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Impreso por: Lorena Parra Fecha Oficial: Oficial desde 01-nov-2019 Tipo de Documento: Capítulos Generales @2023 USPC
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á55ñ INDICADORES BIOLÓGICOS—PRUEBAS DE RESISTENCIA

INTRODUCCIÓN

Un indicador biológico (BI, por sus siglas en inglés) es una preparación bien caracterizada de un microorganismo específico
de resistencia conocida a un proceso de esterilización específico. El uso correcto de los indicadores biológicos en el desarrollo,
validación y control de los procesos de esterilización requiere conocer con exactitud su población y resistencia. La población y
resistencia pueden seleccionarse para confirmar la aptitud de las condiciones del proceso de esterilización individual para un
artículo. Las recomendaciones del capítulo Esterilización de Artículos Farmacopeicos á1229ñ deben seguirse para un uso eficaz de
los indicadores biológicos. Los métodos descritos a continuación pueden usarse para establecer la población y la resistencia, de
modo que la respuesta del indicador biológico al proceso de esterilización usado sea apropiada. Aunque se requiere que los
fabricantes de indicadores biológicos mantengan un control riguroso de la población y de la resistencia mediante el uso del
número de determinaciones repetidas especificado a continuación, no se requiere que los usuarios finales usen el mismo número
de determinaciones repetidas para la verificación de dichas determinaciones. Realizar todas las pruebas descritas en este capítulo
en condiciones de laboratorio microbiológico apropiadas (ver el capítulo Óptimas Prácticas de Laboratorio Microbiológico á1117ñ).

RECUENTO TOTAL DE ESPORAS VIABLES

Recolección/Recuperación de Muestras

l
INDICADORES DE PAPEL/FIBRA

ia
Para portadores de papel o fibra de vidrio para indicadores biológicos, retirar al menos cuatro muestras de prueba de sus
envases individuales. Desmenuzar el indicador hasta reducirlo a las fibras que lo componen colocando las muestras de prueba
en un vaso estéril que contenga 100 mL de Agua Purificada esterilizada y enfriada a 2°–8° y alterar mecánicamente hasta lograr
una suspensión homogénea. Para indicadores biológicos autocontenidos, retirar asépticamente cuatro portadores de indicador
biológico de sus envases y proceder según se indicó anteriormente.
fic
INDICADORES EN OTROS SUSTRATOS
Para todos los demás indicadores biológicos, retirar al menos cuatro muestras de sus envases individuales. Colocar las
muestras de prueba en un vaso estéril que contenga 100 mL de Agua Purificada esterilizada y enfriada a 2°–8° y alterar
mecánicamente hasta lograr una suspensión homogénea de las esporas en agua.
O

SUSPENSIONES DE ESPORAS
Para suspensiones de esporas de indicadores biológicos, preparar una dilución en serie apropiada de la suspensión de esporas
original en Agua Purificada esterilizada y enfriada a 2°–8°, en un envase estéril, y seguir los procedimientos de recuento de
esporas viables según se especifican a continuación. Los requisitos de las pruebas se cumplen si el número promedio de esporas
viables está dentro del 50%–300% del recuento declarado de la suspensión de esporas.

Recuento de Esporas Viables

Transferir una alícuota de 10 mL de la suspensión a un tubo estéril. Para indicadores biológicos que usan esporas de Geobacillus
stearothermophilus, Bacillus coagulans y otros formadores de esporas termófilos, calentar el tubo que contiene la suspensión en
un baño de agua a 95°–100° durante 15 minutos (choque térmico), comenzando a medir el tiempo cuando la temperatura
alcanza 95°. Para indicadores biológicos que contienen formadores de esporas no termófilos, calentar el tubo que contiene la
suspensión en un baño de agua a 80°–85° durante 10 minutos, comenzando a medir el tiempo cuando la temperatura alcanza
80°. Enfriar rápidamente las suspensiones en un baño de agua con hielo a 0°–4°. Transferir dos alícuotas de 1 mL a tubos
adecuados y hacer diluciones en serie apropiadas en Agua Purificada esterilizada. Calcular las diluciones para generar 30–300
colonias por placa para un par de placas, cuando se tratan según se indica a continuación. Cuando el indicador biológico tiene
una concentración baja de esporas, puede ser necesario modificar la serie de diluciones y usar más placas en cada dilución.
Preparar una serie independiente de placas para cada alícuota. Colocar 1,0 mL de cada dilución seleccionada en cada placa
de un par de placas de Petri de 15 mm × 100 mm. En un plazo de 20 minutos, agregar a cada placa 20 mL de Medio Agar
Digerido de Caseína y Soja que se haya fundido y enfriado a aproximadamente 45°. Agitar por rotación suave para obtener una
suspensión homogénea y dejar solidificar. Incubar las placas en posición invertida a 55°–60° para formadores de esporas
termófilos y a 30°–35° para los formadores de esporas no termófilos o a la temperatura de recuperación óptima especificada
por el fabricante. Examinar las placas después de transcurridas al menos 48 horas, registrando el número de colonias para cada
placa. Calcular el número promedio de esporas por muestra de prueba a partir de los resultados, usando el factor de dilución
apropiado. Al evaluar los indicadores biológicos provistos por proveedores, el recuento de esporas viables debe estar entre
50% y 300% del valor declarado por el fabricante.

