Fecha Emisión: 28/02/2008 Doc: ITR016

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INSTRUCCIÓN DE TRABAJO
Descripción: Preparación de medios de cultivo

1. Alcance:

Este instructivo aplica a la preparación de los medios de cultivo deshidratados utilizados para
análisis microbiológico.

2. Responsabilidades:

Los analistas y auxiliares del laboratorio de microbiología son los responsables de la preparación y
control de los medios de cultivo.

3. Equipos y Materiales

 Plancha de calentamiento
 pH metro
 Agitador de vidrio
 Beaker de 500 mL y 3000 mL
 Agua desmineralizada

4. Procedimiento:

4.1 Pesar la cantidad de medio de cultivo de acuerdo con el volumen deseado de preparación
(Anexo 1).

4.2 En un beaker o erlenmeyer de vidrio adicionar el volumen de agua desmineralizada (de

acuerdo con la cantidad a preparar) al medio de cultivo pesado en el ítem 4.1.

4.3 Agregar los siguientes aditivos a los siguientes medios:

 BPA: Yema de huevo con telurito de potasio de acuerdo con las especificaciones del
fabricante (después de ser autoclavado).
 PIA: Glicerina de acuerdo con las especificaciones del fabricante (antes del autoclavado).
 HC: Tween 80 de acuerdo con las especificaciones del fabricante (antes del autoclavado).
 TSB Y BUFFER: Tween 20 de acuerdo con las especificaciones del fabricante (antes del
autoclavado).

Nota: Las iniciales para cada medio son las siguientes: AN (Agar Nutritivo), TSA (Agar
tripteína de soya) SDA (Agar Sabouraud Dextrosa), MC (Agar MacConkey), BPA (Agar Baird
Parker), PIA (Agar para el aislamiento de Pseudomonas sp.), HC (Agar HC), R2A (Agar R2A).

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4.4 Llevar a calentamiento hasta ebullición usando la plancha de calentamiento y agitar

constantemente con la ayuda del agitador de vidrio, hervir hasta que el polvo deshidratado se
haya disuelto totalmente.

4.5 Tomar una muestra de 50 mL del medio de cultivo preparado en un frasco vidrio borosilicato
de 100 mL, dejar enfriar hasta que el medio halla solidificado y la muestra se encuentre a
una temperatura de 25°C; controlar el pH (Verificar que el pH metro se encuentre verificado
antes de su uso. El valor deberá estar dentro los límites especificados por el fabricante (ver
ITR020).

4.6 Si el pH no cumple con la especificación se procede a corregir el valor de pH del medio de

cultivo preparado adicionando NaOH 0.1 N o HCL 0.1 N.

4.7 Servir los medios TSA y HC en frascos de vidrio borosilicato de 250 mL, los demás medios
pueden distribuirse en frascos de vidirio borosilicato de 500 mL ya que inmediatamente
después de su autoclavado se vierten en placas Petri.

4.8 Tomar una muestra de 50 mL en un frasco de vidrio borosilicado de 100 mL por cada medio
de cultivo preparado para la verificación de pH.

4.9 Los frascos se deben dejar con la tapa floja con el fin de no acumular presión y así evitar la
filtración por las paredes externas del frasco; cada frasco o tubo de ensayo se debe rotular
con la fecha de elaboración, el lote y las iniciales del medio que contiene en la cinta testigo
de esterilización.

4.10 Distribuir los frascos y las muestras para verificación de pH en el autoclave y realizar un
ciclo de esterilización según lo indicado en el instructivo ITR013.

4.11 Cuando el ciclo haya terminado y la presión de vapor disminuido, abrir el autoclave, retirar
los frascos, dejar enfriar y tapar bien.

4.12 Cuando la muestra de verificación haya solidificado y enfriado, proceder a realizar la

lectura de pH a 25°C

4.13 Registrar los resultados en el formato ITR016-1.

4.14 Para el ensayo de promoción de crecimiento en medios de cultivo ITR020 ver ítem 5.3.2,
verificar el lote de la cepa en uso registrada en el formato ITR033-1 que esté vigente, que
cumpla con las especificaciones como lo son tinción de gram, morfología y registrar fecha y
hora de siembre en el formato ITR016-1 junto con los resultados obtenidos.
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4.15 Limpiar y almacenar los frascos en nevera a una temperatura entre 2-8°C por un periodo no
mayor a 30 días.

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Anexo 1

Cantidad de medio de cultivo deshidratado en polvo para preparar un litro (1L) de medio

CANTIDAD DE MEDIO
MEDIO DE CULTIVO SUPLEMENTO (mL)
POR LITRO (g)
Agar Nutritivo (NA) 31.0 ---

Agar Tripteína de Soya (TSA) 40.0 ---

Agar R2A 18.2 ---

Agar Saboraud Dextrosa (SDA) 65.0 ---

Tween 80
Agar HC 54.5
20
Agar MacConckey (MC) 50.0 ---
Agar Pseudomonas Isolation Glicerina
46.4
(PIA) 10
Yema de huevo con telurito de
Agar Baird Parker (BPA) 66.3 potasio
52.6

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