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1. Introducción
La canela tiene una amplia gama de usos históricos en diferentes países del mundo
y diferentes culturas. Las especies Cinnamomum zeylanicum Blume se originan en
Sri Lanka, siendo también nativas del sudeste de la India, son fuente de corteza y
hojas de canela y sus aceites esenciales. Sus cualidades únicas son el sabor,
ligeramente dulce, agradable, cálido y amargo, además de ser fuertemente
aromático. Casi todas las partes de la especie de canela se consideran un remedio
para muchas enfermedades como respiratorias, gastritis, problemas menstruales,
mala circulación, leucorrea, digestivo, diarrea, náuseas, enfermedades
ginecológicas (candidiasis vaginal), disentería.
Por cierto, la corteza en polvo se usa con mayor frecuencia como saborizante de
alimentos y en medicina.
Los marcadores químicos son más propensos a errores, ya que deben ser
específicos para la especie, estable durante los procesos de almacenamiento y
modificación y debe representar un compuesto terapéuticamente relevante.
En los últimos años, aunque se han logrado inmensos avances en las técnicas
moleculares, hay pocos informes exitosos disponibles para el aislamiento de ácido
nucleico puro de especies vegetales que contiene un alto nivel de metabolitos
secundarios. Estos metabolitos secundarios como los polisacáridos y polifenoles
afectan gravemente el procedimiento de aislamiento al interactuar irreversiblemente
con el ácido nucleico e interferir con la función de las enzimas en el análisis
posterior. Los polisacáridos, debido a sus propiedades químicas, coprecipitan con el
ADN genómico, dando a las soluciones una apariencia viscosa, similar a un
pegamento y son conocidos por inhibir el funcionamiento adecuado de las enzimas.
Los fenoles, tales como terpenoides y taninos, experimentan una rápida oxidación al
liberarse del tejido de la hoja y unirse irreversiblemente a la columna vertebral de
fosfato del ADN, que se caracteriza por el pardeamiento del material de la hoja.
Ambos contaminantes previenen el uso de ADN con fines de biología molecular,
como PCR, digestiones de restricción o secuenciación mediante la inhibición de la
acción de polimerasas o endonucleasas. Aunque existen muchos protocolos
establecidos para aislar ADN de tejidos vegetales, aquellos con un alto contenido de
metabolitos secundarios son muy poco exitosos y reproducibles.
Un método rápido, simple, rentable y confiable es un requisito previo para cualquier
extracción de ADN y su posterior aplicación posterior. Se ha informado que la
extracción de ADN de tejidos y pasar la etapa de incipiente es problemático y
también inestable bajo almacenamiento a largo plazo.
Sin embargo, en los casos en que solo se disponga de tejidos más antiguos, se
necesita un procedimiento para la extracción selectiva de ADN. Muchos protocolos
se han utilizado en el aislamiento de ADN de plantas, pero debido a la
heterogeneidad química de las especies, la mayoría de ellas podrían aplicarse a un
número limitado de especies o incluso especies relacionadas estrechamente.
2. Material y métodos
3. Resultados y discusión
Los materiales de hojas frescas y jóvenes son la primera opción para obtener ADN
de buena calidad en plantas. Sin embargo, las hojas maduras contienen mayores
cantidades de polifenoles y polisacáridos, que hacen muy difícil aislar el ADN de
buena calidad. Sin embargo, incluso las hojas jóvenes para los estudios moleculares
son bastante desafiantes para especies como Cinnamomum.
El rendimiento medio del ADN a través de este protocolo modificado fue de 227.56 ±
9.34 ng / μl y se encontró que el valor de A260 / A280 fue 1.80 ± 0.09 (Tabla 1)
asegurando que las muestras de ADN estaban libres de contaminación de
metabolitos secundarios y productos químicos utilizados durante el procedimiento
de extracción y fueron amplificables en reacciones de PCR. El espectro de ADN
aislado de diferentes especies de Cinnamomum indicó la relación de onda de
absorbancia a la longitud de onda (k) 260 nm y 280 nm la cual fue 1,82. La
electroforesis en gel (agarosa al 0,8%) antes del tratamiento con RNasa indica la
presencia de impurezas (Fig. 1aM), que podrían eliminarse después del tratamiento
con RNasa. La imagen de la electroforesis en gel de agarosa después del
tratamiento con ARNasa muestra bandas claras intactas, que prueba que fue
obtenido ADN de alto peso molecular sin degradación (Fig. 1aL).
Lade y col. (2014) mencionó que la calidad del ADN disminuye cuando se
incrementa la concentración de PVP y por lo tanto confirma que nuestro resultado
fue exacto.
El ADN genómico intacto y de alta calidad (Figs. 1b yc) obtenido podría atribuirse al
uso de una concentración más alta de PVP (2.5%) con un peso molecular más bajo
(10,000) en lugar de 40.000 (Tabla 2). Varios trabajadores (Chaudhry, Yasmeen
Husnain y Riazuddin, 1999; Couch & Fritz, 1990) han recomendado el uso de PVP
con un peso molecular de 10.000 al 2% (p / v) para abordar la alta concentración de
fenólicos presentes en el tejido vegetal. El PVP con bajo peso molecular tiene
menos tendencia de precipitar con los ácidos nucleicos en comparación con PVP
con alto peso molecular produciendo así una cantidad suficiente de ADN libre de
polifenoles (Krizˇman et al., 2006; Zhang & Stewart, 2000).
