LABORATORIO DE BIOQUÍMICA 502507

Práctica presencial (noviembre 2020)

VERIFICACIÓN DE ACTIVIDAD DE ENZIMAS MITOCONDRIALES.

I.EL PROBLEMA.

Verificar en tejidos animales la actividad in vitro de las proteínas más importantes para el
metabolismo energético, las enzimas y reconocer el efecto de los inhibidores sobre estas.

1.1 FUNDAMENTO TEÓRICO.

La mitocondria es el organelo citoplasmático en donde se lleva a cabo la respiración celular

representada en vías metabólicas como el ciclo de Krebs y la fosforilación oxidativa. Posee dos
membranas: la externa altamente permeable por proteínas de membrana llamadas porinas y la
interna con pliegues o crestas y de permeabilidad alatemnte selectiva (ver figura 1).

Figura 1. La mitocondria
El ciclo de Krebs

Es una ruta aerobia cuyos complejos multienzimáticos se encuentran localizados en la matriz

mitocondrial con excepción de la succínico deshidrogenasa proteína integral de la membrana
interna.

Este proceso metabólico permite la descarboxilación de los esqueletos carbonados que le llegan
en forma de Acetil CoA, provenientes de diferentes compuestos (carbohidratos, ácidos grasos,
aminoácidos). Esta vía metabólica oxidativa está asociada a la reducción de las coenzimas FAD y
NAD+, que finalmente ingresan a la cadena de transporte electrónico para su reoxidación (ver
figura 2).

Figura 2. Ciclo de Krebs

Acción de la succínico deshidrogenasa.

La succínico deshidrogenasa, succinato deshidrogenasa o complejo II es una enzima que remueve

dos protones y dos electrones del succinato para dar origen al fumarato, oxidación asociada a la
coenzima FAD+, que transfiere los electrones a la cadena de transporte electrónico. Este proceso
lo inhibe en forma competitiva la presencia de otros ácidos dicarboxílicos como el malonato,
oxalacetato y oxalato, los cuales se unen fuertemente al sitio activo de la enzima, situación que
genera la acumulación de succinato.

El proceso se puede observar in vitro mediante el uso de un aceptor electrónico artificial como el
azul de metileno que es coloreado en su estado oxidado e incoloro cuando se reduce, en la medida
que se reoxida la coenzima FAD. Cuando éste indicador de oxido – reducción se encuentra en
contacto con el O2 del aire se reoxida tomando de nuevo la coloración azul y formando peróxido de
hidrógeno. Cuando el azul de metileno se encuentra en contacto con el oxígeno del aire, se reoxida
tomando la coloración azul y formando peróxido de hidrógeno, por esta razón el sistema se aísla
mediante una capa de aceite mineral.
La cadena de transporte de electrones y la fosforilación oxidativa

La cadena de transporte de electrones o cadena respiratoria como parte de la fosforilación

oxidativa es un proceso que se lleva a cabo en la membrana interna mitocondrial y está constituido
por una serie de complejos enzima-coenzima de oxidorreductasas y ferroproteínas. (ver figura 3)

A través de la cadena de transporte de electrones se realiza la reoxidación de las coenzimas

NADH+ H+ y FADH2 producidas en las rutas catabólicas, ya que permite el transporte de los
electrones hasta el O2, que es el aceptor final reduciéndose para formar agua.

Este flujo de electrones es exergónico por esto tres complejos enzimáticos de la cadena
respiratoria utilizan la energía liberada para bombear protones al espacio intermembrana de las
mitocondrias, generando un potencial electroquímico que pormueve después el regreso de los
protones a la matriz mitocondrial y la síntesís de ATP através del complejo V o la ATP sintasa.

Acción de la citocromo oxidasa.

El complejo citocromo oxidasa o complejo IV es el componente final de la cadena respiratoria y

está constituido por el citocromo a y a3 y dos iones Cu ++. Aproximadamente el 90% del consumo
celular del oxígeno se debe a la acción de este complejo que cataliza la reducción del oxígeno para
formar agua.

