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1 Reporte de práctica: Análisis de Alimentos

2 EXTRACCIÓN Y LA CUANTIFICACIÓN DE PROTEÍNAS TOTALES EN

3 SEMILLAS GERMINADAS DE MAÍZ (ZEA MAYS L.)

4 EXTRACTION AND QUANTIFICATION OF TOTAL PROTEINS IN GERMINED

5 MAIZE SEEDS (ZEA MAYS L.)

6 A.B. Prado-Guzmán G.A1,2*


1
7 Instituto Tecnológico de Tepic. Av. Tecnológico #2595, Col. Lagos del Country. C.P.

8 63195. Tepic, Nayarit, México.

9 Fecha de envío: 17 de febrero de 2018

10 Resumen:

11 Se realizó de manera virtual mediante la plataforma Biomodel la determinación de una

12 curva de calibración empleando el método de Bradford. Mediante el uso de un

13 espectrofotómetro de luz UV-visible a 595 nm se determinó la concentración de diversas

14 diluciones de proteínas, empleando como blanco el reactivo de Bradford. A partir de los

15 resultados de las lecturas se elaboró una curva de calibración, la cual permitió obtener la

16 ecuación para la determinación de contenido proteico obtenido a partir de dos métodos de

17 extracción (Agitación orbital y Ultrasonido) mediante el uso de 3 solventes distintos. Se

18 logró determinar que el mejor método de extracción fue mediante ultrasonido y el mejor

19 solvente fue el C.

20 Palabras clave: Extracción de proteínas, Agitación orbital, Ultrasonido, Espectrofotómetro.

21

*
Autor para la correspondencia. E-mail:gladysprado94@gmail.com
Tel. 695-109-9811

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22 Abstract:

23 The determination of a calibration curve using the Bradford method was carried out using

24 the Biomodel platform. Through the use of a UV-visible spectrophotometer at 595 nm, the

25 concentration of various protein dilutions was determined, using the Bradford reagent as

26 target. From the results of the readings a calibration curve was elaborated, which allowed to

27 obtain the equation for the determination of protein content obtained from two extraction

28 methods (orbital agitation and ultrasound) by using 3 different solvents. It was determined

29 that the best extraction method was by ultrasound and the best solvent was C.

30 Keywords: Protein extraction, Orbital shaking, Ultrasound, Spectrophotometer

31

32 1. Introducción

33 Los granos de las leguminosas son nutricionalmente importantes, como la principal fuente

34 de proteínas en la dieta del hombre que no puede comprar proteína animal, por su alto

35 costo. Además proporcionan calorías, vitaminas y minerales importantes en la nutrición

36 humana. (Gosttschalk, 1983). Sin embrago, todas las leguminosas contienen ciertos factores

37 antinutricionales los cuales inhiben parte el funcionamiento en los animales. Actualmente

38 existe una gran demanda de materias primas ricas en proteínas y carbohidratos para

39 alimentación humana y animal que además de presentar un alto valor nutricio, puedan

40 obtenerse a costos adecuados. Esta demanda crea la necesidad de desarrollar tecnologías

41 que satisfagan estos requerimientos (Cantoral y col, 1995).

42

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43 2. Marco Teórico

44 2.1 Extracción de proteínas a partir de leguminosas

45 Estudios realizados por Dickey et al. (1998); encontraron que cuando las partículas de maíz

46 obtenidos por molienda seca fueron sometidas a una extracción de las proteínas de los

47 aglomerados de almidón-proteína con alcohol al 70% en un vaso de agitación, teniendo una

48 relación de masa 4:1 (alcohol al 70% para una de maíz) por un periodo de 1-6 horas a

49 temperatura ambiente, la solución del extracto fue filtrada y centrifugada para remover

50 partículas suspendidas después de la extracción y luego diluidas a 40% de etanol para

51 precipitar extractos solubles, las medidas de las partículas de masa suspendidas separadas

52 por centrifugación indican que la mezcla de partículas de maíz con etanol disuelve y

53 debilita la proteína entre las celdas y entre los gránulos de almidón próximas a la superficie

54 de las partículas. Bajo las condiciones de este estudio partículas de maíz liberan gránulos de

55 almidón más rápidamente que la disolución de cuerpos proteicos, como el indicado por el

56 análisis de las partículas centrifugadas. Análisis de la extracción a temperatura ambiente de

57 la proteína indica, que a un tamaño de partícula de 2mm presenta más masa convectiva

58 transferida de a 20.