Krizˇman y col. (2006) obtuvieron ADN de alta calidad utilizando carbón activado al
0,5% en el tampón de extracción. En la presente investigación, 0.7% (p / v) de
carbón activado demostró ser suficiente para lograr ADN de alta calidad. La
incorporación de carbón activado en el buffer de extracción antes de que la muestra
se incube en el baño de agua mejoró en gran medida la concentración de ADN, y la
la razón más apropiada para esto podría ser la prevención de la interacción
irreversible del ADN con polifenoles ya que entra en contacto con carbón vegetal en
vez de ADN. En nuestro experimento, el carbón activado al 0,5% produjo 148,2 ±
10,9 ng / μl y una relación A260 / A280 de 1,66 ± 0,04, 0,7% de carbón activado
produjo 162,8 ± 10,35 ng / μl y una relación A260 / A280 de 1,83 ± 0,05, 1% de
carbón activado obtuvo 122,1 ± 18,68 ng /μl , y la relación A260 / A280 de 1,58 ±
0,06 y el 3% de carbón activado rindieron 122 ± 26,09 ng / μl y la relación A260 /
A280 de 1,44 ± 0,11 (Tabla 2).
Se probó la amplia utilidad del protocolo extrayendo ADN de diferentes especies de
plantas (Cuadro 3). Usando este protocolo, el ADN fue extraído de A. paniculata, L.
cubeba, A. indica y C. camphora y C. tamala. Todas estas cuatro especies
produjeron una gran cantidad y calidad de ADN (Tabla 3). A. paniculata, L. cubeba,
A. indica, C. camphora y C. tamala rindieron 501,66 ± 76,53 ng / μl, 439,4 ± 18,53
ng / μl, 341,36 ± 30,18 ng / μl, 317,4 ± 25,97 ng / μl y 568,6 ± 42,73 ng / μl de ADN,
respectivamente. Este protocolo también funcionó bien para diferentes especies de
Cinnamomum (C. tamala, C. impresioninervium, C. zeylanicum). Usando este
protocolo se extrajo ADN de buena calidad y cantidad genómica de todas las
especies en estudio, que son por lo demás especies muy difíciles para la extracción
de ADN (Fig. 1c). Los ADN extraídos de C. tamala, C. impresioninervium y C.
zeylanicum fueron de 246,82 ng / μl , 190,21 ng / μl y 257,80 ng / μl,
respectivamente.
La digestión completa tanto con la enzima de restricción (EcoR 1 y Hind III)
confirmaron la pureza del ADN (Fig. 2a). Una alta pureza de ADN se requiere para
PCR y otras técnicas basadas en PCR, como ADN polimórfico amplificado al azar
(RAPD), análisis de microsatélites y macrosatélites, polimorfismo de longitud de
fragmentos de restricción (RFLP) y polimorfismo de longitud de fragmento
amplificado (AFLP) utilizado para el mapeo del genoma y la toma de huellas
dactilares de ADN (Sharma y Purohit, 2012). El ADN extraído por este método
produjo bandas puntuables y reproducibles que demuestran su idoneidad para
aplicaciones de PCR utilizando RAPD, lo que demuestra que no hay contaminación
de PCR por productos inhibidores (Fig. 2b). El problema que surge principalmente
en la extracción de ADN se debe a la presencia de agentes con mayor contenido de
compuestos polifenólicos, resinas, látex, polisacáridos y taninos presentes en la
célula como metabolitos secundarios que generalmente coprecipitan con el ADN e
interfieren con la actividad del enzima ADN polimerasa. La presencia y la
concentración de estos compuestos varían considerablemente de una planta a otra.
Este protocolo está diseñado principalmente para Cinnamomum sp., que contiene
concentraciones muy altas de polisacáridos, pero también podría usarse para
plantas similares con éxito.
Usamos la combinación del primer rbcL + matK y trnH-psbA para verificar la calidad
de Cinnamomum sp. ADN aislado usando nuestro modificado protocolo (Fig. 2c).
Toda la combinación de primers y en todas las Cinnamomum sp. mostraron la
amplificación de ADN probando la alta calidad del ADN aislado. El subconjunto ITS1
produjo un amplicón consistentemente más pequeño con menos productos de
amplificación de artefactos y exhibió niveles más altos de divergencia de secuencia
en relación con ITS2 y, por lo tanto, fue seleccionado para nuevos juicios contra el
otro loci. Se utilizó un conjunto de 3 cebadores directos e inversos diferentes para
ITS1 que fueron luego evaluados en todas las combinaciones posibles en las 4
especies de prueba, y se eligió un par de cebadores de consenso y se aplicó a todo
el taxón establecido para el experimento empírico.
Con base en estos hallazgos, se puede concluir que este protocolo proporciona
ADN nuclear que tiene poca o ninguna coloración visible; posee un valor
espectrofotométrico A260 / A280> 1.8, tiene un ADN o al menos la longitud media
del fragmento superior a 10 kb.
Además, el protocolo se puede utilizar para aislar ADN de hojas jóvenes de las
plantas, así como los tejidos más jóvenes, incluidas las plántulas, y funciona bien
con tejido congelado, que es adecuado en condiciones en las que el nitrógeno
líquido no está disponible. El protocolo también se puede aplicar a otras plantas
medicinales con tejidos maduros ricos en polisacáridos y compuestos polifenólicos.