Universidad Politécnica de Sinaloa

Ing. en Biotecnología
Biocatálisis
Dra. Idalia Osuna Ruíz
Protocolo II
Integrantes:
Garzón Aréchiga María Fernanda
González Argüelles Ximena
Lizárraga Lizárraga Diana
López Chávez Alexia
Nolasco Ramírez Paloma
Orona Díaz Dana Arely
Ortiz Alcaraz Carolina
Rodríguez Bonilla Sabina Michelle
03 de abril de 2020
Introducción

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La piña se trata de un fruto espinoso de piel gruesa que reviste un contenido carnoso amarillo rico
en agua y azúcares. Se caracterizada por poseer una pulpa amarilla y abundante. De manera central
posee un corazón que está formado por un tallo fibroso el cual está rodeado por el contenido
carnoso de las frutas que posee alto nivel de fibra, glucosídico, los micronutrientes y el aporte de
agua que compone a la piña (Upadhyay, Lama y Tawata, 2010). La bromelina es el componente
proteolítico mayoritario presente en extractos de tallos de piña (Hernández M, 2004).

La bromelina (EC3.4.22.32) es una cisteín proteasa aislada y purificada de órganos de plantas de

piña (Ananas comosus (L.).(Hernández, et al., 2003). La bromelina actúa sobre otras proteínas
como la caseína, la hemoglobina y la gelatina. El pH óptimo sobre la caseína y la hemoglobina
desnaturalizada es respectivamente de 8.3 y 8.0. La principal ventaja de esta proteasa frente a otras
como la papaína o la ficina es que se extrae fácilmente a partir de los residuos, tanto de las
plantaciones como las fábricas de enlatado de piña. (Merino de Cáceres, F., 2009)

Las enzimas presentan la ventaja de que pueden aumentar el nivel de producción de alimentos, con
un control exacto de producto final y una disminución de los residuos. (López, et al., 1996) La
bromelina es un complejo enzimático que se encuentra en la fruta y se encuentra en mayor
concentración en el tallo de la piña (Ananas comosus). Tiene actividad en un rango de ambientes
tanto ácidos como alcalinos. Esta enzima tiene importantes aplicaciones en la biotecnología, dentro
de la industria alimenticia principalmente para formular ablandadores de carne y elaboración de
quesos y cerveza, entre otras. (Quince, et al., 2013)

Tabla 1. Propiedades físicas de la bromelina. Pulido (2007)

Objetivo
Caracterizar el extracto semipurificado obtenido a partir de piña .

Métodos

Determinación de temperatura óptima

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Se determinara la actividad proteolítica total en Bromelina a distintas temperaturas (25, 35, 45, 55 y
65 °C). Preparar una serie de tubos por cada temperatura (un control y tres para actividad) con
100µL de extracto semipurificado, obtenido en la práctica anterior. Incubar cada serie de tubos con
el extracto a la temperatura correspondiente. Para 25° se dejará a temperatura ambiente y para 35,
45, 55 y 65°C se usará termobaño. Posteriormente se determinara la actividad proteolítica total
siguiendo el método del protocolo 1 (anexo). El sustrato utilizado en la determinación de actividad
(caseína 1%) deberá de ser incubado a la temperatura de reacción correspondiente.

Determinación del pH óptimo

Se determinará el PH óptimo en la Bromelia para esto se llevará a cabo la preparación de distintas
soluciones buffer de pH (de entre 4.5 -8). Para los rangos de pH de 4.5 y 8 se preparan 3 muestras y
un control, se utilizará tris(hidroximetil)aminometano al 0.1 M, se ajustará la solución al pH
requerido con HCl 1 M. Para el caso del pH 8, se utilizará glicina con una concentración de 0.1 M,
ajustando el pH con NaOH 1 M. Los valores de pH, se determinará (por triplicado) la actividad
enzimática de un extracto de bromelia con sus respectivos controles. Una vez preparadas las
soluciones buffer, se determinará la actividad proteolítica total de acuerdo al protocolo de la
práctica

Susceptible a inhibidores o activadores de la actividad proteolítica

La enzima se inhibe por derivados mercuriales como el p-CMB (ácido p-cloromercuribenzoico) lo

que demuestra que los grupos -SH reactivo son necesarios para la actividad. Esta pérdida de
actividad puede ser recuperada con concentraciones crecientes de cisteína. El agente nucleófilo es el
átomo de azufre de la cisteína que formaría un intermediario covalente durante la reacción. (López,
I, et al. 1996).

