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MATERIA: TOXICOLOGIA
FACULTAD DE CIENCIAS FARMACEUTICAS Y BIOQUÍMICAS
CROMATOGRAFIA
La cromatografía es una técnica que permite separar, aislar e identificar
los componentes de una mezcla de compuestos químicos.
La muestra es distribuida entre dos fases:
● Fase estacionaria
● Fase móvil
De tal forma que cada uno de los componentes de la mezcla es
selectivamente retenido por la fase estacionaria.
CLASIFICACIÓN
● Cromatografía en capa fina
● Cromatografía en papel
● Cromatografía en columna
● Cromatografía líquida de alto performance HPLC
● CROMATOGRAFIA GASEOSA
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PROCEDIMIENTO
MATERIA: TOXICOLOGIA
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FENÓMENO MARGINAL
Se llama fenómeno marginal cuando las manchas de sustancias idénticas
no se hallan a la misma altura, sino que el valor de Rf disminuye del
centro a ala periferie. (Debido probablemente a un efecto de
evaporación).
¿COMO PUEDE EVITARSE EL FENOMENO MARGINAL?
Cubriendo las paredes interiores de la cámara de desarrollo con papel
filtro impregnado en el eluyente.
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MATERIA: TOXICOLOGIA
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GRUPO 400
Objetivos
● Interpretación de resultados.
INTRODUCCIÓN
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PROCEDIMIENTO
ELUYENTE
● Butanol
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● Ácido acético
● H2O destilada
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● Revelar la placa.
Métodos de visualización
● A. Luz UV a 254 nm
Se observan manchas oscuras frente a un fondo verde.
● C. Reactivo de Dragendorff
Cuando la placa se pulveriza con el reactivo, la cocaína aparece
como una mancha naranja.
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Interpretación:
Tras la visualización, marcar las manchas (con un lápiz) y calcular
los valores de la Relación de flujo (Rf).
3.5 cm
Rf = 2.1 = 0.60
3.5
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PREPARACION DE REACTIVOS
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METODOS INMUNOCROMATOGRAFICOS
OBJETIVOS
● Conocer el principio de la inmunocromatografia y su aplicación en
otras pruebas.
● Identificar cualitativamente de manera presuntiva drogas
de abuso mediante una reacción colorimétrica con
algunos reactivos.
FUNDAMENTO
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Si la benzoilecgonina está presente en la orina en concentración inferior
a 300 ng/mL, no saturará los puntos de unión de los anticuerpos. Las
partículas recubiertas de anticuerpos serán capturadas por el conjugado
inmovilizado de benzoilecgonina y una línea visible de color aparecerá en
la zona de la prueba.
Esta línea de color no se formará en la zona de la prueba si el nivel de
Benzoilecgonina está por encima de 300 ng/mL porque saturará todos los
puntos de unión de los anticuerpos.
● Una muestra de orina positiva no generará una línea coloreada en
la zona de la prueba debido a la competencia de la droga.
● Mientras que una muestra de orina negativa o una muestra con
una concentración inferior a la del cut-off generará una línea en la
zona de la prueba.
● Para servir como procedimiento de control, una línea coloreada
aparecerá siempre en la zona de control si la prueba ha sido
realizada correctamente y con un volumen adecuado de muestra.
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REACTIVOS
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ALMACENAMIENTO Y ESTABILIDAD
• Certificado de control por lote.
● Almacenar 2 - 9 oC.
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● El dispositivo de ensayo es estable hasta la fecha de caducidad
impresa en el sobre, siempre que se mantenga en el sobre bien
sellado hasta su uso. No usar una vez superada la fecha de
caducidad.
● NO CONGELAR.
MATERIALES
● Cronómetro.
● Frasco para la colección de muestra de orina.
● Guantes y barbijo.
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● Cantidad: todo lo que se pueda.
Recomendaciones:
● Leer el manual de
instrucciones (inserto)
de manera completa antes
de realizar el ensayo y
seguir las instrucciones
cuidadosamente.
● No utilizar los
reactivos después de la
fecha de vencimiento
indicada en el envase.
● No mezclar
reactivos de diferentes
lotes.
● No tocar la membrana de nitrocelulosa con los dedos.
● Seguir las prácticas de seguridad biológica al utilizar muestras y
reactivos: Manipular todas las muestras de pacientes como
potencialmente infecciosas.
● Utilizar guantes, guardapolvo, protección ocular (lentes) y mascara
facial.
● Las muestras de orina pueden ser almacenadas entre 2 y 8ºC hasta
48 horas previas a la realización de la prueba. Para un periodo más
prolongado se deben congelar a -20ºC. Las muestras congeladas
deben alcanzar la temperatura ambiente antes de realizar la
prueba.