Figura 3. Cadena de transporte de electrones y la fosforilación oxidativa

Esta enzima es sensible a la presencia de aceptores más fuertes como es el caso de ión cianuro
(CN-), azida (N3-), monóxido de carbono (CO) y otros inhibidores que bloquean irreversiblemente
este complejo enzimático. Con ello se ve interrumpido el transporte electrónico y se deja de utilizar
el O2 generando una condición de cianosis celular.

La actividad del complejo citocromo C oxidasa puede demostrarse mediante la oxidación de

aceptores electrónicos artificiales como la p-fenilendiamina (pFDH2) en presencia del sistema de
citocromos de los complejos de la cadena respiratoria. Esta sustancia es muy reactiva así que se
condensa y polimeriza fácilmente originando mezclas de pigmentos oscuros.La siguiente ecuación
química representa la acción de esta sustancia indicadora de las reacciones de oxido – reducción
en los sistemas in vitro.

1.2 MATERIAL EQUIPOS Y REACTIVOS( POR PERSONA)

Cada estudiante debe traer un marcador permanente (por seguridad no se podrá prestar
nada durante la práctica) y sus diagramas de flujo y tablas de resultados impresas. En su
lugar de trabajo encontrará sus reactivos debidamente etiquetados (en cantidades
suficientes) y su material de trabajo. Procure alejarse lo menos posible de este sitio, levante
la mano si tiene alguna duda y mantenga el distanciamiento cuando se acerque la profesora
o el auxiliar.

Los reactivos los encontrará en frascos tapados o tubos tapa-rosca (No en frascos gotero)

Buffer de fosfatos 0,1M pH = 7,4

Arena lavada ( en mortero y en paquetico etiquetado)

Malonato de sodio, 1% en buffer

Agua destilada

*Cianuro de potasio 0,05M en agua ( en tubo tapa rosca tapado y etiquetado como peligroso,
tenga en cuenta su ficha técnica)

Succinato de sodio, 1% en buffer

Azul de metileno 0,01% en agua

Malonato de sodio 1% en buffer

p – fenilendiamina, 1% en agua ( junto a baño termostado con pipeta pasteur graduada para que
auxiliar agregue 1 ml a los tubos que corresponda)

Aceite mineral ( junto a baño termostado con pipeta pasteur graduada para que auxiliar agregue 1
ml a los tubos que corresponda)

Materiales:

2 Erlenmeyer de150ml en baño de hielo suficiente para manetener su temperatura

10 Tubos de centrífuga

1 Mortero – pistilo ( con muestra y arena, y en frio)

1 Espátula

9 pipetas pasteur

19 tubos( pueden ser tapa rosca) en dos gradillas

1 cronómetro

Materiales y equipos de uso general:

Centrífuga

Bisturí – cuchilla

2 Baños termostatados

Material de prueba (fresco, traído ese mismo día del matadero en nevera de icopor):según le
corresponda puede ser tejido muscular de vaca como sobrebarriga, o cerebro de vaca, o hígado de
vaca, o corazón de vaca.

1.3. PROCEDIMIENTO.

Extracción y preparación de las enzimas y coenzimas

En su lugar de trabajo encontrará un mortero marcado, enfriado previamente en un baño de hielo,

que contiene una muestra de tejido de 7g aproximadamente, finamente picada, libre de sangre, con
0,5 g aprox. de arena lavada. Proceda entonces a macerar cuidadosamente agregando al mortero,
poco a poco, tres porciones, cada una de 5ml aprox. de buffer fosfato pH 7,4. Macerar hasta formar
una pasta suave, si es necesario porque el tejido es muy duro, agregue 3ml más de buffer y un
poco más de arena. Luego transferir la mezcla a un erlenmeyer de 150mL, mantenerlo allí durante
15 minutos, mezclando ocasionalmente. Luego de trascurrido este tiempo pasar la muestra a
parejas de tubos de centrífuga al mismo nivel, márquelos con marcador permanente, el auxiliar de
laboratorio pasará a recogerlos y centrifugará a 1500 rpm por 7 minutos. En seguida le entregaran
sus tubos ya centrifugados, la fase superior líquida es el sobrenadante, tome un gotero o pipeta
pasteur y transfiera el sobrenadante a otro erlenmeyer de 150mL y márquelo como extracto
enzimático, manténgalo en baño de hielo hasta su posterior uso.

