA……………………………………………………………………………..……………………………………9

E. SUXAMETONIO………………………………………………………………………………………………….……….10

F. TETRODOTOXINA…………………………………………………………………………………………….………..10

CAPITULO SEGUNDO - Marco metodológico

A. OBJETIVOS………………………………………………………………………………………………….…………….…..….12
B. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL……………………………………………………………………….….……….12
..
CAPITULO TERCERO - Análisis e interpretación de resultados
1. RESULTADOS…………………………..……………………………………………………………………….….…..16

2. CONCLUSIONES………………………………………………………………………………………….………….27

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

2
 INTRODUCCIÓN

El nervio frénico es un nervio periférico que se forma por la fusión de las ramas
posteriores de las raíces cervicales C3, C4 y C5; cruza el musculo escaleno anterior y entra
en la caja torácica por delante de la vena subclavia, se extiende por el mediastino,
dividiéndose en las ramas pericardias pasando adyacente a la pleura mediastínica y el
pericardio, y continua hacia el diafragma que es el principal musculo de la respiración donde
constituye su única inervación motora, sensitiva y simpática (Flores et al.,2012). El
contingente de fibras simpáticas contribuye a la acción trófica y al tono del músculo
diafragmático, mientras que las ramas terminales frénico-abdominales sensitivas, dan
cobertura a una amplia área de distribución que abarca la porción apical de la pleura
mediastínica y costal, la porción superior del pericardio y las serosas del hígado, vesícula
biliar y páncreas (Orlando y Rodríguez, 2007).

Para causar una contracción muscular de una fibra, se debe alcanzar un nivel de
disparo del potencial de placa producido por la unión de la ACh a los receptores de la
membrana. La ACh anteriormente fue liberada de la terminación nerviosa por medio de un
potencial de acción (Diaz, 1993).

Para registrar una fuerza de contracción que causan algunos agentes bloqueadores
e inversores musculares o que afectan la transmisión neuromuscular se puede llevar a cabo
una preparación in vitro del nervio frénico/hemidiafragma de rata donde se unen a un
soporte, electrodos y un transductor de tensión que ayuda a registrar la contracción que se
presenta cuando se le aplican fármacos.

También es posible el estudio de la farmacología del musculo utilizando una

preparación in silico del nervio frénico/hemidiafragma de rata. Esto se puede llevar a cabo
por medio del programa Virtual Twitch V.2.2.1. El programa da la posibilidad de simular las
contracciones tanto en nervio como en musculo del nervio frénico/hemidiafragma y de
inyectar seis diferentes fármacos a distintas concentraciones en el baño, así como iones y
aplicación de lavados con soluciones de Krebs.

La tubocurarina es un antagonista competitivo de los receptores nicotínicos, la

neostigmina es un anticolinesterásicos, la 4-aminopiridina bloquea los canales de potasio,
La atropina es antagonista de los receptores muscarínicos, el suxametonio se acopla a los
receptores nicotínicos y finalmente la tetrodotoxina bloquea los canales de sodio.

3
 CAPITULO PRIMERO
Marco Teórico

1. ESTIMULACIÓN MUSCULAR
A. POR FIBRA MUSCULAR

Los músculos están formados de muchos elementos contráctiles, uno de ellas

son las fibras musculares, las cuales se localizan en el interior del músculo, las cuales
a su vez están compuestas de sarcolema, mitocondria, miofibrillas, núcleo y retículo
sarcoplasmático.

• Sarcolema: recibe el impulso que activa la contracción del músculo.

• Mitocondrias: son las estructuras que contienen el ATP.
• Miofibrillas: en la encargada de darle la característica elástica y está formada
de actina y miosina.
• Núcleo: contiene la información.

Cumplen la función de generar el proceso de la contracción, el cual solo puede

darse gracias a la presencia de las proteínas actina y miosina, que generan un
desplazamiento de sus cabezas, cuando hay presencia de ATP en el músculo y cuando
se ha recibido el impulso nervioso proveniente de la motoneurona. Fuente
especificada no válida.

B. POR NERVIO FRÉNICO

El nervio frénico es un nervio periférico que desciende entre el plexo cervical

con localización medial, atraviesa el cuello y tórax, pasa adyacente a la pleura
mediastínica y el pericardio, hasta alcanzar el músculo diafragma, constituyendo su
única inervación motora, sensitiva y simpática. Este nervio inerva el diafragma. En el
cuerpo humano existen dos nervios frénicos, izquierdo y derecho, y la lesión en alguno
de ellos puede causar problemas de salud graves.

El diafragma es un tejido musculo tendinoso que separa la cavidad torácica de

la cavidad abdominal y cuyo movimiento es el responsable de la respiración.

4
 Para mantener la respiración constante, el nervio frénico transmite señales de
forma constante sin el control consciente de la persona, sin embargo, es posible ejercer
algo de control sobre el diafragma, lo que nos permite, por ejemplo, dejar de respirar
en algunas situaciones.

Cada nervio frénico tiene su origen en el cerebro y de aquí van bajando, cada
uno a un lado del cordón principal de la médula espinal, encapsulados dentro de la
columna vertebral. A la altura de la tercera, cuarta o quinta vértebra, los nervios frénicos
abandonan la columna vertebral.Fuente especificada no válida.

Cada nervio frénico recoge información sensorial que es transmitida al cerebro.

