NOTA

MÉTODO RÁPIDO, ECONÓMICO Y CONFIABLE DE, MINI PREPARACIÓN DE

ADN
PARA AMPLIFICACIONES POR RAPD EN BANCOS DE GERMOPLASMA

Asia Y. Zambrano*, Jhonny R. Demey**, Gustavo Martínez*,

Francia Fuenmayor*, Zulay Gutiérrez*,
Gustavo Saldaña* y María Torrealba*

*Investigadores. INIA. Centro Nacional de Investigaciones Agropecuarias.

Unidad de Biotecnología. Av. Universidad, vía El Limón.
Apdo. 4521. Maracay -2101, estado Aragua. Venezuela.
**Consultor. TI-GC. Apdo. 4521. Maracay 2101. Venezuela.

RECIBIDO: enero 14, 2002.

RESUMEN

Existen numerosos métodos de extracción de ADN desarrollados para diferentes

especies de plantas, sin embargo, la mayoría requieren una alta inversión de
tiempo, material vegetal y reactivos, o producen bajo rendimiento de ADN. Cuando
se trabaja con un gran número de plantas, como es el caso de los bancos de
germoplasma, se requiere un método rápido y eficiente de extracción que
produzcan ADN de alta calidad. La metodología de extracción de ADN descrita es
rápida, sencilla y permite la obtención de ADN genómico de buena calidad, libre de
compuestos secundarios, proteínas y polifenoles que coprecipitan con el ADN, los
cuales inhiben la reacción de amplificación de ADN. Produce entre 15-25 μg de ADN
por 100 mg de tejido fresco. La calidad de ADN fue validada a través de su
consistente amplificación usando la técnica de RAPD
en Saccharum spp., Musa sp., yManihot esculenta. El tiempo requerido para la
extracción de ADN fue reducido a un 40% y su costo y nivel de toxicidad a un 50%,
comparado con los métodos utilizados normalmente.

Palabras Clave: Extracción de ADN; RAPD; Saccharum spp.; Musa sp.; Manihot
esculenta.

INTRODUCCIÓN

Las técnicas de biología molecular son normalmente laboriosas, con alto

requerimiento de tiempo y dinero, siendo esto particularmente cierto cuando se
trata de la extracción de ADN. El análisis de ADN genómico de plantas es realizado
frecuentemente a través de aplicaciones de la reacción en cadena de la polimerasa
(PCR), reduciendo la necesidad del aislamiento de grandes cantidades de ADN.

Numerosos métodos, entre otros los descritos por Dellaporta et al. (1983),
Guillemaut y Marechal (1992), Honeycutt et al (1992), Hoisington et al. (1994),
Harvey y Botha (1996), Aljanabi y Martínez (1997) y Chen y Ronald (1999) han
sido desarrollados para diferentes especies de plantas, sin embargo, la mayoría
requieren una alta inversión de tiempo, material vegetal y reactivos, o producen
bajo rendimiento de ADN.
Cuando se trabaja con un gran número de plantas como es el caso de los bancos de
germoplasma se requiere un método rápido y eficiente de extracción que produzcan
ADN de alta calidad.

En este trabajo se describe un protocolo modificado de extracción de ADN descrito

por el CIAT (1999) para Pyricularia grisea, relativamente sencillo, económico, que
produce alta cantidad de ADN de buena calidad en Saccharum spp., Musa sp.,
y Manihot esculentapara ser usado en la amplificación aleatoria de ADN polimórfico
(RAPD), y que puede ser realizado completamente en 50 muestras por una persona
en un día.

MATERIALES Y MÉTODOS

Material vegetal

Se utilizó tejido foliar joven de Saccharum spp., Musa sp., y Manihot esculenta, al
cual se le realizó el procedimiento modificado de extracción de ADN descrito por el
CIAT (1999) para Pyricularia grisea en arroz.

Protocolo de extracción de ADN

1. Pulverizar con nitrógeno líquido tejido foliar joven recién cortado.

2. En un tubo eppendorf de 1,5 ml colocar material vegetal pulverizado hasta la

marca de 500 μl y resuspender con 750 μl de buffer CTAB (2X), (2% de CTAB, 100
mM de tris base pH 8,0, 10 mM de EDTA y 0,7 M de NAC1 agregar agua hasta 500
ml y autoclavar). Adicionar 30 μl de 2-β mercaptoetanol. Agitar suavemente e
incubar por 30 minutos a 65 ºC.

3. Agregar 300 μl de acetato de potasio (3 M, pH 4,8), mezclar suavemente e

incubar en hielo por 15 min. Centrifugar 10 min a 14 000 rpm y transferir el
sobrenadante a otro tubo.

4. Adicionar 500 μl de cloroformo: alcohol isoamílico (24:1), mezclar suavemente

por inversión del tubo y centrifugar 10 min a 14 000 rpm.

5. Cuidadosamente pipetear la fase superior en tubo con 500 μl de Isopropanol frío

para precipitar el ADN. Incubar en hielo durante 60 min.

6. Centrifugar en 5 min a 14 000 rpm y descartar el sobrenadante.

7. Lavar el pellet de ADN dos veces con 500 μl de Etanol al 70% frío. Descartar el
Etanol y permitir que el ADN se seque al aire libre por 30 min.

8. Resuspender el ADN en 30 a 50 μl de buffer TE (10 mM de Tris-HC1, 1mM de

EDTA pH 8,4) o agua estéril y almacenar a -20 ºC.

