Desarrollo de un método de aislamiento de ADN eficaz y

eficiente para Especies de Cinnamomum

Resumen

Diferentes especies de Cinnamomum son ricas en polisacáridos y metabolitos

secundarios, que dificultan el proceso de extracción de ADN. El ADN de alta calidad
es un requisito previo para cualquier estudio de biología molecular.

En este artículo presentamos un método modificado para la extracción de ADN de

alta calidad y cantidad de muestras de hojas tanto liofilizadas como no liofilizadas. El
protocolo informado difiere del procedimiento CTAB por la adición de mayor
concentración de sal y carbón activado para eliminar los polisacáridos y polifenoles.

La amplia utilidad del protocolo modificado se demostró mediante la extracción de

ADN de diferentes especies leñosas y 4 especies de Cinnamomum. Por tanto, este
protocolo también ha sido validado en diferentes especies de plantas que contienen
altos niveles de polifenoles y polisacáridos. El ADN extraído mostró una
amplificación perfecta cuando se somete a RAPD, digestión de restricción y
amplificación con primers de códigos de barras de ADN.

El protocolo de extracción de ADN es reproducible y se puede aplicar a cualquier

estudio de biología molecular de plantas.

1. Introducción

El Cinnamomum Schaeffer pertenece a la familia Lauraceae que comprende

alrededor de 250 especies de árboles y arbustos de los trópicos y subtrópicos
(Leela, 2008; Willis, 1973). El género Cinnamomum (canela) es una especie muy
popular en todo el mundo. De 26 especies distribuidas en diferentes partes de la
India (Hooker, 1885), 12 especies son registradas en la parte noreste de la India.

La canela tiene una amplia gama de usos históricos en diferentes países del mundo
y diferentes culturas. Las especies Cinnamomum zeylanicum Blume se originan en
Sri Lanka, siendo también nativas del sudeste de la India, son fuente de corteza y
hojas de canela y sus aceites esenciales. Sus cualidades únicas son el sabor,
ligeramente dulce, agradable, cálido y amargo, además de ser fuertemente
aromático. Casi todas las partes de la especie de canela se consideran un remedio
para muchas enfermedades como respiratorias, gastritis, problemas menstruales,
mala circulación, leucorrea, digestivo, diarrea, náuseas, enfermedades
ginecológicas (candidiasis vaginal), disentería.

Por importancia económica y etnobotánica mundial amplia, así como, amplia

variabilidad reportada entre las especies de Cinnamomum, la identificación basada
únicamente en características morfológicas no es suficiente. Cinnamomum necesita
una visión completa de estudios que resultarán más beneficiosos para la
humanidad. En este contexto, las técnicas moleculares, así como varios marcadores
de ADN novedosos (RAPD, RFLP, SSR, ISSR, etc.) en el campo de la biología no
solo nos ayudó a establecer una relación genética entre los miembros de diferentes
categorías taxonómicas, sino que también ayudó a estudiar de cerca la relación
genética entre variaciones genéticas inter e intraespecífica Los métodos basados ​en
ADN también tienen aplicación en la detección adulterante biológica y en la
autenticación de una amplia gama de alimentos y productos agrícolas.

La identificación de canela verdadera de especies adulterantes basada en los

rasgos físicos es muy difícil, y la situación es aún más difícil una vez que el producto
pierde su forma física (por ejemplo, polvo).

Por cierto, la corteza en polvo se usa con mayor frecuencia como saborizante de
alimentos y en medicina.

El perfil bioquímico de la planta está inmensamente influenciado por el lugar de

origen, procesamiento del tejido vegetal; edad y tipo de tejido y temporada, mientras
que el lugar de origen, el procesamiento del tejido vegetal; la edad,el tipo de tejido y
la estación no influyen en el ADN.

Los marcadores químicos son más propensos a errores, ya que deben ser
específicos para la especie, estable durante los procesos de almacenamiento y
modificación y debe representar un compuesto terapéuticamente relevante.