59 Los surfactantes pueden ser usados en la purificación de almidón. Paulis (1981) reportó que

60 el benceno dodecyl sulfatado (DBS) generalmente disminuye la proteína residual en

61 almidón, generando complejos proteína-DBS. Fuji y Tomiyana (1973) estudiaron el efecto

62 de sodio α-olefinas sulfatadas (0.1-0.5%) sobre las proteínas removibles de almidón en

63 papa. Después de 1 hora de agitación, el contenido de proteína residual de almidón

64 disminuyó a 0.08%, una reducción del 50% en el contenido de proteína residual comparado

65 con 29% reducido cuando se utiliza agua.

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66 El ultrasonido a altas intensidades fue evaluado como un método alternativa para aislar el

67 almidón de arroz sin el uso de químicos como el método tradicional de remojo alcalino. Los

68 surfactantes (SDS, SSL y Tween 80; a 0.1, 0.03 y 0.05%) combinados con una alta

69 intensidad de ultrasonido fueron también investigados para el aislamiento de almidón en

70 arroz. La harina de arroz fue sometida a sonicación por 15, 30, y 60 minutos con

71 amplitudes de 25, 50 y 75% a 40 o 50°C. El almidón producido no fue afectado

72 significativamente por el tratamiento de temperatura después del tratamiento de

73 sonificación; el contenido de proteína y almidón dañado después del aislamiento fue de 0.9-

74 1.7% y 3.3-3.5% (en base seca), respectivamente. La combinación de 0.5% de SDS y alta

75 intensidad de ultrasonido mejoran el almidón producido a 84.9% con bajo contenido de

76 proteína residual, sin embargo, poco mejoramiento fue observado con SSL o Tween 80

77 (Wang, 2004)

78 2.2 Ultrasonido

79 El uso de ondas ultrasónicas de elevada intensidad en procesos industriales se basa

80 generalmente en una explotación adecuada de una serie de mecanismos activados por la

81 energía ultrasónica tales como transferencia de calor, agitación, difusión, inestabilidad en

82 las interfases, fricción, rotura mecánica, efectos químicos, etc. Estos mecanismos son

83 empleados para producir o mejorar una amplia gama de procesos tales como soldadura de

84 plásticos y metales, mecanizado, formación de metales, atomización, emulsificación y

85 dispersión, desgasificación, extracción, desespumado, aglomeración de partículas, secado y

86 extracción de líquidos en suspensiones, reacciones sonoquímicas, etc. (Joice and Mason,

87 2008). Una característica de las ondas ultrasónicas de elevada intensidad es su capacidad

88 para trabajar de manera que actúan en sinergia con otras formas de energía estimulando,

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89 acelerando, o mejorando muchos procesos. Esta es la razón por la que varias aplicaciones

90 prácticas de los ultrasonidos no son exclusivamente procesos ultrasónicos sino procesos

91 asistidos ultrasónicamente. Tal situación es particularmente importante en aquellos

92 procesos relacionados con la industria alimentaria donde la aplicación de las ondas

93 ultrasónicas impone la utilización de una energía limpia, no contaminante

94 (Knorret’al.,2004, Chematet’al.,2011; Masonet’al.,1996).

95 2.3 Determinación de proteínas

96 Existen diferentes métodos para determinar la concentración de proteínas como: el método

97 de Sedmark y Grossberg, Biuret y Bradford, con este ultimo método las proteínas tienen

98 una capacidad de absorción máxima de 465 nm, eso cambia a 595 nm cuando el colorante

99 esta unido a las proteínas, este es el principio básico del azul de Comasie para la

100 determinación de proteínas (Zárate – Daza y col, 2004).