Entre esta información sensorial podemos encontrar información sobre si el diafragma
se está contrayendo adecuadamente, sensación de dolor y sensación térmica del
diafragma y otros órganos de la cavidad torácica. Con esta información sensorial el
cerebro puede regular la función respiratoria adecuadamente y de forma automática.
Fuente especificada no válida.

2. CÁMARA DE ORGANO AISLADO

Se sacrifica una rata (de aproximadamente 0.5 kg de peso) con 100% de CO2
(un procedimiento rápido e indoloro). Se abre la caja torácica y se retira el nervio frénico
y la hemidiafragma de forma triangular y se coloca en un baño de órganos que contiene
solución de Krebs, se burbujea con O2 al 95% / CO2 al 5% y se mantiene a 32°C en un
baño de agua circundante. Como se muestra en el diagrama (Figura 1.), la base del
músculo está unida a un soporte y el tendón unido a un transductor de tensión. El nervio
se pasa por un electrodo de estimulación y otro electrodo se coloca directamente sobre
el músculo. Los fármacos se aplican directamente en el baño (Hoff and Geddes, 1971).
Cuando es necesario, los fármacos pueden ser eliminados por lavado con la nueva
solución Krebs.

Las pruebas in vitro de órgano aislado son aquellas en las que, mediante una
cámara de baño, se tiene un órgano o pedazo de tejido y se logra mantener la
contracción por un periodo de tiempo limitado.

Figura 1. Esquematización de la preparación del nervio

frénico/hemidiafragma de rata.
5
 La cámara de órgano aislado
(figura 2) es alimentada por una
solución de sales y nutrientes
(encontradas en el reservorio), las
cuales pasan por un serpentín el cual
calienta la solución de Krebs,
simulando la temperatura del
organismo del cual fue retirado para
así conseguir una temperatura
controlada. Puede permanecer
suspendido en el baño por varias
horas, mientras se burbujea gas
carbógeno (90-95% O2 +5-10% CO2).
Figura 2. Cámara de órgano aislado.

En el reservorio tenemos la solución Krebs; la cual contiene nutrientes como

glucosa, sales, minerales, soluciones buffer, etc. Esta permite que las células del tejido que
están fuera de su organismo continúen con su función, generando que esta no se vea
comprometida.

De igual modo el órgano aislado dentro de la cámara está conectado al transductor

y a un estimulador. El transductor permite que las contracciones sean cuantificadas y así
determinar la efectividad del fármaco; mientras que el estimulador permite que el órgano
continúe recibiendo los estímulos constantes requeridos para continuar con su
funcionamiento durante un periodo de tiempo.

3. FÁRMACOS DE EFECTO ESTIMULANTE NEUROMUSCULAR

A. TUBOCURARINA

A partir del “curare”, la tubocurarina es una sustancia extraída de una planta

y que es un antagonista competitivo del receptor de acetilcolina. Es considerado
una toxina que a bajas concentraciones sirve como relajante neuromuscular. Tiene
un tiempo de inicio de 4 a 6 minutos y una duración clínica de 80 a 120 min. Se
elimina por medio renal y tiene una depuración hepática.

6
 Carece de efectos centrales después de su administración por vía
intravenosa, debido a su incapacidad para atravesar la barrera hematoencefálica.
Es el mayor representante del grupo de bloqueadores no despolarizantes, que son
con mucho los más utilizados en terapéutica. Fuente especificada no válida.

Los relajantes no despolarizantes también antagonizan los conductos del

sodio presinápticos. Como resultados de esa acción, interfieren con la movilización
de acetilcolina en la terminación nerviosa y causan debilidad.

Existen dos isómeros de la tubocurarina, el isómero D es un agente de

bloqueo competitivo que antagoniza los efectos nicotínicos a nivel de la unión
neuromuscular del musculo esquelético, mientras que el isómero L-tubocurarina es
mucho menos potente que la D-tubocurarina, quizá porque este último posee dos
grupos hidrófilos localizado exclusivamente en una superficie.

La tubocurarina reduce la frecuencia de apertura del canal iónico acoplado al

receptor sin afectar otras propiedades, como la conductancia y el tiempo medio de apertura.
Esta acción se manifiesta como una disminución de la amplitud del potencial postsináptico
excitatorio que, si descendiese debajo de 70% de su valor inicial, es insuficiente para
generar el potencial de acción muscular, lo que explicaría la parálisis muscular que sigue a
la administración de tubocurarina y fármacos similares. El bloqueo neuromuscular causado
por dichos compuestos se revierte tras el aumento de acetilcolina en la placa motriz, ya sea
por la adición directa o indirecta de la administración de anticolinesterásicos. Fuente
especificada no válida.

Aunque la tubocurarina bloquea con eficacia la transmisión, predomina su acción

sobe las placas motoras terminales, aunque también en menos medida sobe los ganglios
autónomos

B. NEOSTIGMINA

La neostigmina (figura 3) fue introducida por primera vez en 1931 como estimulante
del tubo intestinal y más tarde como tratamiento sintomático de la miastenia gravis
(Palmer,1996). Está constituida por moléculas de amonio cuaternario, que produce
inhibición de la acetilcolinesterasa mediante la formación reversible de un complejo éster

7
carbamil en la porción de la parte activa de la colinesterasa y forman un enlace covalente
en sitios tanto aniónicos como esterásicos. (Abreud et al., 2014)
Actualmente, se usa en la
práctica anestesióloga por ser un
antagonista del bloqueo
neuromuscular no despolarizante
residual.

Figura 3. Estructura de la neostigmina.