En los últimos años, aunque se han logrado inmensos avances en las técnicas
moleculares, hay pocos informes exitosos disponibles para el aislamiento de ácido
nucleico puro de especies vegetales que contiene un alto nivel de metabolitos
secundarios. Estos metabolitos secundarios como los polisacáridos y polifenoles
afectan gravemente el procedimiento de aislamiento al interactuar irreversiblemente
con el ácido nucleico e interferir con la función de las enzimas en el análisis
posterior. Los polisacáridos, debido a sus propiedades químicas, coprecipitan con el
ADN genómico, dando a las soluciones una apariencia viscosa, similar a un
pegamento y son conocidos por inhibir el funcionamiento adecuado de las enzimas.
Los fenoles, tales como terpenoides y taninos, experimentan una rápida oxidación al
liberarse del tejido de la hoja y unirse irreversiblemente a la columna vertebral de
fosfato del ADN, que se caracteriza por el pardeamiento del material de la hoja.
Ambos contaminantes previenen el uso de ADN con fines de biología molecular,
como PCR, digestiones de restricción o secuenciación mediante la inhibición de la
acción de polimerasas o endonucleasas. Aunque existen muchos protocolos
establecidos para aislar ADN de tejidos vegetales, aquellos con un alto contenido de
metabolitos secundarios son muy poco exitosos y reproducibles.
Un método rápido, simple, rentable y confiable es un requisito previo para cualquier
extracción de ADN y su posterior aplicación posterior. Se ha informado que la
extracción de ADN de tejidos y pasar la etapa de incipiente es problemático y
también inestable bajo almacenamiento a largo plazo.

Sin embargo, en los casos en que solo se disponga de tejidos más antiguos, se
necesita un procedimiento para la extracción selectiva de ADN. Muchos protocolos
se han utilizado en el aislamiento de ADN de plantas, pero debido a la
heterogeneidad química de las especies, la mayoría de ellas podrían aplicarse a un
número limitado de especies o incluso especies relacionadas estrechamente.

La planta Cinnamomun es rica en polifenoles y metabolitos secundarios, que son

obstáculos importantes para precipitar ácidos nucleicos purificados y en gran
cantidad. Otro problema que podría surgir durante el aislamiento del ADN de la
planta es el requisito de utilizar nitrógeno líquido para triturar el material vegetal
como se informa en la mayoría de los protocolos y la implicación de un
procedimiento prolongado. En el presente estudio se han abordado la mayoría de
las preocupaciones mencionadas anteriormente. La presente investigación, por lo
tanto, se emprende para estandarizar un protocolo para extraer ADN intacto de alta
calidad de Cinnamomum sp. a través de pruebas sobre la idoneidad de los métodos
disponibles y la necesidad de realizar modificaciones para lograr el propósito.

2. Material y métodos

Hojas tiernas y frescas de Cinnamomum impressioninervium Meissn., C. zeylanicum

Blume y Cinnamomum tamala Nees. & Eberm. fueron recolectados en bolsas con
cierre hermético de las parcelas previamente identificadas del jardín botánico
experimental de CSIR-NEIST y Assam Agricultural Universidad, Jorhat, Assam,
India. Teniendo en cuenta los criterios de recolección, se recolectaron hojas frescas
de condiciones ambientales similares para los estudios de aislamiento de ADN. Para
comparar concentraciones de ADN en hojas viejas y jóvenes, el material vegetal fue
recolectado de la misma planta. El material foliar recolectado se limpió con agua
destilada esterilizada en autoclave y la humedad externa de las hojas se dejó secar
al aire. Se utilizó parte de la muestra fresco y la otra mitad se liofilizó durante 48 hs
a 110 °C y luego se guardó en bolsas herméticas hasta su extracción.
2.1. Extracción de ADN

Para la extracción de ADN, 400 mg de las muestras de hojas liofilizadas fueron

molidas hasta convertirse en polvo en mortero estéril con polvo de sílice y muestras
en polvo transferidas directamente al tampón de extracción precalentado (NaCl 1,4
M, Tris-HCl 100 mM [pH 8,0], EDTA 20 mM [pH 8,0] y 0,2% de b-mercaptoetanol,
2% de CTAB), se mezcló cuidadosamente a mano y se incubó a 55°C durante 1 h.
con agitación periódica para evitar agregaciones.