101 El método de Bradford cuantifica la unión de un colorante a una proteína desconocida y la

102 compara contra diferentes cantidades de una proteína estándar, usualmente albumina de

103 suero bovino (BSA) (Méndez – Rojas, 2016).

104 2.4 Cuantificación de una concentración desconocida

105 Uno de los procedimientos analíticos más usados para poder cuantificar una cantidad de

106 concentración desconocida en una muestra es la curva de calibración, que es una

107 representación grafica se mide en función de la concentración del analito y los resultados

108 que se obtengan deben de ser directamente proporcionales a la concentración del

109 compuesto (muestra), este se compara con estándares de muestras conocidas del mismo

110 compuesto y para poder realizar la curva se requiere de métodos y equipos apropiados,

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111 como el espectrofotómetro. La absorción de radiación en la zona ultravioleta y visible del

112 espectro se ha utilizado ampliamente desde hace mucho tiempo para el análisis cuantitativo,

113 las medidas se basan en la Ley de Lambert-Beer (ecuación 1) una de las ecuaciones más

114 usadas en química analítica, esta relaciona la absorción de la radiación con la concentración

115 de un compuesto en disolución (Sierra-Alonso y col, 2010)

116 A = -logT = -log I / I0 = εlC (1)

117 Donde A y T son absorbencia y transmitancia, I0 es la intensidad de la luz incidente sobre la

118 muestra, I intensidad de la luz transmitida, ε es el coeficiente de absortividad molar (L mol-


1
119 .cm-1), l camino óptico de la celda (cm) y C es la concentración de la muestra (mol/L)

120 3. Justificación

121 Los cereales son las plantas más estudiadas por su importancia agroeconómica (Kellogg,

122 2001). El maíz es la base para la elaboración de un buen número de alimentos tanto para el

123 ser humano como para los animales de cría, así como variedad de productos para las

124 industrias farmacéutica y manufacturera. Se encuentra ampliamente difundido en todas las

125 regiones naturales del país, debido a su adaptación especial a diversas condiciones

126 agroclimáticas y socioeconómicas.

127 Las proteínas de almacenamiento de las semillas de maíz, han sido investigadas

128 ampliamente en cuatro áreas principales: 1) análisis de la diversidad genética dentro y entre

129 las especies, 2) la domesticación de la planta en relación con la conservación de los

130 recursos genéticos y la descendencia, 3) estudios desde la perspectiva genómica y 4) como

131 una herramienta en la mejora de los cultivos (Ghafoor et al. 2002). Sin embargo, las

132 técnicas de extracción de proteínas siguen siendo un desafío para el análisis preciso de estas

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133 moléculas, razón por la cual son diversos los protocolos disponibles en la literatura (Ranjan

134 et al. 2012). Asimismo, existen muchos métodos para la determinación de proteínas, cada

135 uno de estos procedimientos tiene su particularidad, y el mejor solo podrá ser determinado

136 dependiendo de las concentraciones de las proteínas en las muestras (García y Vásquez,

137 1998).

138 4. Hipótesis

139 Ho: Debido a las comparaciones que realizó Wang en 2004 sobre el rendimiento de un

140 método que emplea solventes con agitación contra otro de ultrasonicación, se puede

141 predecir que el mejor método de extracción será el ultrasonido.

142 Ha: El método de ultrasonicación no será el óptimo.

143 5. Objetivo general

144 Cuantificar el contenido proteico, comparar y determinar el mejor método para la

145 extracción de proteínas totales de semillas germinadas de maíz

146 6. Objetivos específicos

147 ̶ Obtener una curva de calibración adecuada a partir del método de Bradford

148 ̶ Determinar una ecuación para la cuantificación de proteínas de los distintos

149 métodos.

150 ̶ Definir la mejor combinación de método-solvente para una extracción más eficiente

151 mediante el empleo de un análisis estadístico.

