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UNIVERSIDAD MAYOR DE SAN SIMON

MATERIA: TOXICOLOGIA
FACULTAD DE CIENCIAS FARMACEUTICAS Y BIOQUÍMICAS

CROMATOGRAFIA
La cromatografía es una técnica que permite separar, aislar e identificar
los componentes de una mezcla de compuestos químicos.
La muestra es distribuida entre dos fases:
● Fase estacionaria
● Fase móvil
De tal forma que cada uno de los componentes de la mezcla es
selectivamente retenido por la fase estacionaria.
CLASIFICACIÓN
● Cromatografía en capa fina
● Cromatografía en papel
● Cromatografía en columna
● Cromatografía líquida de alto performance HPLC
● CROMATOGRAFIA GASEOSA

CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA


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La cromatografía en capa fina, es un método de análisis para la


separación e identificación de drogas y otros compuestos en el cual el
flujo de un disolvente principalmente orgánico o de un gas, favorece la
separación de sustancias aplicadas previamente en forma de puntos, por
migración diferencial.
Las sustancias así separadas se hacen visibles observando la placa
cromatográfica a la luz UV o rociando sobre su superficie reactivos de
detección reveladores, siendo facilitada la identificación por
comparación con las correspondientes sustancias patrón.
La cromatografía en capa fina se ha desarrollado como una herramienta
analítica por tres razones:
● Rapidez
● Sensibilidad
● Resolución
VENTAJAS:
● No necesita de aparatos enormes
● Tiempo de separación es muy corto(30 min a 1 hora)
● Buena resolución
● Buena apreciación de sustancias a identificar
● Separaciones nítidas en cantidades mínimas

PROCEDIMIENTO

Aplicación de muestras y soluciones patrones


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● La aplicación debe tener un diámetro de 3-8 mm.


● Los analitos deben localizarse como manchas compactas redondas
Como evitar la deformación de las manchas
● Aplicar soluciones diluidas
● Purificación de los extractos (pigmentos, grasas, proteínas)
● Elección del solvente de arrastre (más o menos polar)
● Flujo constante del solvente de arrastre
Desarrollo de las placas cromatografías
● Colocar en un recipiente de vidrio con tapa esmerilada, cuyo fondo
está cubierto de eluyente hasta una altura de 5-7 mm. 1 o 2 placas.
ELECCION DEL ELUYENTE
Serie Eluotropa: el poder eluyente aumente con la polaridad de los
disolventes.
Hexano - polar/-poder del eluyente
Tetracloruro de carbono
Benceno
Diclorometano
Cloroformo Isopropanol
Éter etílico Etanol
Acetato de etilo Metanol
Acetato Agua
+polar/+poder del eluyente

FENÓMENO MARGINAL
Se llama fenómeno marginal cuando las manchas de sustancias idénticas
no se hallan a la misma altura, sino que el valor de Rf disminuye del
centro a ala periferie. (Debido probablemente a un efecto de
evaporación).
¿COMO PUEDE EVITARSE EL FENOMENO MARGINAL?
Cubriendo las paredes interiores de la cámara de desarrollo con papel
filtro impregnado en el eluyente.
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GRUPO 400

∙ Se colocó una pequeña cantidad del material sospechoso en un


pocillo de l
CROMATOGRAFIA EN CAPA FINA PARA
IDENTIFICACIÓN DE COCAINA

Objetivos

● Determinación e identificación de cocaína o sus metabolitos que se


excretan en forma conjugada en orina por cromatografía en capa
fina.

● Interpretación de resultados.