Seguimiento de la reacción catalizada por la citocromo oxidasa

Preparar una serie de tubos debidamente marcados según las indicaciones de la Tabla 1, en
orden, de arriba hacia abajo adicionar: buffer, malonato, cianuro, y agua destilada según
corresponda, además alistar 4 tubos de ensayo cada uno con 1 ml de extracto enzimático ( frio),
entregar los tubos debidamente marcados con marcador permanente al auxiliar de laboratorio,
quien los dejará incubando a 37ºC en uno de los baños termostatados disponibles, durante 10
minutos aproximadamente ( no importa si este tiempo es un poco superior), y sin retirarlos del baño
el auxiliar procederá a agregar a cada uno el extracto enzimático de su tejido muestra y 1 ml de p-
fenilendiamina ( que está junto al baño termostatado), y agitará bien, esté pendiente porque el
auxiliar le indicará este momento, que corresponde al tiempo cero, y usted debe activar el
cronómetro inmediatamente, el auxiliar estará pendiente de cada tubo y le avisará el momento en
que ocurre el cambio de color para que usted registre el tiempo en la tabla 2, cuando tenga estos
datos, le entregarán los tubos para que usted registre el color final y la intensidad del color (-, +, ++,
+++ según corresponda).
Tabla 1. Seguimiento de la reacción catalizada por la citocromo oxidasa

Tubos

Blanco 1 2 3

Reactivos (mL)

Buffer fosfatos pH 7,4 1,0 1,0 1,0 1,0

Malonato de sodio 0,0 0,0 0,0 1,0

Cianuro de potasio 0,0 0,0 1,0 0,0

Agua destilada 2,0 1,0 0,0 0,0

*Extracto enzimático 1,0 1,0 1,0 1,0

*p-fenililendiamina 0,0 1,0 1,0 1,0

*sustancias que agregará el auxiliar

Tabla 2. Resultados ensayo de citocromo oxidasa

Tubo Reactivos agregados Tiempo Observaciones Resultado(+/-)

*Recuerde tomar fotos de cada tubo

Seguimiento de la reacción catalizada por la succínico deshidrogenasa

Prepare una serie de tubos debidamente marcados según las indicaciones de la tabla 3 agregando
en orden: buffer, succinato, azul de metileno y malonato, y prepare además 5 tubos de ensayo con
los diferentes volúmenes de extracto enzimático en frio y marcados (especificando estos
volúmenes y si corresponden al tubo blanco, 1,2,3 ó 4, según corresponda); entregue los tubos al
auxiliar quien los dejará incubando a 37ºC en uno de los baños termostatados disponibles, durante
10 minutos aproximadamente (no importa si este tiempo es un poco superior), y sin retirarlos del
baño el auxiliar procederá a agregar a cada uno el extracto enzimático de su tejido muestra y
agitará bien, esté pendiente porque el auxiliar le indicará este momento, que corresponde al tiempo
cero y usted debe activar el cronómetro inmediatamente, enseguida el auxiliar agregará 1 ml de
aceite mineral a cada tubo (que está junto al baño termostatado), el auxiliar seguirá pendiente de
cada tubo y le avisará el momento en que ocurre el cambio de color para que usted registre el
tiempo en las tabla 4, cuando tenga estos datos, le entregarán los tubos para que usted registre el
color final y la intensidad del color (-, +, ++, +++ según corresponda).

Tabla 3. Seguimiento de la reacción catalizada por la succínico deshidrogenasa

Tubos
Blanco 1 2 3 4

Reactivos

mL

Buffer fosfato pH 7.4 3,0 2,5 2,0 1,5 1,0

Succinato de sodio 1% 0,0 1,0 1,0 1,0 1,0

Azul de metileno 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5

Malonato de sodio 1%. 0,0 0,0 0,0 0,0 1,0

*Extracto enzimático 1,0 0,5 1,0 1,5 1,0

*Aceite mineral 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0

*sustancias que agregará el auxiliar

Tabla 4. Resultados ensayo de succínico deshidrogenasa

Tubo Reactivos agregados Tiemp Observaciones Resultado(+/-)

o

*Recuerde tomar fotos de cada tubo

 1.4 BIBLIOGRAFÍA

- MATHEWS C., VAN HOLDE K., AHERN K G. (2002). Bioquímica. 3 ed. Madrid: Addison Wesley.