152

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154 7. Materiales y métodos

155 7.1 Materiales:

156 Todos los reactivos químicos utilizados fueron Sharlau grado analítico, y las semillas de

157 maíz (Zea mays L.) empleadas fueron variedad Amarillo ICA V-305 tipo comercial de

158 tamaño grande, producidas por Semillas del Pacífico. Se seleccionaron semillas sin daños

159 visibles y con morfología uniforme.

160 7.1.1. Germinación de las semillas de maíz

161 Las semillas de maíz previamente seleccionadas se sembraron en cajas Petri (100 x 15)

162 mm, con papel absorbente como soporte. A cada caja se le adicionaron 12.0 mL de agua

163 destilada y se colocaron en una incubadora Incucell de 222 L sin luz, a una temperatura de

164 30.1 °C ± 0.1 °C. La humedad del sistema fue de 59.00 % ± 3.39 %. Después de 48 horas,

165 las semillas se sacaron de la incubadora, se les retiró la radícula y fueron trituradas con

166 ayuda de un molino eléctrico hasta obtener un polvillo muy fino que se guardó en una bolsa

167 de sello hermético y en nevera a -20 °C para su posterior extracción.

168 7.2. Extracción de proteínas

169 Las proteínas totales fueron extraídas mediante el uso de tres solventes diferentes: solvente

170 A, TCA: ácido tricloroacético 10% (Natarajan et al. 2005); solvente B, Tris-HCl: Tris-HCl

171 0,05 M; urea 5 M; SDS (Dodecil-sulfato sódico) 0,02% y glicerol 1% (Ranjan et al. 2012);

172 solvente C, Tris-Base: Tris-Base 0,05 M; ácido cítrico monohidratado 0,007 M;

173 hidrocloruro de cisteína 0,1%; ácido ascórbico 0,1% y glicerol 1% (Ranjan et al. 2012), y

174 dos métodos extractivos diferentes, como se presenta a continuación.

175 7.2.1 Método A: Agitación orbital


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176 500 mg del polvo de la semilla se depositaron en un tubo de ensayo con 3 mL del solvente

177 de extracción (TCA (A), Tris-HCl (B) o Tris-Base (C)) y se colocaron en un agitador

178 orbital durante una hora. Al cabo de este tiempo el material se decantó obteniéndose un

179 sobrenadante y un pellet; el primero se retiró y se conservó, mientras que al segundo se le

180 adicionó una nueva porción del respectivo solvente fresco y se reextrajo dos veces más. Los

181 sobrenadantes obtenidos se unieron y se centrifugaron a 7000 rpm durante 7 minutos,

182 finalmente los extractos se aforaron a 10 mL con el solvente de extracción respectivo.

183 7.2.2 Método B: Ultrasonido

184 500 mg del polvo de la semilla se depositaron en un tubo de ensayo con 3 mL del solvente

185 de extracción (TCA, Tris-HCl o Tris-Base) y se colocaron en un equipo de ultrasonido

186 durante 20 minutos a 35 °C. Al cabo de este tiempo el material se decantó obteniéndose un

187 sobrenadante y un pellet; el primero se retiró y se conservó, mientras que al segundo se le

188 adicionó una nueva porción del respectivo solvente fresco y se reextrajo dos veces más. Los

189 sobrenadantes obtenidos se unieron y se centrifugaron a 7000 rpm durante 7 minutos,

190 finalmente los extractos se aforaron a 10 mL con el solvente de extracción respectivo.

191 7.3 Cuantificación de proteínas

192 La cuantificación se llevó a cabo mediante espectrofotometría de ultravioleta-visible,

193 aplicando las metodologías de Bradford (1976).

194 7.3.1 Materiales

195 Se utilizó el reactivo de Bradford, que contiene azul de Coomassie, metanol o isopropanol,

196 ácido fosfórico y proteínas disueltas en el reactivo, y se comparo con una proteína estándar

197 de albumina de suero bovino de concentración conocida.