INTRODUCCIÓN

La cocaína es un potente estimulante del sistema nervioso central (SNC)


y un anestésico local. Inicialmente, este trae energía extrema y la
inquietud, mientras que resultan gradualmente los temblores, el exceso
de sensibilidad y espasmos.
En grandes cantidades, la cocaína causa fiebre, falta de respuesta, y la
dificultad en la respiración e inconsciencia.
La cocaína es a menudo auto-administrada por inhalación nasal,
inyección intravenosa y fumar la base libre.
Se excreta en la orina en un corto período de tiempo principalmente
como Benzoilecgonina.1,2 La benzoilecgonina, un metabolito principal de
la cocaína, tiene una vida media biológica más larga (5 - 8 horas) que la
cocaína (0.5 – 1.5 horas), y se pueden detectar generalmente durante
24-48 horas después de la exposición a la cocaína.
La cocaína es un estimulante extremadamente adictivo que afecta
directamente al cerebro.
Causa adicción física y psíquica.
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GRUPO 400

PROCEDIMIENTO

● Trazar una linea a 1 cm del pie de la placa cromatográfica y marcar


sobre esa linea con lapis graffito.

● Sembrar con un capilar sobre la linea marcada la muestra.


Igualmente el patron.

● Colocar la placa dentro la cámara cromatográfica con el eluyente.

ELUYENTE

● Butanol
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● Ácido acético
● H2O destilada

● Esta es la fase movil por diferencias de polaridades se separan los


analitos.

● Sacar,marcar el recorrido del eluyente y secar.


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GRUPO 400
● Revelar la placa.

Métodos de visualización

● A. Luz UV a 254 nm
Se observan manchas oscuras frente a un fondo verde.

● B. Reactivo de iodoplatinato spray

Cuando la placa se pulveriza con el reactivo, la cocaína aparece


como una mancha azul.

● C. Reactivo de Dragendorff
Cuando la placa se pulveriza con el reactivo, la cocaína aparece
como una mancha naranja.
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Interpretación:
Tras la visualización, marcar las manchas (con un lápiz) y calcular
los valores de la Relación de flujo (Rf).

Rf = Distancia de migración: desde el origen hasta el centro de la mancha


Distancia de revelado: desde el origen hasta el frente de disolvente

3.5 cm

Rf = 2.1 = 0.60
3.5
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GRUPO 400
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GRUPO 400

PREPARACION DE REACTIVOS
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GRUPO 400

METODOS INMUNOCROMATOGRAFICOS

OBJETIVOS
● Conocer el principio de la inmunocromatografia y su aplicación en
otras pruebas.
● Identificar cualitativamente de manera presuntiva drogas
de abuso mediante una reacción colorimétrica con
algunos reactivos.

FUNDAMENTO

Utiliza anticuerpos monoclonales para detectar de manera selectiva


niveles elevados de metabolitos de Cocaína en orina y origina resultados
positivos cuando la presencia de metabolitos de Cocaína en la orina
supera el nivel de 300 ng/mL.
La prueba de un solo paso o inmunoensayo cromatográfico es una
prueba rápida que puede realizarse sin necesidad de utilizar ningún
aparato basado en el principio de uniones competitivas.
Utiliza anticuerpos monoclonales para detectar de manera selectiva
niveles elevados de metabolitos de Cocaína en orina y origina resultados
positivos cuando la presencia de metabolitos de Cocaína en la orina
supera el nivel de 300 ng/mL.
La droga que puede estar presentes en la muestra de orina, compite
frente al conjugado de la misma en los puntos de unión al anticuerpo.
Durante la prueba, la muestra de orina migra hacia arriba por acción
capilar.
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Si la benzoilecgonina está presente en la orina en concentración inferior
a 300 ng/mL, no saturará los puntos de unión de los anticuerpos. Las
partículas recubiertas de anticuerpos serán capturadas por el conjugado
inmovilizado de benzoilecgonina y una línea visible de color aparecerá en
la zona de la prueba.
Esta línea de color no se formará en la zona de la prueba si el nivel de
Benzoilecgonina está por encima de 300 ng/mL porque saturará todos los
puntos de unión de los anticuerpos.
● Una muestra de orina positiva no generará una línea coloreada en
la zona de la prueba debido a la competencia de la droga.
● Mientras que una muestra de orina negativa o una muestra con
una concentración inferior a la del cut-off generará una línea en la
zona de la prueba.
● Para servir como procedimiento de control, una línea coloreada
aparecerá siempre en la zona de control si la prueba ha sido
realizada correctamente y con un volumen adecuado de muestra.