Otro conjunto de experimentos se llevó a cabo en paralelo tomando 400 mg de

muestra de hoja fresca y se trituró la muestra hasta obtener un polvo fino con la
ayuda de nitrógeno líquido (Tabla 1). Luego, ambas muestras puestas a tierra se
incubaron en tampón de extracción precalentado a 55 °C. durante 1 h. El tampón de
extracción se estandarizó cambiando la concentración de una variable a la vez, es
decir, carbón activado, CTAB y polivinilpirrolidona (PVP). Por lo tanto, doce
tampones de extracción se prepararon, donde 0,5%, 0,7%, 1% y 3% de carbón
activado fueron mezclados con 2% CTAB y 2% PVP por separado, 1%, 2%, 3% y
4% CTAB se mezcló con 2% de PVP y 0,7% de carbón activado por separado y se
mezcló PVP al 1%, 2%, 3% y 4% con CTAB al 2% y carbón vegetal activado al 0,7%
por separado (Tabla 2). El componente restante del tampón de extracción se
mantuvo constante, es decir, 1,4 M NaCl, 100 mM Tris–HCl [pH 8,0], EDTA 20 mM
[pH 8,0] y b-mercaptoetanol al 0,2%.

Después de la incubación de las muestras en diferentes tampones de extracción, el

sobrenadante se extrajo dos veces con cloroformo: alcohol isoamílico (24: 1 v / v)
después de una centrifugación a 10.000 rpm a temperatura ambiente.

Al sobrenadante extraído se le añadió etanol preenfriado en cantidades iguales de

volumen para precipitar el ADN. La muestra se centrifugó a 14.000 rpm durante 5
min y se descartó el sobrenadante. El pellet de ADN se secó al aire durante 2 hs. y
luego se suspendió en 100 µl de 10 mg de Ribonucleasa A (Sigma R642) en tampón
TE / RNase A e incubadas a 37 ° C durante 30 min. A la solución incubada se le
agregó un volumen igual de cloroformo-alcohol isoamílico (24: 1) y se centrifugó a
12.000 g por 10 minutos. El ADN se precipitó mediante la adición de isopropanol frío
(0,5 volumen) y 100 µl de NaCl 2 M a la solución seguido de una centrifugación a
10000 rpm a 5°C. El pellet de ADN resultante se lavó con etanol al 70% y se dejó
secar al aire. El gránulo de ADN se resuspendió en 50 µl de tampón TE y se
almacenó a 5°C para más estudios.

Para conocer la amplia aplicabilidad del protocolo estandarizado, 4 especies

diferentes de plantas (Andrographis paniculata, Litsea cubeba, Azadirachta indica,
Cinnamomum camphora) se utilizaron para la extracción de ADN. Además de esto,
nuestro método de extracción de ADN estandarizado se comparó con otros cuatro
métodos convencionales para la extracción de ADN de hojas de C. tamala.

2.2. Cuantificación de ADN

La cantidad y pureza del ADN extraído fue evaluada utilizando un

bioespectrofotómetro, usando una alícuota de 3 μl de muestra de ADN del stock. La
concentración del ADN extraído se determinó utilizando la absorbancia a 260 nm y
la pureza de la muestra de ADN fue evaluada por la relación A260 / A280. También
se confirmó la pureza de las bandas de ADN por electroforesis en gel de agarosa al
0,8%. Las bandas se observaron, documentaron y analizaron mediante un sistema
de documentación en gel.

2.3. Digestión de restricción

Para comprobar la calidad del ADN de Cinnamomum extraído, también se llevó a

cabo una digestión por restricción enzimática. Esta se realizó usando 5 unidades de
EcoR I y Hind III (Thermo Scientific, Lithunia) por separado.

Brevemente, la mezcla de reacción fue preparada mediante la adición de 10 µl de

ADN extraído, 15 µl de tampón de ensayo 2, 10 µl de BSA y 3 µl de enzima de
restricción (EcoR I y Hind III). Las reacciones se llevaron a cabo a 37°C durante 2, 4
y 6 h y los productos digeridos se resolvieron en gel de agarosa al 1% y se
visualizaron a través de tinción con bromuro de etidio.
2.4. Análisis RAPD

La calidad del ADN se confirmó mediante la técnica RAPD utilizando cebadores

decamer RPI 12 (50 ACGGCAACCT30) y RPI 15 (50 AGCCTGAGCC30). El ADN
stock se diluyó a 10 ng/μl. El volumen de amplificación de RAPD PCR fue 25 μl que
contienen 1,5 μl de Taq Buffer A 10x con 15 mM MgCl2 (GeNei ™), dNTP 2,5 mM, 1
μl de primer, 1.5 μl de 1 U / μl Taq ADN polimerasa, y el volumen se ajustó
añadiendo agua bidestilada en autoclave.