La función de la acetilcolinesterasa (AChE) es una enzima perteneciente al grupo

de las colinesterasas esterasas de serina capaces de hidrolizar ésteres de colina, por lo
tanto hidroliza la acetilcolina (ACh) en colina y ácido acético regulando la concentración del
neurotransmisor en la sinapsis (Sánchez y Salceda, 2008).
La neostigmina es muy conocido por su acción como anticolinesterásico, que se une
reversiblemente a la AChE impidiendo la hidrolisis de la acetilcolina favoreciendo
fisiológicamente aumentando los niveles de ACh y su interacción con el receptor revirtiendo
el bloqueo muscular. Además, induce el bloqueo de los canales lentos de K+ en las
terminaciones nerviosas motoras incrementando la liberación de neurotransmisor. (Braga
et al., 1993)
A dosis bajas, la neostigmina entorpece la transmisión neuromuscular por la
despolarización transitoria de la placa terminar, mientras que a altas concentraciones
inducen desensibilización y bloqueo directo del canal del receptor de placa terminal,
induciendo potenciación paradójica del bloqueo neuromuscular. (Maselli y Leung, 1993)
La neostigmina tiene efectos muscarínicos cardiovasculares, que incluyen
bradicardia por disminución de la conducción en el nódulo AV, vasodilatación con
disminución de la resistencia vascular sistémica (RVS) e hipotensión arterial. (Cordero.
2013)

C. 4-AMINOPIRIDINA

La 4-aminopiridina es un miembro de una familia de derivados mono-amino y di-amino de

la piridina. Es un polvo no hidroscópico de color blanco a blanquecino, prácticamente
soluble en agua.

8
Es considerado un fármaco que bloquea los canales de K+ de tipo rectificador retardado
presentes en los linfocitos B murinos activados por lipopolisacáridos, utilizando registros de
parche-clamp de células enteras y de un solo canal. (Choquet, 1992)

Las simulaciones sugieren que 4-AP debe unirse tanto a un estado abierto como a
uno no conductor del canal. Se postula que este último es el canal inactivado o un sitio en
canales cerrados solo accesible al fármaco una vez que la célula ha sido despolarizada.
Utilizando grabaciones de parches dentro y afuera, encontramos que 4-AP solo bloquea los
canales del lado intracelular de la membrana y actúa reduciendo el tiempo medio de
explosión. 4-AP es una base débil (pK = 9) y, por tanto, existe en forma ionizada o no
ionizada. Dado que la Kd del bloqueo de canales depende tanto del pH interno como
externo, sugerimos que el 4-AP atraviese la membrana en su forma no ionizada y actúe
desde el interior de la célula en su forma ionizada. y por tanto existe en forma ionizada o no
ionizada. (Choquet, 1992)

D. ATROPINA

La atropina es un alcaloide con efecto antagonista competitiva de la acetilcolina que

es capaz de desencadenar todas las acciones parasimpaticolíticas, a través del bloqueo de
los receptores muscarínicos del parasimpático. Con dosis terapéuticas (1 mg de atropina)
y aún mayores, se bloquean todos los receptores muscarínicos. La estructura no polar de
la atropina permite su paso a través de la barrera hematoencefálica, desencadenando
algunas acciones a ese nivel. El antagonismo como es de tipo competitivo puede ser
superado si se incrementa la concentración de acetilcolina en los sitios receptores
(inhibición de la acetilcolinesterasa). La atropina no distingue los receptores muscarínicos
selectivos M1, M2 o M3, los bloquea a todos por igual. (Malgor, Valsecia, s.f)

Este compuesto tiene poca acción sobre los receptores nicotínicos del ganglio
autónomo y de la placa neuromuscular. Se requieren dosis más grandes que las
terapéuticas de atropina, para producir algún bloqueo de estos receptores nicotínicos.
Efectos un poco más evidentes sobre estos receptores se obtienen con análogos
cuaternarios de la atropina. (Malgor, Valsecia, s.f)

9
 E. SUXAMETONIO

El suxametonio también conocido como succinilcolina, es un fármaco relajante

despolarizante bloqueador neuromuscular, el cual cuenta con dos moléculas de acetilcolina
unidas y es considerado como un compuesto de amonio cuaternario que cuenta con
propiedades relajantes musculares a corto plazo. Es empleada como complemento de la
anestesia general para así facilitar la intubación traqueal y proporcionar así una relajación
del musculo esquelético (Miller, A., et. al. 2007; 2. National Center for Biotechnology
Information, 2021).

El mecanismo de acción es a través de la unión del fármaco hacia los receptores

nicotínicos en la unión neuromuscular, abre los canales activados por ligando, de la misma
manera que lo hace la acetilcolina (ACh), por lo tanto, produce una despolarización e
inhibición de la transmisión neuromuscular. La despolarización se puede prolongar debido
a la resistencia del fármaco hacia las acetilcolinesterasas, lo cual provoca una contracción
muscular desorganizada, seguida de una relajación del músculo esquelético y parálisis
flácida (Miller, McKee, Mazer, 2007; National Center for Biotechnology Information, 2021).

El bloqueo neuromuscular se presenta a partir de los primeros 60 segundos después

de ser administrada por vía intravenosa, durante un periodo de 4-6 minutos se une a los
receptores colinérgicos de la placa motora terminal para así producir la despolarización de
la membrana y posteriormente llevar a cabo la parálisis muscular. El suxametonio no tiene
acción directa sobre el musculo liso o cardiaco; tampoco actúa con los receptores de ACh
presinápticos o ganglionares (Freid, 2007).