La Cocaína se elimina a través de la orina en un breve periodo de tiempo,


en primer lugar como benzoilecgonina, que es el metabolito principal de
la cocaína, y que tiene una vida media biológica (5-8 horas) mayor que la
de la cocaína (0.5-1.5 horas) y generalmente puede ser detectada hasta
24-48 horas después de su consumo.
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GRUPO 400

REACTIVOS
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Composición: COC, contiene anticuerpos monoclonales de ratón


anti-Benzoilecgonina unidos a partículas y conjugados de proteína
Benzoilecgonina. Un anticuerpo de cabra se emplea en el sistema de la
línea del control.

ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD
• Certificado de control por lote.
● Almacenar 2 - 9 oC.
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GRUPO 400
● El dispositivo de ensayo es estable hasta la fecha de caducidad
impresa en el sobre, siempre que se mantenga en el sobre bien
sellado hasta su uso. No usar una vez superada la fecha de
caducidad.
● NO CONGELAR.

MATERIALES
● Cronómetro.
● Frasco para la colección de muestra de orina.
● Guantes y barbijo.

OBTENCION Y PREPARACION DE LA MUESTRA


● Muestra de orina recogida a cualquier hora del día.
● En frasco limpio y seco.
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● Cantidad: todo lo que se pueda.

Recomendaciones:
● Leer el manual de
instrucciones (inserto)
de manera completa antes
de realizar el ensayo y
seguir las instrucciones
cuidadosamente.
● No utilizar los
reactivos después de la
fecha de vencimiento
indicada en el envase.
● No mezclar
reactivos de diferentes
lotes.
● No tocar la membrana de nitrocelulosa con los dedos.
● Seguir las prácticas de seguridad biológica al utilizar muestras y
reactivos: Manipular todas las muestras de pacientes como
potencialmente infecciosas.
● Utilizar guantes, guardapolvo, protección ocular (lentes) y mascara
facial.
● Las muestras de orina pueden ser almacenadas entre 2 y 8ºC hasta
48 horas previas a la realización de la prueba. Para un periodo más
prolongado se deben congelar a -20ºC. Las muestras congeladas
deben alcanzar la temperatura ambiente antes de realizar la
prueba.
● Atemperar, a temperatura ambiente el cassette, la muestra y los
controles antes de su uso, antes de abrirlo. Sacar el cassette de la
bolsa sellada y usarla lo antes posible.
● Aquellas muestras que presenten partículas visibles deben ser
centrifugadas, filtradas o permitir que sedimenten para obtener
una muestra clara para realizar la prueba.
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PROCEDIMIENTO DE LA TÉCNICA

● Sostenga el gotero verticalmente y vierta 3 gotas de orina (aprox.


100 μL) en el agujero marcado (S) y empiece a medir el tiempo.
Evite atrapar burbujas de aire en el agujero (S).
Véase la siguiente ilustración.
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GRUPO 400

● Lea los resultados a 5 minutos de realizar la prueba. No interpretar


los resultados después de 10 minutos.

INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
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NEGATIVO:* Aparecen dos líneas. Una línea roja debe estar en la zona
del control (C) y otra línea roja o rosa aparecerá en la zona de la prueba
(T). Este resultado negativo indica que la concentración de Cocaína está
por debajo del nivel detectable (300 ng/mL).
*NOTA: La intensidad del color rojo de la línea de la región de la prueba
(T) puede variar, pero cualquier coloración roja, por muy débil que sea,
deberá considerarse como resultado negativo.

POSITIVO: Una línea roja aparece en la región de control (C). No


aparecerá ninguna línea en la zona de la prueba. Este resultado positivo
indica que la concentración de Benzoilecgonina excede los niveles
detectables (300 ng/mL).

NO VALIDO: No aparece la línea de control.


● Un volumen de muestra insuficiente.
● Un procedimiento incorrecto son las posibles razones de la
ausencia de la línea de control.
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GRUPO 400
● Revise el procedimiento y repita la prueba usando una nueva
prueba. Si el problema persiste, deje de utilizar ese lote y contacte
con su distribuidor.