Cuantificación de ADN

La calidad del ADN fue determinada a través de la relación de absorbancia

A260/A280. La concentración de ADN se evaluó en geles de agarosa al 1% por
comparación con marcadores estándar de ADN de λ no digerido, visualizados con
Bromuro de Etídio bajo luz UV.
Validación de la calidad de ADN a través su amplificación por RAPD

Una vez extraído y cuantificado el ADN se procedió a su validación a través de la

amplificación con iniciadores aleatorios, utilizando 15 μl de mezcla de reacción
constituida por 1,5 μl de Buffer B 10X, 3 mM de MgC12, 0,2 mM de cada uno de los
dNTPs, 1μM de primer, 0,5 U de Taq y 15 ng de ADN.

La amplificación fue realizada en un Termociclador MJ Research PTC 200,

empleando un ciclo de desnaturalización inicial a 94 ºC por 5 min, seguido de 45
ciclos de amplificación a 94 ºC por 1 min, 36 ºC por 30 seg, y 72 ºC por 2 min, y
un ciclo final de extensión a 72 ºC por 7 min. La separación de los productos de
PCR se realizó en geles de agarosa 1,2% corridos Por 2 h a 80 W y visualizados con
Bromuro de Etídio bajo luz UV.

RESULTADOS Y DISCUSIÓN

La metodología de extracción de ADN descrita es rápida, sencilla y permite la

obtención de ADN genómico de buena calidad, libre de compuestos secundarios que
atrapan el ADN en una matriz gelatinosa (Guillemaut y Marechal, 1992) y de
proteínas y polifenoles que coprecipitan con el ADN (Demeke y Adams, 1992; Do y
Adams, 1991) los cuales inhiben la reacción de amplificación de ADN (Pandey et al.,
1996).

La Figura 1 muestra de izquierda a derecha ADN de Saccharum spp., en la

primera fila, deMusa sp., en la segunda fila y de Manihot esculentum en la
tercera fila, donde se puede estimar visualmente 100 ng/μl por
comparación con ADN de λ no digerido. La metodología de extracción
descrita produce alto rendimiento de ADN entre 15-25 μg por 100 mg de
tejido fresco, estable, con una relación A260/A280 entre 1,83 y 1,96 lo que
sugiere que el ADN aislado esta libre de proteínas.

La calidad del ADN fue validada a través de su amplificación, siendo

consistentemente amplificable a través de la técnica de RAPD utilizando 20
oligonucleótidos de OPERON lo cual se muestra en las Figura 2, se observan los
patrones generados por los productos de amplificación con 14 oligonucleótidos
para Saccharum spp., (Figura 2a), con 16 oligonucleótidos para Musa sp., (Figura
2b) y con 20 oligonucleótidos para Manihot esculenta (Figura 2c), generándose en
las tres especies productos de amplificación que oscilan entre 200 y 1 750 pb.

No se requirió una segunda precipitación de proteínas y polifenoles con Cloroformo

así como la purificación final con Fenol lo que reduce el uso de estos reactivos de
alto riesgo.

El tiempo requerido para la extracción de ADN fue reducido a un 40% y su costo y

su nivel de toxicidad a un 50%, comparado con los métodos utilizados
normalmente.

En el Cuadro, se compara basados en el protocolo la metodología propuesta con las

de Doyle y Doyle (1987) y Dellaporta et al. (1983) de uso común en yuca, musa y
caña, respectivamente.
 FIGURA 1. Análisis electroforético de la calidad de ADN extraído en
(a) Saccharum spp. (b)Musa sp. sp., (c) Manihot esculenta, comparado con 100 mg de ADN de
λ no digerido (Primera columna de la izquierda).

FIGURA 2. Patrones de ADN polimórfico de Saccharum spp. (a), Musa sp. (b) y Manihot esculenta
(c). Oligonucleóticos: OPA01, OPA02, OPA04, OPA07, OPA10, OPA11, OPA17, OPA18, OPA19,
OPA01 (primera fila de izquierda a derecha) y OPB06, OPB07, OPC13, OPC15, OPE02, OPF13,
OPF14, OPM04, OPM14, y OPM20 (segunda fila de izquierda aderecha).

CUADRO. Comparación entre metodologías de extracción.

Doyle y Doyle Dellaporta et al. Método
Protocolo
(1987) (1983) propuesto
Tejido vegetal 3g 2g ~1g
Tiempo >1 día >1 día 3 horas
Lisis CTAB 5X SDS CTAB 2X
Purificación de Cloroformo Intercambio aniónico (columna de
Cloroformo
ADN fenol Miracloth)

Esta metodología de extracción de ADN ha sido usada en la obtención

consistente de ADN de alta calidad no sólo en las especies señaladas, sino
también en Zea mays L., Phaseolus vulgaris y anacardium occidentale.

SUMMARY

Numerous method for extraction of DNA have been developed for different
plant species, however, the majority require a high investment of time,
plant material and reagents, or produce low yields of DNA. When working
with a great number of plants as with germoplasm collections, a fast and
efficient method of extraction to produce DNA of high quality is required.
The methodology describes for DNA extraction is fast, simple and renders
genomic DNA of good quality, free of secondary compounds, proteins and
polyphenols that coprecipitate with the DNA inhibiting the reaction of DNA
amplification. Methodology produced between 15-25 μg per 100 mg of
fresh tissue. Quality of DNA was validated through its consistent
amplification using RAPD technique in Saccharum spp., Musa sp.,
and Manihot esculenta. Time required for DNA extraction was reduced to a
40% and its cost and level of toxicity to 50%, compared with other
commonly used methods.

Key Words: DNA extracción; RAPD; Saccharum spp.; Musa sp.; Manihot
esculenta.

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