F. TETRODOTOXINA

La tetrodotoxina (TTX) es una de las neurotoxinas, que se obtiene del pez globo y
se requieren una gran cantidad de ovarios para obtener un solo gramo puro de esta toxina.
Su sitio de unión se encuentra en la cara extracelular del canal y está presente en todas las
isoformas conocidas del canal de sodio; por lo tanto, la afinidad a la toxina es dependiente
de la isoforma.Fuente especificada no válida.

Uno de los principales usos farmacéuticos que tiene es la fabricación de

medicamentos analgésicos que ayudan a combatir tanto el dolor producido por algún tipo
de lesión como el dolor neuropático.

10
 La TTX actúa bloqueando los canales de sodio a nivel de la membrana celular y por
tanto, reduciendo la excitabilidad celular, afectando principalmente al miocito cardiaco, el
músculo esquelético, y el sistema nervioso central y periférico. La tetrodotoxina disminuye
o previene la despolarización del nervio y del músculo.

Los canales de sodio dependiente de voltaje se ubican fundamentalmente en los

nodos de Ranvier a lo largo de los axones. Durante la propagación del impulso nervioso,
los canales de sodio se abren y los iones de sodio fluyen hacia afuera siguiendo su
gradiente electroquímico, despolarizando la membrana. Esto a su vez activa los canales de
sodio del siguiente nodo dando así continuidad al impulso a lo largo del axón. En presencia
de cantidades nanomolares de TTX la probabilidad de apertura de los canales de sodio
disminuye, impidiéndose el flujo de iones sodio y por tanto inhibiendo la transmisión del
impulso. Fuente especificada no válida.

Los canales de sodio, cuya función es conducir el potencial de acción. En algunos

experimentos se ha demostrado que, a altas concentraciones, reduce la producción de
acetilcolina y disminuye la actividad del citocromo oxidasa y de la acetilcolinesterasa.

11
 CAPITULO SEGUNDO
Marco Metodológico

A. OBJETIVOS

OBJETIVO GENERAL

• Estudiar los efectos de los fármacos agonistas y antagonistas que afectan la

transmisión neuromuscular en un modelo rata in silico.

OBJETIVOS ESPECÍFICOS

• Analizar por medio del simulador Twitch V2.1.1, la farmacología de

contracción del nervio frénico/hemidiafragma mediante una preparación in
silico en un modelo de rata.

• Estimar la importancia farmacológica de los iones calcio en la contracción

muscular por medio del simulador Twitch V2.1.1.

B. PROCEDIMIENTO EXPERIMENTAL

De acuerdo con la guía sobre la Simulación del nervio frénico/hemidiafragma de

rata, proporcionada por el Dr. Luis Alfonso Moreno Rocha, se llevaron a cabo una
serie de cinco pruebas diferentes recomendadas, con el propósito de estudiar los
efectos de diferentes fármacos antagonista y agonistas, y su relación con la
contracción y bloqueo neuromuscular en un modelo de rata simulado por el
programa virtual Twitch V2.2.1.

Los materiales para ocupar en esta práctica fueron los siguientes (Tabla1).

12
 MATERIALES
NOMBRE DIBUJO

Equipo de computo con

sistema operativo Windows 98
o posterior

Programa Twitch V2.2.1

(University of strathclyde,
2021)

Tabla 1. Lista de materiales a ocupar

Dentro del programa virtual Twitch V2.2.1, se encuentran un catálogo de Drugs

sugeridos como: Tubocurarina, Neostigmina, 4-aminopiridina, Atropina,
Suxamethonium y Tetradoxina. Estos compuestos se expresan en moles por litro
[M] y corresponde a la concentración añadida (no total) y aparece debajo del registro
gráfico.

Por otro lado, está el menú Ions, sugiriendo átomos como: Ca++ y Mg++. El calcio es
responsable de la liberación de ACh de las terminaciones nerviosas, mientras que
el magnesio bloquea competitivamente la entrada de calcio a la célula nerviosa de
modo que afecta la cantidad de liberación de ACh. Se expresan en moles por litro
[M].
Finalmente, se encuentra el menú Wash, el cual sugiere soluciones de Krebs con o
sin Ca++. El efecto de algunos fármacos dura algunas después del lavado. Se
muestra de manera general un diagrama de flujo continuo sobre los pasos a seguir
para realizar la parte experimental en el modelo de rata insilico (Diagrama 1), así
como el diagrama de flujo para la realización de la curva dosis-respuesta del
fármaco Tubocurarina y Suxametonio a diferentes concentraciones indicadas en la
guía proporcionada (Diagrama 2).

13
 Diagrama 1. Experimento in sílico sobre
las con virtual Twitch V2.2.1

Descargar e instalar programa Virtual Twitch

desde el repositorio de la universidad de
Strathclude:
Verifica la versión de Windows de tu http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/media/4
PC y descarga la versión que sea 0/sims/Twitch_V2.2.1_Setup.exe
compatible con tu PC. Guíate con los
instructivos visibles en el sitio web del
programa

¿Se instalo Abrir el programa y seleccionar

NO correctamente el
SI
New Rat en el menú archivo
programa en tu para limpiar el gráfico
PC?
Ensayos para realizar:

Para administrar el fármaco al En caso de requerir una

modelo, da clic en el apartado Drugs
del menú principal, y selecciona el
indicado dependiendo al ensayo a
realizar.
Posteriormente, dar clic en Start
para comenzar con el registro del
gráfico y observar la contracción
basal (aproximadamente 60 g).
estimulación directa, indirecta
o ninguna, dar clic en las
opciones presentadas en el
apartado Stimulator.