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198 7.3.2 Preparación de la curva de calibración

199 Este paso se realizo en un laboratorio virtual de espectrofotómetro UV- VIS. Se calculó la

200 concentración de proteínas en la mezcla final de cada celda, sabiendo que la concentración

201 en la botella es de 800 mg/L. Se preparo una cubeta sólo con reactivo de Bradford (celda 1;

202 3 mL de Reactivo + 0 de proteína). Las celdas 2, 3 y 4 se llenaron con cantidades diferentes

203 de la disolución de proteína. Se añadieron cantidades de reactivo necesarias para ocupar un

204 volumen total de 3 mL en cada una (volumen de la celda). Se introdujo la primera cubeta

205 que sólo contenía el reactivo de Bradford en el espectrofotómetro, se ajustó la longitud de

206 onda a 595 nm y se registró el valor de la absorbancia, a esta muestra se le denominó

207 "blanco de reactivos" y sirvió para que el color propio del reactivo no se considere en la

208 determinación de proteínas, este procedimiento se realizo por triplicado.

209 Se realizó el mismo procedimiento para las celdas 2 (2 mL del reactivo de Bradford + 1 mL

210 de proteína estándar), 3 (1 mL del reactivo de Bradford + 2 mL de proteína estándar), 4 (0

211 mL del reactivo de Bradford + 3 mL de proteína estándar). Al finalizar se calcularon los

212 promedios de las absorbancias para cada cubeta y se registraron en una tabla así como

213 también se realizo la resta de las absorbancias promedio de cada una de las muestras menos

214 el blanco de reactivos, una vez obtenidos los datos se procedió a su análisis estadístico.

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219 8. Resultados y discusión.

220 Tabla 1. Tabla de datos para curva de calibración

Volúmenes 595 nm
Prot.
Celda Reactivo estándar [Proteína] Lectura 1 Lectura 2 Lectura 3 Promedio Corrección
1 3 0 0 0.002 0.003 0.007 0.004 0.004
2 2 1 266.666667 0.183 0.167 0.181 0.177 0.173
3 1 2 533.333333 0.351 0.363 0.358 0.357333333 0.353333333
4 0 3 800 0.542 0.543 0.537 0.5425 0.5385
221

222 Gráfica 1. Curva de calibración de Concentración de proteína (mg/L) vs Absorbancia


223 (nm)

0.6

0.5
y = 0.0007x - 0.0004 (ecuación 2)
R² = 0.9996
0.4
Absorbancia (nm)

0.3

0.2

0.1

0
0 200 400 600 800 1000
-0.1
224 Conc. De Proteina (mg/L)

225

226

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228

229

230

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231 Tabla 2. Concentración de proteína en germinados de maíz obtenida por los métodos de extracción

232 orbital e ultrasonido mediante tres solventes A, B y C.

MÉTODO SOLVENTE ABSORBANCIA [PROTEÍNAS] (mg/L)


Orbital A 0.558 797.7142857
Orbital A 0.547 782
Orbital A 0.534 763.4285714
Orbital B 0.565 807.7142857
Orbital B 0.584 834.8571429
Orbital B 0.559 799.1428571
Orbital C 0.571 816.2857143
Orbital C 0.59 843.4285714
Orbital C 0.578 826.2857143
Ultrasonido A 0.597 853.4285714
Ultrasonido A 0.614 877.7142857
Ultrasonido A 0.606 866.2857143
Ultrasonido B 0.619 884.8571429
Ultrasonido B 0.62 886.2857143
Ultrasonido B 0.626 894.8571429
Ultrasonido C 0.614 877.7142857
Ultrasonido C 0.63 900.5714286
Ultrasonido C 0.605 864.8571429
233 Tabla 3. Concentración de proteína por método de extracción y tipo de solvente en germinados de

234 semilla de maíz

SOLVENTE
MÉTODO
A B C
781.0476 ± 813.9047619 828.6666667
Orbital 17.16268694 a ±18.64454471 a,b ±13.72717648 b,c
865.8095238 888.6666667 881.047619
Ultrasonido ±12.14985793 d ±5.408484139 e ±18.08897135 d,e,f
235

236 Tabla 4. Concentración general por método de proteína en germinados de semilla de maíz

Método de extracción
Orbital 807.873016 ±24.37580551
Ultrasonido 878.507937 ±11.63828748
237