Especificidad de sustratos

1.1 Glucacion de proteínas

Las proteínas glucadas se preparan por incubación de las proteínas nativas al 1% en solución estéril
de buffer fosfato Mm, glucosa 50Mm a 37°C con o en ausencia de inhibidores durante el periodo de
un mes. Los inhibidores que se pueden emplear son aminoguanidina, arginina y ácido-
acetilsalicílico. Las soluciones deben ser dializadas contra agua y liofilizadas. Todas las soluciones
deben ser esterilizadas por ultracentrifugación a través de filtros Gelman 0.2 μm en tubos de
plástico estériles.

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 1.2 Análisis de bromelina

Para la actividad enzimática se deben mezclar 1.5 ml de buffer fosfato 10m M pH 7.3, NaCl 0.15 M
y 0.5 ml de la proteína (0.2 a 1%). La reacciones se iniciaran con la adición de 0.07 g/ml de
bromelina a 37°C. Las reacciones se detendrán mediante la adición de 1.5 ml de
acidotricloroacetico a intervalos de tiempos determinados. La proteína sin reaccionar se centrifugará
y la absorbancia de los productos del péptido soluble será medida a 280nm. La velocidad se expresa
en función de dA/dt, a partir de los datos de absorbancia tiempo por regresión lineal y los
parámetros de Michaelis-Menten (Km y Vmax) se obtendrán por el método no lineal de mínimos de
cuadros aplicando la ecuación de Michaelis-Menten (Enzifitter).

1.3 Análisis espectroscópico de las proteínas

En el estudio espectroscópico se debe llevar a cabo en la región comprendida entre 200 a 900 mm
en un espectrofotómetro Perkin Elmer, usando soluciones 0.2 mg/ml de las proteínas nativas,
glucadas e inhibidas en buffer fosfato 10nM a pH 7.3.

Tabla 1. Especificidad hacia distintos sustratos por bromelina. Ejemplos de la glucacion de

proteínas sobre la actividad proteolítica de la bromelina a 37°C y pH 7.3 para referencia y
comparación.

Sustrato Actividad relativa

Bromelina

Caseina nativa 1

Caseina glucada 0.95 + 0.13

HSA nativa 1

HSA glucada 0.75 + 0.17

BSA nativa 1

BSA glucada 0.83 + 0.16

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Tabla 2. Parámetros de Michaelis-Menten para la proteólisis de proteínas nativas y glucadas a 37°C
y pH 7.3 catalizada por bromelina de piña.

Proteína Vmax 103 min-1 mg-1 Km 10-1 mg ml-1

Ovalbumina nativa 1.91 + 0.14 0.23 + 0.05

Ovalbumina glucada 1.47 + 0.06 0.24 + 0.02

Caseína nativa 2.59 + 0.16 0.17 + 0.04

Caseína glucada 2.60 + 0.18 0.16 + 0.03

HSA nativa 2.76 + 0.08 0.21 + 0.02

HSA glucada 2.23 + 0.07 0.23 + 0.02

BSA nativa 3.63 + 0.22 0.32 + 0.06

BSA glucada 2.96 + 0.26 0.33 + 0.06

Mioglobina nativa 2.60 + 0.15 0.14 + 0.03

Mioglobina glucada 1.63 + 0.09 0.18 + 0.04

Análisis electroforético:
La masa molar de la proteína se estima por el método de Andrew 17 en geles de Sephadex G-100 y
por electroforesis bidimensional de proteínas, utilizando como referencia patrones de masa molar
conocida y el punto isoeléctrico (pI) de la fracción proteica de la preparación parcialmente
purificada se determinó por isoelectroenfoque (IEF).
Bibliografía

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