Después, verificar la concentración

¿Seleccionaste la Selecciona en el menú Wash, la
adecuada al ensayo a realizar en
concentración opción Normal Krebs (2mM Ca, 1
unidades de [M] con notación
correcta del mM Mg), para eliminar el fármaco
científica y dar clic en el botón
fármaco? administrado previamente.
Inject drug.

En seguida, toma registro de la contracción

muscular posicionando el cursor sobre la
misma. Después, verifica tres contracciones
diferentes y promédialas.

¿Te pidieron lavar con

solución de Krebs
Normal para eliminar el
fármaco de la gráfica?

NO Finalmente, selecciona en el
menú Wash, la opción
SI Normal Krebs (2mM Ca, 1
Selecciona en el menú Wash, la opción Low
mM Mg), para eliminar la
Krebs (0mM Ca, 1 mM Mg), para eliminar el
concentración fármaco
fármaco a la condición solicitada.
administrado en la gráfica y
puedas
14 realizar los ensayos
con los diferentes fármacos
 Diagrama 2. Experimento insílico para la
construcción de curvas dosis-respuesta con
virtual Twitch V2.2.1

Descargar e instalar programa Virtual Twitch

Verifica la versión de Windows de tu PC y
descarga la versión que sea compatible
con tu PC. Guíate con los instructivos
visibles en el sitio web del programa
desde el repositorio de la universidad de
Strathclude:
http://spider.science.strath.ac.uk/sipbs/media/4
0/sims/Twitch_V2.2.1_Setup.exe

¿Se instalo Abrir el programa y seleccionar

NO SI
correctamente el New Rat en el menú archivo para
programa en tu limpiar el gráfico
PC?

Ensayos para realizar:

Para administrar el fármaco al Posteriormente, dar clic en Start

modelo, da clic en el apartado Después, selecciona la opción
para comenzar con el registro del
Drugs del menú principal, y de estimulación indirecta en el
gráfico y observar la contracción
selecciona los fármacos apartado Stimulator
basal (aproximadamente 60 g).
Tubocurarine y posteriormente
Suxamethonium.

Después, verifica las concentraciones Selecciona en el menú Wash, la

¿Seleccionaste la
indicadas en ensayo a realizar en NO opción Normal Krebs (2mM Ca, 1
concentración
unidades de [M] con notación científica mM Mg), para eliminar el fármaco
correcta del
y dar clic en el botón Inject drug. administrado previamente.
fármaco?
SI

Para la construcción de la curva dosis-

respuesta del fármaco Tubocurarine, realiza
un intervalo de concentración con
incrementos de 2.0E-7 M desde [5.E-07]
hasta [3.0E-6] en unidades M.
En seguida, toma registro de la contracción
muscular de cada fármaco en cierta
concentración sometida, posicionando el cursor
sobre la misma. Después, verifica tres
contracciones diferentes y promédialas.

Para la construcción de la curva dosis-

respuesta del fármaco Suxamethonium,
realiza un intervalo de concentración con ¿Te pidieron lavar con
incrementos de 2.0E-6 M desde [5.E-06] solución de Krebs
hasta [4.5 E-5] en unidades M. Normal para eliminar el
fármaco de la gráfica?
Finalmente, selecciona en el menú
NO Wash, la opción Normal Krebs (2mM
SI
Ca, 1 mM Mg), para eliminar la
concentración fármaco administrado en
Selecciona en el menú Wash, la opción Low la gráfica y puedas realizar las
15
Krebs (0mM Ca, 1 mM Mg), para eliminar el condiciones a diferente concentración
fármaco a la condición solicitada. con los dos fármacos sugeridos
 CAPITULO TERCERO
Análisis e interpretación de resultados

A. RESULTADOS Y DISCUSIÓN

1. DESCRIBIR EL EFECTO DE CADA FÁRMACO SOBRE EL POTENCIAL DE ACCIÓN DURANTE

LA ESTIMULACIÓN DIRECTA E INDIRECTA Y EXPLICAR SUS OBSERVACIONES.

Conforme a los resultados obtenidos a partir de la simulación, se determinó la

contracción basal del nervio frénico/hemidiafragma y en la fibra muscular en un modelo
animal de rata, observando las siguientes respuestas conforme a cada fármaco (Tabla 1).

TABLA 1

Respuesta Respuesta
Concentración Respuesta
Fármaco nervio nervio directo
[µM] basal (g/s)
indirecto (g/s) (g/s)

Atropina N/A N/A N/A N/A

Neostigmina [2.0 E-7 M] 59.26 75.83 59.9

Suxamethonium [5E-6 M] 59.8 53.83 59.83
Tetrodotoxina [2.0E-7 M] 59.36 8.8 8.4
4- aminopiridina [2.0E-5] 59.26 64.6 64.36
Tubocurarina [2.0E-7 M] 60.43 55.2 59.63

Posteriormente, se muestran las gráficas obtenidas de los fármacos (Atropina,

Neostigmina, Suxamethonium, Tetradoxina, 4- aminopiridina, Tubocurarina) con su
respuesta contráctil.

A) TUBOCURARINA

Al administrar la tubocurarina a concentración de [2.0E-7 M] sobre la

estimulación indirecta y directa, arroja como resultado un cambio en la contracción
muscula del nervio frénico con un valor de 55.2 g/s en promedio, con respecto a la
contracción basal con un promedio de 60.43 g/s. Sin embargo, no se notó una

16
 diferencia significativa en la estimulación directa, arrojando un resultado de
contracción de 59.63 g/s (Gráfica1).