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238 Tabla 5. Comparación de los diferentes métodos de extracción de proteínas con los tres diferentes

239 solventes

Método de extracción
Solvente Orbital Ultrasonido
A 781.047619 865.8095238
B 813.9047619 888.6666667
C 828.6666667 881.047619
240

241 En la tabla 1 se puede se pueden apreciar los datos obtenidos mediante el método de

242 Bradford, de la cual se tomaron los datos de la concentración de proteína calculada y los

243 valores corregidos (con ayuda de las lecturas del blanco) de absorbancia para ser graficados

244 (gráfica 1). Se trazó una línea de tendencia con un valor de R2= 0.9996, lo cual indica que

245 la línea trazada para la regresión lineal es aceptable, al tender tendencia bastante cercana a

246 1, esta se puede aceptar como valor de referencia. Posteriormente a partir de la línea de

247 tendencia se obtuvo la ecuación requerida (ecuación 2) para el posterior cálculo de los

248 valores de concentración de proteína en germinados de semilla de maíz, a partir de las

249 absorbancias obtenidas por los métodos y tratamientos de orbital y ultrasonicación, valores

250 que se ven plasmados en la tabla 2.

251 En la tabla 3 se presentan los resultados de las extracciones por métodos y solventes

252 empleados, con sus respectivas desviaciones estándar y a su vez se puede apreciar que

253 existen diferencias significativas entre métodos y solventes. Los valores más elevados de

254 extracción fueron obtenidos a partir de la ultrasonicación y con el empleo del solvente C,

255 sin embargo, se puede apreciar que sin importar el uso de cualquier solvente, el método de

256 ultrasonido genera mejores resultados comparados con el método de orbital, tal y como

257 reporta Wang (2004) en sus estudios de extracción de arroz y como se puede reflejar

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258 directamente en la tabla 4. Esta superioridad es debida a que las ondas ultrasónicas tienen la

259 capacidad para trabajar actuando en sinergia con otras formas de energía estimulando,

260 acelerando, o mejorando muchos procesos, por ello hoy en día es particularmente

261 importante en aquellos procesos relacionados con la industria alimentaria (Knorret’al.,2004,

262 Chematet’al.,2011; Masonet’al.,1996).

263 En la tabla 5 se puede apreciar la comparación de los diferentes métodos de extracción de

264 proteínas con los tres diferentes solventes, para ambos casos, tanto el método de orbital

265 como el método de ultrasonicación presentan un mayor rendimiento empleando el solvente

266 C (Tris-Base). Tanto el solvente B, como el C presentan mejores rendimientos de

267 extracción porque la solución Tris además de precipitar las proteínas funcionan como

268 amortiguador, además de que interactúa con el lipopolisacárido de la membrana, lo cual

269 sirve para desestabilizar la membrana aún más y dejar expuestas las proteínas (Tan, 2018),

270 mientras que el TCA (solvente A) no posee la función amortiguadora que proteja a las

271 proteínas.

272 9. Conclusiones

273 El método de regresión empleado para la determinación de concentración de proteína

274 obtenida por diversos métodos fue efectiva, ya que la línea de regresión obtuvo un valor de

275 R2 = 0.9996, el cual representa la eficiencia del modelo en donde los valores mas cercanos

276 a 1 representan un valor eficiente.

277 Por otra parte se logró determinar cuál de los métodos empleados para la extracción fue el

278 más eficiente, así como el solvente que brinda mayor rendimiento en la extracción. Este

279 trabajo demuestra o confirma lo que investigaciones anteriores ya han determinado, que la

280 ultrasonicación es un método mayormente efectivo para la extracción de proteínas, sin

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281 embargo, aporta el conocimiento de cuál de los solventes empleados es el más efectivo

282 entre ellos.

283 10. Referencias

284 Bradford, M. M. (1976). A rapid and sensitive method for the quantitation of

285 microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye

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293 Dickey, L. C; Dallmer, M. F; Raderwonuk, E. R; Parris, N; Kurantz, M; y

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Manuscrito sometido a la Revista Mexicana de Ingeniería Química 16

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