La amplificación se realizó en un termociclador utilizando un programa configurado

con un paso de desnaturalización de 5 min a 94°C seguido de 35 ciclos de 30 s a
94°C, 30 s a 36°C y 1 min a 72°C. El programa terminó con un ciclo de extensión
final a 72°C durante 8 min. El producto amplificado se observó utilizando un sistema
de documentación en gel.

2.5. Código de barras de ADN

Se utilizaron cuatro juegos de cebadores de códigos de barras de ADN para la

amplificación de ADN de especies Cinnamomum. Cuatro muestras de ADN
diferentes fueron tomadas de cada una de las tres especies diferentes de
Cinnamomum a saber: C. impresioninervium, C. zeylanicum y C. tamala. Los 4
conjuntos de cebadores directos e inversos fueron:

(a) ITS5a-50 -CCTTATCATTTAGAGGAAGGA-30 ITS4-50

-TCCTCCGCTTATTGATATGC-30 )
(b) rbcL1F (50 -ATGTCACCACAAACAGAAAC-30 ) –rbcL724r (50
-TCGCATGTACCTGCAGTAGC-30 )

(c) rbcL1F (50 -ATGTCACCACAAACAG-30 ) & rbcL724r (50

-ATGTACCTGCAGTAGC-30 ) [Modified by National Botanical Research
Institute-NBRI]

(d) trnH (50 -CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-30 ) – psbA (50

-GTTATGCATGAACGTAATGCT-30)

La amplificación por PCR se realizó en un equipo térmico ciclador Veriti de 96

pocillos (Applied Biosystems) de la siguiente manera: 95°C durante 1 min, seguido
por 35 ciclos de 95°C durante 30 s, T °C durante 30 s y 68°C durante 1 min, seguido
de un paso de elongación a 68°C durante 5 min. Todas las condiciones de PCR
fueron las mismas para todos los pares de primers excepto la temperatura (T) de
annealing para diferentes pares de cebadores de la siguiente manera: 53°C-ITS5a,
53°C-ITS4, 50°C para trnH-A, 68°C para psbA, 54°C para rbcL1F y 58°C para
rbcL-724.

Se utilizó gel de agarosa (1%) para la electroforesis de productos de PCR. Las

imágenes de gel se obtuvieron usando un sistema de imágenes.

3. Resultados y discusión

El aislamiento de ADN de alta calidad de plantas medicinales y comestibles son

siempre un desafío y un requisito primordial para estudios de biología molecular. Sin
embargo, el aislamiento del ADN de muchas plantas medicinalmente y
económicamente importantes no siempre ha sido alcanzable debido a la presencia
de compuestos fenólicos y metabolitos secundarios. Se encontraron varios desafíos
durante la extracción de ADN de diferentes accesiones de C. tamala, siguiendo el
protocolo de Doyle y Doyle (1987), debido a la presencia de la alta concentración de
polisacáridos y compuestos fenólicos en el tejido foliar. El protocolo original de Doyle
y Doyle y método CTAB modificado cuando se usaron no fue posible la obtención de
ADN. Muy viscoso, pegajoso y los gránulos de color marrón eran difíciles de
manipular y el color estaba indicando contaminación por compuestos fenólicos como
se informó anteriormente en Dimorphandra mollis. La eficiencia del protocolo
informado aquí se comparó con algunos de los protocolos de extracción de ADN de
plantas de uso más común, es decir, Doyle y Doyle (1987), Lee et al. (2010),
Abeysinghe et al. (2009) y Krizˇman y col. (2006).
Estos protocolos se probaron para la extracción de ADN de hojas no liofilizadas (0,4
g) y liofilizadas (0,2 g) de C. tamala. El ADN aislado se cuantificó utilizando un
espectrofotómetro a la absorbancia de 260 y 280 nm. Entre las diferentes
concentraciones de CTAB (1%, 2%, 3% y 4%), el Buffer de extracción con 2% CTAB
dio el mejor resultado con un rendimiento de ADN de 227,56 ± 9,34 ng / mg de
muestra (Tabla 1) y produjo una banda de ADN transparente en el gel de agarosa
(Figs. 1a y b). No hubo diferencia significativa entre muestras de hojas frescas o
liofilizadas sobre la calidad y cantidad del ADN cuando se utilizó un nuevo método
modificado (Tabla 1). El protocolo informado por Abeysinghe et al. (2009) y Lee et al.
(2010) obtuvo muy baja concentración de ADN. En el protocolo de Krizˇman et al.
(2006), aunque se obtuvo una buena cantidad de ADN, la calidad se vio
comprometida. El ADN extraído con el protocolo Krizˇman et al. (2006) era muy
viscoso y lleno de mucílagos. Los datos comparativos de la relación de
concentración y absorbancia de ADN utilizando numerosos métodos estandarizados
previamente se tabularon en la Tabla 1. En esta comunicación, se hicieron pocas
modificaciones al protocolo existente de Krizˇman y col. (2006) para desarrollar un
protocolo estandarizado para alta extracción de ADN de Cinnamomum sp. Las hojas
frescas y las muestras de hojas liofilizadas produjeron una cantidad similar de ADN
(Fig. 1b y Tabla 1).