CONTROL DE CALIDAD
● Un control interno está incluido en la prueba. La línea roja que
aparece en la región de control (C) es considerada como un
procedimiento de control interno. Confirma que se ha utilizado un
volumen suficiente de muestra y se ha realizado correctamente la
técnica.
Se recomienda realizar controles positivos y negativos como buena
práctica de laboratorio para verificar tanto el procedimiento como el
comportamiento de la prueba.
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GRUPO 400
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GRUPO 400

SE DEBE TOMAR EN CUENTA:


● La prueba COC Cocaine cassette proporciona sólo un resultado
analítico preliminar cualitativo.
● Debe emplearse un segundo método analítico para confirmar el
resultado. Cromatografía de gases y Espectrometría de masas
(GC/MS) son los métodos analíticos más apropiados para la
confirmación.
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GRUPO 400
● Un resultado positivo indica presencia de la droga o de sus
metabolitos, pero no indica el nivel de intoxicación, la vía de
intoxicación o la concentración de droga en la orina.
● Un resultado negativo no necesariamente indica la ausencia de
droga en la orina. Pueden obtenerse resultados negativos cuándo
la droga está presente pero en niveles inferiores a los del cut-off de
la prueba.
● Limpiar y desinfectar las salpicaduras de muestra usando
hipoclorito sódico u otro desinfectante adecuado.
● Durante la realización de la prueba, colocar el cassette sobre una
superficie limpia, plana y sin vibraciones.
● No es recomendable realizar múltiples ciclos de congelamiento y
descongelamiento. Esto puede generar resultados erróneos. En
caso de usar muestras congeladas, éstas deben ser
homogeneizadas y centrifugadas antes de usar.
● No leer pasado los 10 minutos ya que pueden obtenerse
resultados erróneos.
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BENZODIACEPINAS Y/O METABOLITOS QUE SE EXCRETAN EN
FORMA CONJUGADA POR CROMATOGRAFIA EN
CAPA FINA EN ORINA

Objetivos

● Determinación e identificación de Benzodiacepinas o sus


metabolitos que se excretan en forma conjugada en orina por el
método de cromatografía en capa fina.

● Interpretación de resultados.

INTRODUCCION
Las benzodiacepinas son derivados tricíclicos aromáticos y
heterociclicos.la mayor parte son derivados 1,4 benzodiacepinas, aunque
se han desarrollado compuestos 1,5 benzodiacepinas como el clobazam.
El grupo comprende el: lorazepam, bromazepam, clordiacepoxido,
oxazepam, clobazam, flurazepam, clonazepam, flunitrazepam,
nitrazepam, diazepam,y los metabolitos correspondiente.
Dentro de este punto de vista farmacológico son depresores del Sistema
Nervioso Central. Tienen propiedades hipnóticas, sedantes, ansiolíticas
anticonvulsivantes y miorelajantes.
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Sustancias identificadas: Este método solo se aplica únicamente a las
benzodiacepinas y/o metabolitos que se excretan en forma conjugada en
orina.

Fundamento:
El método de cromatografía en capa fina previo tratamiento de las
muestras, que comprende la hidrólisis ácida y la extracción
liquido-liquido del producto de hidrólisis.
Este método comprende tres etapas:

Hidrólisis en medio ácido: Con este tratamiento se obtienen los


correspondientes derivados aminobenzofenonas de la hidrólisis de los
productos de conjugación que se forman en el organismo como parte del
metabolismo de estas sustancias.
Las benzodiacepinas que tienen un grupo OH en la posición tres
(lorazepam), se conjuga con el ácido glucoronico. El metabolismo de la
benzodiacepinas se hace por rutas principales en el organismo, la
N-alquilación y la hidroxilacion.
Se han desarrollado dos tipos de hidrólisis, la enzimática y la química.
La hidrólisis química se basa en el tratamiento de los compuestos en
medio ácido y temperaturas altas.