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DETERMINACIÓN DEL VALOR D

Aparato
El equipo de prueba usado para la determinación de la resistencia microbiana (“valor D”) se describe en detalle en la norma
ISO 18472, Sterilization of Health Care Products——Biological and Chemical Indicators—Test Equipment (Esterilización de
Productos para el Cuidado de la Salud—Indicadores Biológicos y Químicos—Equipo de Prueba) (1). Los detalles de los
Resistómetros para Evaluación de Indicadores Biológicos (BIER, por sus siglas en inglés) individuales varían según su diseño y el
proceso de esterilización particular para el que se usan. Se aceptan diferencias en el diseño siempre y cuando el desempeño del
tanque del BIER cumpla con los requisitos de la norma ISO para exposición del indicador biológico. Para procesos de
esterilización de una sola fase en los que no se ha definido un BIER aceptable, la determinación del valor D se puede lograr
adaptando un diseño de BIER destinado para un proceso de esterilización que opera en la misma fase. En la actualidad no hay
métodos disponibles para la determinación del valor D para procesos de esterilización de fases múltiples.

Procedimiento
Realizar las pruebas para valor D en las condiciones de esterilización que se correspondan con las previstas para el uso. Usar
20 muestras de prueba repetidas de indicadores biológicos en sus envases individuales originales, sometidos a por lo menos
cinco condiciones de exposición para un total de 100 pruebas. El número de condiciones de exposición se selecciona para
proveer un intervalo de observaciones que va de no menos de un valor D declarado por debajo del tiempo de supervivencia
esperado hasta no menos de un valor D declarado por encima del tiempo de muerte esperado. Colocar cada grupo en sendos
portamuestras adecuados que permitan exponer cada muestra a la condición de esterilización indicada en una ubicación

l
específica en la cámara de esterilización del BIER. Verificar los parámetros operativos del aparato BIER, usando portamuestras
sin muestras de prueba. Seleccionar una serie de tiempos de esterilización para las muestras a analizar en incrementos a partir

ia
del tiempo más breve. Las diferencias en los tiempos de esterilización a lo largo de las series deben ser tan constantes como sea
posible y la diferencia entre los tiempos adyacentes no es mayor al 75% del valor D esperado. Los procedimientos de prueba
para el uso del tanque del BIER en la evaluación de la resistencia microbiana se definen en una serie de normas ISO bajo la serie
11138 (2–5). Se debe seguir la norma apropiada para el indicador biológico. Los métodos de prueba y portadores usados con
el BIER pueden adaptarse a los aspectos específicos del indicador biológico. El método y aparatos usados para portadores de
fic
papel pueden diferir de los de otros portadores y serán sustancialmente diferentes de los usados para suspensiones de
indicadores biológicos.
Las condiciones de exposición para el valor D de portadores de materiales alternativos son iguales a las condiciones usadas
para determinar el valor D de portadores de papel. Si la etiqueta del fabricante permite el uso del portador de indicador biológico
con múltiples métodos de esterilización, entonces los datos sobre el valor D, tiempo de supervivencia y tiempo de muerte
tendrán que ser proporcionados por el fabricante para cada método de esterilización.
Para indicadores biológicos que son suspensiones de esporas, efectuar las determinaciones del valor D para cada uno de los
microorganismos que se proporcionan como una suspensión líquida de cultivo de esporas. La prueba se efectúa usando
O

diluciones en serie apropiadas basadas en el título declarado de esporas de la suspensión en Agua Purificada en un tubo estéril.
Cuando la suspensión se coloca sobre o en un sustrato como un cierre elastomérico o un producto formulado, su resistencia
puede diferir de la determinada en Agua Purificada. Esta diferencia puede ser significativa para el uso de indicadores biológicos y
para las medidas apropiadas tomadas antes del uso en actividades de validación de la esterilización.