Los materiales de hojas frescas y jóvenes son la primera opción para obtener ADN
de buena calidad en plantas. Sin embargo, las hojas maduras contienen mayores
cantidades de polifenoles y polisacáridos, que hacen muy difícil aislar el ADN de
buena calidad. Sin embargo, incluso las hojas jóvenes para los estudios moleculares
son bastante desafiantes para especies como Cinnamomum.

Superar este problema utilizando el protocolo optimizado actual produjo ADN de

mejor calidad incluso a partir de muestras de hojas maduras.

No se observó fragmentación debida al cizallamiento (tensión) del ADN durante el

procedimiento de extracción en ninguna de las muestras y los resultados fueron
reproducibles. La ausencia de frotis confirma aún más la alta pureza de ADN
extraído. Se ha informado anteriormente que el cizallamiento del ADN durante la
extracción puede interferir directa o indirectamente con las reacciones enzimáticas.

El rendimiento medio del ADN a través de este protocolo modificado fue de 227.56 ±
9.34 ng / μl y se encontró que el valor de A260 / A280 fue 1.80 ± 0.09 (Tabla 1)
asegurando que las muestras de ADN estaban libres de contaminación de
metabolitos secundarios y productos químicos utilizados durante el procedimiento
de extracción y fueron amplificables en reacciones de PCR. El espectro de ADN
aislado de diferentes especies de Cinnamomum indicó la relación de onda de
absorbancia a la longitud de onda (k) 260 nm y 280 nm la cual fue 1,82. La
electroforesis en gel (agarosa al 0,8%) antes del tratamiento con RNasa indica la
presencia de impurezas (Fig. 1aM), que podrían eliminarse después del tratamiento
con RNasa. La imagen de la electroforesis en gel de agarosa después del
tratamiento con ARNasa muestra bandas claras intactas, que prueba que fue
obtenido ADN de alto peso molecular sin degradación (Fig. 1aL).

La revisión y la literatura sugirieron el uso de CTAB al 2% en el buffer de extracción,

ya que ayuda a romper la membrana celular (Bressan et al., 2014; Doyle y Doyle,
1987). Al incorporar diferentes concentraciones de CTAB (por ejemplo, 1%, 2%, 3%
y 4%) en el presente experimento, el 2% de CTAB mostró un mejor ADN con
respecto a la calidad y cantidad en comparación con otra concentración de CTAB.
Los resultados mostraron que al 2% el rendimiento de ADN de CTAB resultó ser de
169,3 ± 13 ng / μl y la relación A260 / A280 fue de 1,81 ± 0,06. Lo mismo ocurre con
CTAB al 1%, el rendimiento del ADN fue 85,46 ± 11,88 ng / μl y la relación A260 /
A280 fue 1,38 ± 0,16, con CTAB al 3%, el rendimiento de ADN fue de 169,3 ± 20,43
ng / μl y la relación A260 / A280 fue de 1,26 ± 0,12 y CTAB al 4%, el rendimiento de
ADN fue de 91,46 ± 3,75 ng / μl y la relación A260 / A280 fue 1,41 ± 0,05 (Tabla 2).

La polivinilpirrolidona (PVP) es un agente importante para eliminar los polifenoles

mediante la formación de enlaces de hidrógeno complejos con polifenoles y
separación eficaz del ADN (Kit y Chandran, 2010).