Extracción liquido-liquido de los productos de hidrólisis: Se basa en la


solubilidad de los analitos en el solvente de extracción. Se realiza la
partición de los analitos entre la fase acuosa (orina) y el solvente de
extracción.
El coeficiente de partición permite que los analitos pasen a la fase
acuosa. El sulfato de sodio anhidro facilita la partición y mejora la
limpieza de la muestra.

Cromatografía en capa fina:


Se basa en la diferente velocidad de migración de los compuestos
presentes en la muestra y la diferente capacidad de adsorción a la silica
de los analitos.
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El color de los compuestos varía.

Muestra:
- Muestra: Orina

Cuando las muestras presenten sedimento se deben centrifugar y tomar


el volumen de muestra del sobrenadante, esta operación permite
obtener extractos de muestras más limpias, es decir con menor número
de interferentes endógenos.
Se debe realizar medición del pH de la orina antes de proceder al análisis
y este dato debe ser registrado.

Condiciones de la muestra:
La muestra debe ser colectada en un frasco tapa rosca debidamente
rotulada y lacrado, se puede conservar a temperatura de refrigeración
antes de su análisis y no lleva conservante.

Técnica:
- Hidrólisis ácida
- Extracción liquido-liquido del producto de hidrólisis
- Cromatografía en capa fina

Reactivos:
- Ácido clorhídrico
- Hidróxido de sodio
- sulfato de sodio anhidro
- alcohol isopropilico
- Éter etílico
- Cloroformo
- Ácido Acético
- Reactivo de Dragendorf
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Patron

PROCEDIMIENTO
● Trazar una linea a 1 cm del pie de la placa cromatográfica y marcar
sobre esa linea con lapis graffito.

● Sembrar con un capilar sobre la linea marcada la muestra.


Igualmente el patron.

● Colocar la placa dentro la cámara cromatográfica con el eluyente.

ELUYENTE

● Cloroformo
● Éter etílico
● Ácido acético
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GRUPO 400

● Esta es la fase movil por diferencias de polaridades se separan los


analitos.

● Sacar,marcar el recorrido del eluyente y secar.


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REVELADOR
● Reactivo de Dragendorff

Análisis e interpretación de resultados:


Las muestras que presenten manchas con valor de Rf igual al de los
patrones y con color similar serán reportadas como positivas.
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PREPARACION DE REACTIVOS
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DETERMINACION DE MONOXIDO DE
CARBONO (CO)

Este método se basa en la reducción del PdCl2 por acción del CO a Pd0 que aparece en
forma de película plateada sobre la superficie del compartimiento central de la
cámara de Conway.

Material y Equipos

Unidad de Conway
Pipetas de 10 ml y 1 ml.
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Reactivos

- Solución de

Preparación de reactivo Pd Cl2.-Disolver: 0,222g de Pd Cl2 en


150 ml de HCl 0,01 N

- H 2SO 4 al 10% v/v (agente liberante).

- Vaselina
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RESULTADOS.- En caso positivo se formara una película argéntica sobre la superficie
del compartimento central debido a la reducción del Pd Cl2 por acción del CO a Pd0
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GRUPO 400
Determinación de Colinesterasa

Objetivos

● Conocer que son los plaguicidas, organofosforados - carbamatos.

● Determinar la colinesterasa plasmática en pacientes intoxicados


por organofosforados - carbamatos.

● Interpretación de resultados.

Introducción

La determinación de su actividad es de importancia clínica para detectar


pacientes intoxicados por plaguicidas organofosforados y carbamatos.
La colinesterasa es una enzima encargada de la degradación rápida de un
neurotransmisor.

Se ha demostrado la existencia de dos colinesterasas:


● La colinesterasa verdadera que se encuentra en los eritrocitos y
terminaciones de nervios colinérgicos.
● La butiril colinesterasa o pseudocolinesterasa que se encuentra en
plasma, hígado, musculo liso y adipocitos.
La colinesterasa del suero o plasma esta asociadas a las siguientes
condiciones clínicas:
1- Constituye un índice de función hepática, especialmente en
hepatopatías crónicas. Se observa una buena correlación entre el
aumento de GOT (AST) y la disminución de Che, en hepatitis
infecciosas.
2- Su disminución indica intoxicación por insecticidas
organofosforados - carbamatos inhibidores de la che.
3- En algunos individuos sensibles a la succinilcolina, relajante
muscular administrado durante la anestesia, se observa una apnea
post anestésica prolongada y en algunos casos fatal. Esto coincide
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con la presencia de una variante genética de la che (atípica)


incapaz de hidrolizar la succinilcolina.
En sujetos normales esta droga es hidrolizada “in vivo” por la che, de
1 a 4 minutos, por eso la apnea también se relaciona con bajos niveles
de che total.