- PLUMMER, D. (1981). Bioquímica práctica. México: Editorial Mc Graw Hill Latinoamericana.

- NELSON, David. L. y COX, Michael. Lehninger. Principles of Biochemistry. 3 ed. New York: Worth
Publischer, 1993.

1 .5CUESTIONARIO PREINFORME( su preinforme le será evaluado por su profesora de

complementaria, antes de la práctica presencial)

Consulte en el libro: MATHEWS C., VAN HOLDE K., AHERN K G. (2002). Bioquímica. 3 ed.
Madrid: Addison Wesley

1-) La ecuación de las reaciones que catalizan las enzimas a utilizar en la práctica.

2-) Para los tejidos a utilizar si su metabolismo es más fermentativo (anaerobio) o aerobio y
nombre las rutas metabólicas principales que utiliza para obtener energía, diseñe una tabala para
registrar esta información brevemente.

3-) Tabla con los valores de potencial redox para todos los componentes de la cadena respiratoria,
así como del azul de metileno y la p-fenilendiamina, compuesto que se usarán para evidenciar la
actividad de las enzimas citocromo oxidasa y succínico deshidrogenasa.

4-) De acuerdo con el fundamento teórico de la guía, las indicaciones de su profesor y la

bibliografía describa brevemente los cambios de color en el azul de metileno y la p-fenilendiamina
cuando:

a)-La citocromo oxidasa y la succínico deshidrogenasa se encuentran sin inhibidores.

b)- La citocromo oxidasa y la succínico deshidrogenasa se encuentran con los inhibidores (cianuro,
malonato ).

5) Complete las tablas de fichas técnicas y los diagarams de flujo correspondientes.

Fichas técnicas. Propiedades de los reactivos peligrosos a usar en el laboratorio.

Peligrosi
Nombre Fórmula Aspecto Primeros auxilios y medidas de higiene
dad*

Cianuro de potasio

P-Fenililendiamina

Malonato de sodio

Azul de metileno
*Indique la peligrosidad con el símbolo correspondiente: explosivo (E), comburente (O), inflamable
(F), extremadamente inflamable (F+), tóxico (T), muy tóxico (T+), corrosivo (C), nocivo (Xn),
irritante (Xi) y/o peligroso para el medio ambiente (N).

1.6 INDICACIONES PARA ELABORAR EL CUESTIONARIO DEL INFORME

El informe debe contener: tablas y fotos justo la lado de los numerales explicativos
correspondientes, estos se contestan en forma breve y concreta y con citas en normas APA,
usando la informaciónde su preinforme.

1-) Para cada tubo de ensayo explique, no describa, los colores obtenidos y los tiempos,
explicando si estaban activas las enzimas o no porque incluían inhibidores, si este es el caso
clasifíquelos y explique sus efectos.

2-)Discuta qué tan aerobios o anaerbios son sus tejidos muestra, relaciónelo con sus resultados y
por lo tanto mencione qué rutas metabólicas energéticas usan principalmente para la generación
de energía.

3-) En el ensayo donde sea una variable la concentración de extracto enzimático explique su
efecto.

4)-Para cada tubo de ensayo realice usted mismo una figura diferente, ilustrativa de la cadena
respiratoria, con las siglas de cada componente y su secuencia, indique desde dónde y hasta
dónde se llevo a cabo la fosforilación oxidativa, la ubicación del aceptor de electrones artificial
(azul de metileno o p-fenilendiamina), de acuerdo con su potencial de reducción estándar(E°) y
aclare si quedó oxidado o reducido de acuerdo con sus observaciones ( punto de mayor valor en la
evaluación del informe).

5)-Redacte la bibliografía correspondiente a las citas, en orden alfabético y con normas APA.