En el buffer de extracción, todos los componentes se mantuvieron constantes y la

concentración de PVP se cambió para ver su efecto en la extracción de ADN. En
nuestro experimento, usamos 1%, 2%, 3% y 4% PVP, respectivamente (Tabla 2).
Khanuja y col. (1999) también utilizó diferentes concentraciones de PVP para
plantas con alto contenido de metabolitos secundarios como polifenol y
polisacáridos. En la presente investigación, la adición de 2% PVP produjo la calidad
y cantidad óptima de ADN. En nuestros resultados, se obtuvo aproximadamente
141,73 ± 9,86 ng / μl y la relación A260 / A280 fue de 1,65 ± 0,11 cuando se utilizó
PVP al 2%. Asimismo al 1% PVP se obtuvo 92,56 ± 6,9 ng / μl y una relación A260 /
A280 de 1,52 ± 0,09, el 3% de PVP obtuvo 85,1 ± 5,9 ng / μl y la relación A260 /
A280 1,32 ± 0,04, y al 4% PVP produjeron 96,1 ± 14,29 ng / μl y la relación A260 /
A280 1,50 ± 0,07 (Tabla 2).

Lade y col. (2014) mencionó que la calidad del ADN disminuye cuando se
incrementa la concentración de PVP y por lo tanto confirma que nuestro resultado
fue exacto.
El ADN genómico intacto y de alta calidad (Figs. 1b yc) obtenido podría atribuirse al
uso de una concentración más alta de PVP (2.5%) con un peso molecular más bajo
(10,000) en lugar de 40.000 (Tabla 2). Varios trabajadores (Chaudhry, Yasmeen
Husnain y Riazuddin, 1999; Couch & Fritz, 1990) han recomendado el uso de PVP
con un peso molecular de 10.000 al 2% (p / v) para abordar la alta concentración de
fenólicos presentes en el tejido vegetal. El PVP con bajo peso molecular tiene
menos tendencia de precipitar con los ácidos nucleicos en comparación con PVP
con alto peso molecular produciendo así una cantidad suficiente de ADN libre de
polifenoles (Krizˇman et al., 2006; Zhang & Stewart, 2000).

La principal modificación que resultó fructífera en el procedimiento de extracción de

ADN de Cinnamomum sp. fue el uso de carbón activado, alta concentración de
CTAB (2.5%) y precipitación del ADN bajo la influencia de alto contenido de sal (2 M
NaCl). El carbón activado se une a las sustancias resinosas y por lo tanto se asienta
junto con los desechos en la capa de interferencia entre el buffer y el cloroformo.
Además de PVP, el carbón vegetal activado también juega un papel fundamental, ya
que puede absorber materia resinosa e impurezas coloreadas en la fase acuosa.
Varias publicaciones sugirieron que el uso de carbón activado con PVP en el buffer
de extracción ayuda a eliminar el polifenol de manera más eficiente.