FUNDAMENTO:
FUNDAMENTOS DEL METODO
butiriltiocolina + H2 O Che tiocolina + butirato
tiocolina + DTNB 2-nitro-5-mercaptobenzoato

REACTIVOS PROVISTOS

Sustrato: viales conteniendo ioduro de S-butiriltiocolina y ácido


5,5'-ditiobis-2-nitrobenzoico (DTNB) desecados.
Buffer: solución de buffer fosfatos para pH final 7.7.
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INSTRUCCIONES PARA SU USO


Buffer: listo para usar. Puede presentar cristales que sedimentan en
reposo y no afectan su reactividad. Pipetear sin remover el sedimento.
Sustrato: agregar 3 ml de buffer a un vial de sustrato .Tapar y
homogenizar hasta disolución completa. Reconstituir en el momento de
usar.
ESTABILIDAD E INSTRUCCIONES DE ALMACENAMIENTO
Reactivos provistos: Son estables en refrigerador (2 – 10ºC) hasta la fecha
de vencimiento indicada en la caja.
Sustrato reconstituido: Es estable 1 hora a temperatura ambiente.
INDICIOS DE ESTABILIDAD O DETERIORO DE LOS REACTIVOS
El cambio de coloración de los reactivos puede indicar deterioro de los
mismos.
MUESTRA
Suero o plasma
a) Recolección: Se debe obtener suero de la manera usual.
b) Aditivos: En caso de emplear plasma como muestra, se recomienda el
uso de heparina o EDTA como anticoagulantes para su obtención.
Los anticoagulantes que contienen citratos, fluoruro u oxalatos producen
una leve inhibición.
MATERIAL REQUERIDO (No provisto)
Espectrofotómetro.
Micropipetas y pipetas para medir los volúmenes indicados.
Cronómetro.
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CONDICIONES DE REACCIÓN
Longitud de onda: 405 nm
Temperatura de reacción: 25,30 o 37 ºC
Volumen de la muestra: 20 ul
Volumen de reactivo (sustrato):3 ml

o
TABLA (25-30-37 C)
ΔA/30 U/l ΔA/30 seg U/l
seg
0,010 227 0,130 2.952
0,015 341 0,135 3.066
0,020 454 0,140 3.179
0,025 568 0,145 3.283
0,030 681 0,150 3.407
0,035 795 0,155 3.520
0,040 908 0,160 3.634
0,045 1.022 0,165 3.747
0,050 1.136 0,170 3.861
0,055 1.249 0,175 3.974
0,060 1.363 0,180 4.088
0,065 1.476 0,185 4.201
0,070 1.590 0,190 4.315
0,075 1.703 0,195 4.428
0,080 1.817 0,200 4.542
0,085 1.930 0,205 4.655
0,090 2.044 0,210 4.769
0,095 2.157 0,215 4.883
0,100 2.271 0,220 4.996
0,105 2.385 0,225 5.110
0,110 2.498 0,230 5.223
0,115 2.612 0,235 5.337
0,120 2.725 0,240 5.450
0,125 2.839 0,245 5.564
0,250 5.677
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GRUPO 400

1. Ejemplo:
0,200
0,220
0,240
0,260
0,06 30
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GRUPO 400
0.002 X Fc = 22.710 =0.045 = 1022 UI/L

Otros ejemplos:

0.060 ------------- 1363 UI/L


0.058-------------- X
X= 1317 UI/L

0.250 ----------------------- 5677 UI/L


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x= 10218 UI/L

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