Gráfica 1. Representación sobre el fármaco Tubocurarina

B) NEOSTIGMINA

Al administrar la Neostigmina a concentración de [2.0E-7 M] sobre la

estimulación indirecta y directa, arroja como resultado un cambio en la contracción
muscular del nervio frénico con un valor de 75.83 g/s en promedio, con respecto a
la contracción basal con un promedio de 59.26 g/s. Sin embargo, no se notó una
diferencia significativa en la estimulación directa, arrojando un resultado de
contracción de 59.9 g/s (Gráfica 2).

17
 Gráfica 2. Representación sobre el fármaco Neostigmina

C) 4-AMINOPIRIDINA

Al administrar la 4-aminopiridina (4-AP) a concentración de [2.0E-5 M] sobre

la estimulación indirecta y directa, arroja como resultado un cambio en la
contracción muscular del nervio frénico con un valor de 64.6 g/s en promedio, con
respecto a la contracción basal con un promedio de 60.43 g/s. Se puede observar
una diferencia en la contracción del músculo, arrojando un resultado de 64.36 g/s,
resultando en un aumento de 3.93 g/s (Gráfica 3).

Gráfica 3. Representación sobre el fármaco 4-AP

18
D) ATROPINA

Para el caso de atropina, no tuvo ningún efecto contráctil en los ambos estímulos
(nervio frénico y muscular), debido a que este fármaco no tiene mayor actividad antagonista
en los receptores nicotínicos dentro de esta simulación de modelo animal de rata.

E) SUXAMETONIO

Al administrar el suxametonio a concentración [5.0E-6M] sobre la estimulación

indirecta y directa produce una repuesta de cambio en la contracción muscular en el nervio
frénico dando un valor de 53.83 g/s en respuesta promedio, mientras tanto en la contracción
basal dio un promedio de 59.8 g/s; sin embargo, no mostró una diferencia significativa en
la estimulación directa, dando un ritmo constante de 59.83 g/s (Gráfica 4).

Gráfica 4. Representación sobre el fármaco Suxametonio

F) TETRODOTOXINA

Al administrar la tetrodotoxina a concentración de [2.0e-7M] sobre la estimulación

indirecta y directa, nos da como resultado un cambio en la contracción muscular del nervio
frénico y de la fibra muscular con un valor de 8.8 g/s en promedio del estímulo indirecto y
un valor de 8.4 g/s en promedio del estímulo directo, con una respuesta significativa en

19
 ambos casos con respecto a la concentración basal con un promedio de 59.33 g/s (Gráfica
5)

Gráfica 5. Representación sobre el fármaco Tetrodotoxina

2. TRAZAR EL GRÁFICO DE LA DEPENDENCIA ENTRE LA CONCENTRACIÓN DEL FÁRMACO

EN LA SOLUCIÓN CON TUBOCURARINA (CONCENTRACIÓN MÍNIMA 0.5 ΜM E
INCREMENTOS DE 0.2 ΜM) O CON SUXAMETONIO (CONCENTRACIÓN MÍNIMA 5M E
INCREMENTOS DE 2 ΜM) Y LA MAGNITUD DE LA CONTRACCIÓN EN GRAMOS EN
ESTIMULACIÓN INDIRECTA.

Conforme a los resultados obtenidos a partir de la simulación, se determinó una

curva dosis-respuesta sobre la dependencia entre un intervalo de concentraciones [M] del
fármaco tubocurarina (Tabla 2) y suxametonio (Tabla 3), con respecto a la magnitud de la
contracción en g/s en estimulación indirecta en un modelo animal de rata in silico.
Posteriormente, se calculó la DE50 con la ecuación de Hill para cada curva dosis-respuesta
de los fármacos previamente mencionados.

20
 A) TUBOCURARINA

Al administrar el intervalo de [5.E-07 M] hasta [3.0E-6 M] en incrementos de [2.0E-

7 M] con el fármaco tubocurarina, se obtuvo las contracciones del estímulo indirecto, en
relación con la contracción basal de 59.2 g/s sin ninguna administración del fármaco
(Gráfica 2).

TUBOCURARINA

Concentración Contracción Basal - Estimulado

LOG de [M] %E Log (E/(Emax-E)
[M] muscular (gr) por el fármaco
0 59.2 0 0 0 0
5.00E-07 35.6 23.6 -6.301029996 39.86486486 -0.178537995
7.00E-07 21.73333333 37.46666667 -6.15490196 63.28828829 0.236518716
9.00E-07 13.36666667 45.83333333 -6.045757491 77.42117117 0.535158326
1.10E-06 8.4 50.8 -5.958607315 85.81081081 0.781584426
1.30E-06 5.7 53.5 -5.886056648 90.37162162 0.972478926
1.50E-06 4.1 55.1 -5.823908741 93.07432432 1.128367742
1.70E-06 3.1 56.1 -5.769551079 94.76351351 1.257601167
1.90E-06 2.3 56.9 -5.721246399 96.11486486 1.39338443
2.10E-06 1.9 57.3 -5.677780705 96.79054054 1.479401021
2.30E-06 1.833333333 57.36666667 -5.638272164 96.90315315 1.495418181
2.50E-06 1.5 57.7 -5.602059991 97.46621622 1.585084554
2.70E-06 1.333333333 57.86666667 -5.568636236 97.74774775 1.63748973
2.90E-06 1.2 58 -5.537602002 97.97297297 1.684246748
3.10E-06 1 58.2 -5.508638306 98.31081081 1.764922985
3.30E-06 0.9 58.3 -5.48148606 98.47972973 1.811426045