Krizˇman y col. (2006) obtuvieron ADN de alta calidad utilizando carbón activado al
0,5% en el tampón de extracción. En la presente investigación, 0.7% (p / v) de
carbón activado demostró ser suficiente para lograr ADN de alta calidad. La
incorporación de carbón activado en el buffer de extracción antes de que la muestra
se incube en el baño de agua mejoró en gran medida la concentración de ADN, y la
la razón más apropiada para esto podría ser la prevención de la interacción
irreversible del ADN con polifenoles ya que entra en contacto con carbón vegetal en
vez de ADN. En nuestro experimento, el carbón activado al 0,5% produjo 148,2 ±
10,9 ng / μl y una relación A260 / A280 de 1,66 ± 0,04, 0,7% de carbón activado
produjo 162,8 ± 10,35 ng / μl y una relación A260 / A280 de 1,83 ± 0,05, 1% de
carbón activado obtuvo 122,1 ± 18,68 ng /μl , y la relación A260 / A280 de 1,58 ±
0,06 y el 3% de carbón activado rindieron 122 ± 26,09 ng / μl y la relación A260 /
A280 de 1,44 ± 0,11 (Tabla 2).
Se probó la amplia utilidad del protocolo extrayendo ADN de diferentes especies de
plantas (Cuadro 3). Usando este protocolo, el ADN fue extraído de A. paniculata, L.
cubeba, A. indica y C. camphora y C. tamala. Todas estas cuatro especies
produjeron una gran cantidad y calidad de ADN (Tabla 3). A. paniculata, L. cubeba,
A. indica, C. camphora y C. tamala rindieron 501,66 ± 76,53 ng / μl, 439,4 ± 18,53
ng / μl, 341,36 ± 30,18 ng / μl, 317,4 ± 25,97 ng / μl y 568,6 ± 42,73 ng / μl de ADN,
respectivamente. Este protocolo también funcionó bien para diferentes especies de
Cinnamomum (C. tamala, C. impresioninervium, C. zeylanicum). Usando este
protocolo se extrajo ADN de buena calidad y cantidad genómica de todas las
especies en estudio, que son por lo demás especies muy difíciles para la extracción
de ADN (Fig. 1c). Los ADN extraídos de C. tamala, C. impresioninervium y C.
zeylanicum fueron de 246,82 ng / μl , 190,21 ng / μl y 257,80 ng / μl,
respectivamente.
La digestión completa tanto con la enzima de restricción (EcoR 1 y Hind III)
confirmaron la pureza del ADN (Fig. 2a). Una alta pureza de ADN se requiere para
PCR y otras técnicas basadas en PCR, como ADN polimórfico amplificado al azar
(RAPD), análisis de microsatélites y macrosatélites, polimorfismo de longitud de
fragmentos de restricción (RFLP) y polimorfismo de longitud de fragmento
amplificado (AFLP) utilizado para el mapeo del genoma y la toma de huellas
dactilares de ADN (Sharma y Purohit, 2012). El ADN extraído por este método
produjo bandas puntuables y reproducibles que demuestran su idoneidad para
aplicaciones de PCR utilizando RAPD, lo que demuestra que no hay contaminación
de PCR por productos inhibidores (Fig. 2b). El problema que surge principalmente
en la extracción de ADN se debe a la presencia de agentes con mayor contenido de
compuestos polifenólicos, resinas, látex, polisacáridos y taninos presentes en la
célula como metabolitos secundarios que generalmente coprecipitan con el ADN e
interfieren con la actividad del enzima ADN polimerasa. La presencia y la
concentración de estos compuestos varían considerablemente de una planta a otra.
Este protocolo está diseñado principalmente para Cinnamomum sp., que contiene
concentraciones muy altas de polisacáridos, pero también podría usarse para
plantas similares con éxito.

Los códigos de barras de ADN eficaces dependen de la calidad del material

biológico. Seguir este sencillo protocolo de muestreo asegurará una adecuada
conservación de muestras biológicas para estudios de ADN. Los códigos de barras
de ADN, usando una secuencia de genes corta de una región estandarizada del
genoma, son una herramienta de identificación de especies que no solo ayuda al
descubrimiento de especies, sino que también tiene aplicaciones que van desde
estudios de biodiversidad a gran escala hasta la identificación de un único
fragmento de material en contextos forenses. Para cumplir esta visión es necesario
que exista un sistema universal, relativamente barato y escalable.

Usamos la combinación del primer rbcL + matK y trnH-psbA para verificar la calidad
de Cinnamomum sp. ADN aislado usando nuestro modificado protocolo (Fig. 2c).
Toda la combinación de primers y en todas las Cinnamomum sp. mostraron la
amplificación de ADN probando la alta calidad del ADN aislado. El subconjunto ITS1
produjo un amplicón consistentemente más pequeño con menos productos de
amplificación de artefactos y exhibió niveles más altos de divergencia de secuencia
en relación con ITS2 y, por lo tanto, fue seleccionado para nuevos juicios contra el
otro loci. Se utilizó un conjunto de 3 cebadores directos e inversos diferentes para
ITS1 que fueron luego evaluados en todas las combinaciones posibles en las 4
especies de prueba, y se eligió un par de cebadores de consenso y se aplicó a todo
el taxón establecido para el experimento empírico.
Con base en estos hallazgos, se puede concluir que este protocolo proporciona
ADN nuclear que tiene poca o ninguna coloración visible; posee un valor
espectrofotométrico A260 / A280> 1.8, tiene un ADN o al menos la longitud media
del fragmento superior a 10 kb.

Además, el protocolo se puede utilizar para aislar ADN de hojas jóvenes de las
plantas, así como los tejidos más jóvenes, incluidas las plántulas, y funciona bien
con tejido congelado, que es adecuado en condiciones en las que el nitrógeno
líquido no está disponible. El protocolo también se puede aplicar a otras plantas
medicinales con tejidos maduros ricos en polisacáridos y compuestos polifenólicos.