Recuperación
Después de completar el procedimiento de esterilización para los indicadores biológicos y dentro de un tiempo determinado
(no mayor de 4 horas), retirar asépticamente y agregar cada indicador biológico a un medio adecuado (ver medios en Pruebas
de Esterilidad á71ñ) sumergiéndolo por completo en un tubo apropiado. Para indicadores biológicos autocontenidos, la tira de
papel se sumerge en el medio autocontenido según las instrucciones del fabricante, dentro de un tiempo determinado no
mayor de 4 horas. Para artículos insolubles inoculados con una suspensión de esporas, transferir asépticamente estos artículos
de manera individual a un medio adecuado (ver medios en el capítulo á71ñ) y sumergir el artículo completamente en dicho
medio. Cuando un envase con contenido acuoso sellado se haya inoculado, analizar las unidades individualmente, según se
describe en el capítulo á71ñ.
Incubar cada tubo a la temperatura de recuperación óptima apropiada para el indicador biológico. Observar cada tubo que
contenga medio inoculado a intervalos apropiados durante un total de 7 días después de la inoculación. Cuando se observa
crecimiento en cualquier momento de la observación en particular, se puede suspender la incubación de dicha muestra de
prueba. Tomar nota del número de muestras que no presentan evidencia de crecimiento en ningún momento.
Cuando se usa Clostridium sporogenes u otro microorganismo anaerobio como indicador biológico, los métodos para la
preparación e inoculación, así como los métodos y medios de recuperación, deben adaptarse al uso de estos formadores de
esporas anaerobios.

Cálculos
La determinación de los valores D de los indicadores biológicos se puede efectuar usando el Método de Spearman-Karber
Limitado, el Método de la Curva de Supervivencia o los procedimientos de Stumbo-Murphy-Cochran (6–8). Cuando se haya
comprado el indicador biológico, usar el mismo método definido por el fabricante del indicador biológico para determinar
subsiguientemente los valores D. El uso de un método alternativo puede producir diferencias que son más un artefacto del
método que una variación en el desempeño del indicador biológico.

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Tiempo de Supervivencia y Tiempo de Muerte

Tomar dos grupos de indicadores biológicos, cada uno integrado por 10 muestras de prueba, en sus envases individuales
originales. Colocar las muestras de cada grupo en portamuestras adecuados que permitan exponer cada muestra a las
condiciones de esterilización en una ubicación específica en la cámara del BIER.
Exponer las muestras durante el tiempo de supervivencia requerido, ingresar a la cámara y retirar los portamuestras con las
10 muestras de prueba. Repetir el procedimiento anterior inmediatamente, o precalentar si transcurrió un tiempo sustancial, a
fin de someter el segundo portamuestras con 10 muestras de prueba a condiciones similares a las primeras pero durante el
tiempo de muerte requerido. Recuperar los indicadores biológicos según se indicó anteriormente. El Tiempo de Supervivencia y
Tiempo de Muerte deben ser provistos por el fabricante del indicador biológico y verificados por el usuario final.

REFERENCIAS

1. American National Standards Institute (ANSI)/Association for the Advancement of Medical Instrumentation (AAMI)/
International Organization for Standardization (ISO) 18472:2006. Sterilization of health care products—biological and
chemical indicators—test equipment. 1st ed. Arlington, VA: AAMI.
2. ANSI/AAMI/ISO 11138-1:2006. Sterilization of health care products—biological indicators—part 1: general
requirements. 2nd ed. Arlington, VA: AAMI.
3. ANSI/AAMI/ISO 11138-2:2006. Sterilization of health care products—biological indicators—part 2: biological indicators
for ethylene oxide sterilization processes. 3rd ed. Arlington, VA: AAMI.
4. ANSI/AAMI/ISO 11138-3:2006. Sterilization of health care products—biological indicators—part 3: biological indicators
for moist heat sterilization processes. 1st ed. Arlington, VA: AAMI.

l
5. ANSI/AAMI/ISO 11138-4:2006. Sterilization of health care products—biological indicators—part 4: biological indicators

Paul, MN: Environmental Sterilization Services; 1980.

ia
for dry heat sterilization processes. 1st ed. Arlington, VA: AAMI.
6. Pflug IJ. Syllabus for an introductory course in the microbiology and engineering of sterilization processes. 4th ed. St.

7. Pflug IJ, Smith GM. The use of biological indicators for monitoring wet-heat sterilization processes. En: Gaughran ERL,
Kereluk K, eds. Sterilization of medical products. New Brunswick, NJ: Johnson and Johnson; 1977:193–230.
fic
8. Holcomb RG, Pflug IJ. The Spearman-Karber method of analyzing quantal assay microbial destruction data. En: Pflug IJ,
ed. Microbiology and engineering sterilization processes. St. Paul, MN: Environmental Sterilization Services; 1979.
O

https://online.uspnf.com/uspnf/document/4_GUID-6C2992F1-FF4E-4CE3-88C9-6C94C6449C80_2_es-ES 3/3