Gráfica 1. Curva dosis respuesta del fármaco tubocurarina. E= Efecto, Emax: Efecto máximo

A B

Gráficos A y B. El gráfico A muestra la relación entre el % de estimulación indirecta con respecto a la [M]. En el
gráfico B muestra la relación entre el % de estimulación indirecta con respecto al LOG [M]

21
 C Ajuste de Hill para el fármaco 𝐸
Ecuación de Hill con 𝐿𝑂𝐺 ቀ𝐸𝑚𝑎𝑥 −𝐸 ቁ
tubocurarina
2 50
𝐿𝑂𝐺 ൬ ൰
100 − 50
Log(E/Emax-E)

y = 2.3911x + 14.989 1.5

𝐿𝑂𝐺 ሺ1ሻ = 0
1
0 = 2.3911𝑥 + 14.989
0.5
𝑥 = −6.2686
0
DE50: 10^-6.2686 = [5.38766E-07 M]
-6.4 -6.2 -6 -5.8 -5.6 -5.4
-0.5
LOG de [M]

Gráfico C. El gráfico C muestra la relación entre el LOG (E/Emax) con respecto al LOG en [M].
Posteriormente, se consideró la ecuación de línea recta para obtener la concentración de [5.38766E-7M] al
50% de respuesta del efecto con respecto al efecto máximo

B) SUXAMETONIO

Al administrar el intervalo de [5.0E-6 M] hasta [4.5 E-5 M] en incrementos de [2.0E-

6 M] con el fármaco suxametonio, se obtuvo las contracciones del estímulo indirecto, en
relación con la contracción basal de 58.933333 g/s sin ninguna administración del fármaco
(Gráfica 3).

SUXAMETONIO

Concentración Contracción Basal - Estimulado

LOG de [M] %E Log (E/Emáx)
[M] muscular (gr) por el fármaco
0 58.93333333 0 0 0
5.00E-06 57.66666667 1.266666667 -5.301029996 2.149321267 -1.658262507
7.00E-06 55.86666667 3.066666667 -5.15490196 5.20361991 -1.260486187
9.00E-06 50.3 8.633333333 -5.045757491 14.64932127 -0.765389476
1.10E-05 40 18.93333333 -4.958607315 32.12669683 -0.32483291
1.30E-05 26.5 32.43333333 -4.886056648 55.03393665 0.087745712
1.50E-05 15.6 43.33333333 -4.823908741 73.52941176 0.443697499
1.70E-05 9.366666667 49.56666667 -4.769551079 84.10633484 0.723604649
1.90E-05 5.4 53.53333333 -4.721246399 90.83710407 0.996230526
2.10E-05 3.2 55.73333333 -4.677780705 94.57013575 1.24096504
2.30E-05 2.166666667 56.76666667 -4.638272164 96.32352941 1.418301291
2.50E-05 1.733333333 57.2 -4.602059991 97.05882353 1.51851394
2.70E-05 1.133333333 57.8 -4.568636236 98.07692308 1.707570176
2.90E-05 1 57.93333333 -4.537602002 98.30316742 1.762928517
3.10E-05 0.9 58.03333333 -4.508638306 98.47285068 1.809435007
3.30E-05 0.7 58.23333333 -4.48148606 98.81221719 1.92007361
3.50E-05 0.6 58.33333333 -4.455931956 98.98190045 1.987765544
3.70E-05 0.5 58.43333333 -4.431798276 99.15158371 2.067690657
3.90E-05 0.5 58.43333333 -4.408935393 99.15158371 2.067690657
4.10E-05 0.4 58.53333333 -4.387216143 99.32126697 2.165343266
4.30E-05 0.4 58.53333333 -4.366531544 99.32126697 2.165343266
22
4.50E-05 0.3 58.63333333 -4.346787486 99.49095023 2.29102333
Gráfica 2. Curva dosis respuesta del fármaco suxametonio. E= Efecto, Emax: Efecto máximo
D % de contracción muscular con E % de contracción muscular con
respecto a la concentraciones [M] de respecto a la concentracción en LOG
suxametonio [M] de suxametonio
120 120
% de estimulación indirecto

% de estimulación indirecto
100 100
80 80
60 60
40 40
20 20
0 0
0 0.00001 0.00002 0.00003 0.00004 0.00005 -6 -5 -4 -3 -2 -1 0

[M] de suxametonio [M] en LOG de suxametonio

Gráficos D y E. El gráfico D muestra la relación entre el % de estimulación indirecta con respecto a la [M]. En el
gráfico E muestra la relación entre el % de estimulación indirecta con respecto al LOG [M]

F Ajusta de Hill 𝐸
Ecuación de Hill con 𝐿𝑂𝐺 ቀ𝐸𝑚𝑎𝑥 −𝐸 ቁ
3
2.5 50
y = 4.3818x + 21.528 𝐿𝑂𝐺 ൬ ൰
2 100 − 50
LOG (E/Emax-E))

1.5
1 𝐿𝑂𝐺 ሺ1ሻ = 0
0.5 0 = 4.3818𝑥 + 21.528
0
-6 -5 -4 -3 -2 -1 -0.5 0 𝑥 = −4.9130494
-1
DE50: 10^-4.9130494 = [1.22166E-05 M]
-1.5
-2
LOG de [M]

Gráfico F. El gráfico C muestra la relación entre el LOG (E/Emax) con respecto al LOG en [M].
Posteriormente, se consideró la ecuación de línea recta para obtener la concentración de [1.22166E-5M] al
50% de respuesta del efecto con respecto al efecto máximo

23
3. ¿QUÉ FÁRMACOS Y CON QUÉ MECANISMO SE PUEDE COMPENSAR EL BAJO NIVEL DE
CONCENTRACIÓN DE CALCIO (0.5 mM)? (LAVAR EL BAÑO CON SOLUCIÓN DE KREBS SIN
CALCIO Y LUEGO AGREGAR 0.5 MM DE CALCIO.)

Al realizar los ensayos en el simulador, se determinaron los efectos de los

fármacos, los cuales sirvieron como base para determinar que fármaco se emplearía
para restaurar el efecto de la solución de Krebs sin calcio, y posteriormente la
agregación de 0.5 mM calcio. El fármaco que cumplía con el objetivo fue la
neostigmina (dosis mínima), cuyo mecanismo es inhibir la acción enzimática de la
acetilcolinesterasa permitiendo que haya un cumulo de acetilcolina en la unión
neuromuscular y supere la inhibición competitiva de los fármacos bloqueadores no
despolarizantes (Kyung-soo Hong, Rauck, 2018).

La acetilcolina es un neurotransmisor que actúa en dos tipos de receptores

(nicotínicos y muscarínicos), este actúa hacia el exterior y se fusiona con la
membrana presináptica, aquí las vesículas transportan la acetilcolina a su interior
mediante una proteína transportadora con 12 dominios transmembranales, que
utilizan un gradiente electroquímico generado por una bomba (ATPasa) de
protones. Entra en contacto con las sinapsinas, las cuales son fosforiladas por las
cinasas, esta fosforilación debilita la unión de las vesículas sinápticas al
citoesqueleto, facilitando así su transporte a la zona activa. Una vez transportadas,
las vesículas se fijan a la zona activa, donde posteriormente se realiza un proceso
que las hace competentes para llevar a cabo la exocitosis. A su vez se genera una
propagación de un impulso nervioso hacia la terminal axónica, la cual se despolariza
y permite llevar un potencial que va de -70 mV hasta +20 o +30 mV, lo que permite
la apertura de canales de Ca++ (Grafica G). (Gray, Ray, 2014)

24
Gráfico G. El gráfico muestra la respuesta provocada por la neostigmina, la cual hace una restauración
contráctil, posteriormente de haber administrado solución de Krebs sin Ca e iones de Ca

4. ¿CÓMO SE PUEDE RESTAURAR COMPLETAMENTE LA CONTRACCIÓN DESPUÉS DE LA

APLICACIÓN DE TETRODOTOXINA (0.5 ΜM) O SUXAMETONIO (20 ΜM)?

Con forme al programa de simulación, se determinó que para restaurar las

concentraciones es necesario administrar solución de Krebs, debido a que las
acciones de los fármacos sugeridos no brindaron una respuesta significativa, dicha
solución ayuda a limpiar los nervios de los fármacos, los cuales tienen funciones
neurotóxicas y analgésicas. Al hacer una investigación sobre los fármacos se
concluyó que era necesario realizar una limpieza de los nervios; en este caso por
ello se optó por usar dicha solución.

25
5. ¿CUÁL ES LA DIFERENCIA EN LA RESPUESTA MUSCULAR ENTRE LA ESTIMULACIÓN
DIRECTA E INDIRECTA, CUANDO LA SOLUCIÓN DEL BAÑO ESTÁ SIN CALCIO?

La diferencia entre ambas es que en la fibra muscular, el estímulo es directo

hacia el musculo, lo cual ocasiona que se abran los canales de Na + y permita el
ingreso de este, a su vez este envía un mensaje al musculo para que se establezca
la liberación de iones de Ca+ almacenados, por lo tanto no hay mucha diferencia si
le administra o elimina el Ca+; sin embargo, el nervio frénico tiene un estímulo
indirecto, donde al inicio va de la neurona al musculo para posteriormente
contraerse, para llevar a cabo dicha contracción debe de haber presencia de Ca+
para que se realice la exocitosis y así pueda provocar la sinapsis, con la ausencia
de Ca+ no hay ninguna respuesta (Gráfico H).

Gráfico H. Demostración del nervio directo e indirecto tras ser expuestos en solución de Krebs sin Ca+

26
B. CONCLUSIONES

Se cumplió el objetivo general propuesto en la práctica, mediante el simulador

Twitch V2.1.1 analizando los diferentes fármacos, obteniendo como resultado que
la tubocurarina y suxametonio disminuyen la contracción muscular a dosis bajas en
la estimulación indirecta, mientras que en la directa no hay respuesta. La
neostigmina y 4-aminopiridina elevan la contracción muscular en la estimulación
indirecta, mientras que en la directa sólo tuvo respuesta la 4-aminopiridina. Por otro
lado, tetrodotoxina disminuye la contracción muscular en ambas estimulaciones.
Por último, la atropina, no tuvo respuesta en ninguna estimulación, debido a su baja
afinidad por los receptores nicotínicos.
La importancia del calcio en la solución de Krebs es vital para que se lleven a cabo
estudios en organismos Ex vivos, debido a que esta solución ayuda a las arterias y
nervios cardiacos a determinar qué respuestas provocan en función al potencial de
acción.

27
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