● Atemperar, a temperatura ambiente el cassette, la muestra y los
controles antes de su uso, antes de abrirlo. Sacar el cassette de la
bolsa sellada y usarla lo antes posible.
● Aquellas muestras que presenten partículas visibles deben ser
centrifugadas, filtradas o permitir que sedimenten para obtener
una muestra clara para realizar la prueba.
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PROCEDIMIENTO DE LA TÉCNICA
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INTERPRETACIÓN DE RESULTADOS
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NEGATIVO:* Aparecen dos líneas. Una línea roja debe estar en la zona
del control (C) y otra línea roja o rosa aparecerá en la zona de la prueba
(T). Este resultado negativo indica que la concentración de Cocaína está
por debajo del nivel detectable (300 ng/mL).
*NOTA: La intensidad del color rojo de la línea de la región de la prueba
(T) puede variar, pero cualquier coloración roja, por muy débil que sea,
deberá considerarse como resultado negativo.
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GRUPO 400
● Revise el procedimiento y repita la prueba usando una nueva
prueba. Si el problema persiste, deje de utilizar ese lote y contacte
con su distribuidor.
CONTROL DE CALIDAD
● Un control interno está incluido en la prueba. La línea roja que
aparece en la región de control (C) es considerada como un
procedimiento de control interno. Confirma que se ha utilizado un
volumen suficiente de muestra y se ha realizado correctamente la
técnica.
Se recomienda realizar controles positivos y negativos como buena
práctica de laboratorio para verificar tanto el procedimiento como el
comportamiento de la prueba.
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● Un resultado positivo indica presencia de la droga o de sus
metabolitos, pero no indica el nivel de intoxicación, la vía de
intoxicación o la concentración de droga en la orina.
● Un resultado negativo no necesariamente indica la ausencia de
droga en la orina. Pueden obtenerse resultados negativos cuándo
la droga está presente pero en niveles inferiores a los del cut-off de
la prueba.
● Limpiar y desinfectar las salpicaduras de muestra usando
hipoclorito sódico u otro desinfectante adecuado.
● Durante la realización de la prueba, colocar el cassette sobre una
superficie limpia, plana y sin vibraciones.
● No es recomendable realizar múltiples ciclos de congelamiento y
descongelamiento. Esto puede generar resultados erróneos. En
caso de usar muestras congeladas, éstas deben ser
homogeneizadas y centrifugadas antes de usar.
● No leer pasado los 10 minutos ya que pueden obtenerse
resultados erróneos.
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BENZODIACEPINAS Y/O METABOLITOS QUE SE EXCRETAN EN
FORMA CONJUGADA POR CROMATOGRAFIA EN
CAPA FINA EN ORINA
Objetivos
● Interpretación de resultados.
INTRODUCCION
Las benzodiacepinas son derivados tricíclicos aromáticos y
heterociclicos.la mayor parte son derivados 1,4 benzodiacepinas, aunque
se han desarrollado compuestos 1,5 benzodiacepinas como el clobazam.
El grupo comprende el: lorazepam, bromazepam, clordiacepoxido,
oxazepam, clobazam, flurazepam, clonazepam, flunitrazepam,
nitrazepam, diazepam,y los metabolitos correspondiente.
Dentro de este punto de vista farmacológico son depresores del Sistema
Nervioso Central. Tienen propiedades hipnóticas, sedantes, ansiolíticas
anticonvulsivantes y miorelajantes.
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Sustancias identificadas: Este método solo se aplica únicamente a las
benzodiacepinas y/o metabolitos que se excretan en forma conjugada en
orina.
Fundamento:
El método de cromatografía en capa fina previo tratamiento de las
muestras, que comprende la hidrólisis ácida y la extracción
liquido-liquido del producto de hidrólisis.
Este método comprende tres etapas:
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El color de los compuestos varía.
Muestra:
- Muestra: Orina
Condiciones de la muestra:
La muestra debe ser colectada en un frasco tapa rosca debidamente
rotulada y lacrado, se puede conservar a temperatura de refrigeración
antes de su análisis y no lleva conservante.
Técnica:
- Hidrólisis ácida
- Extracción liquido-liquido del producto de hidrólisis
- Cromatografía en capa fina
Reactivos:
- Ácido clorhídrico
- Hidróxido de sodio
- sulfato de sodio anhidro
- alcohol isopropilico
- Éter etílico
- Cloroformo
- Ácido Acético
- Reactivo de Dragendorf
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Patron
PROCEDIMIENTO
● Trazar una linea a 1 cm del pie de la placa cromatográfica y marcar
sobre esa linea con lapis graffito.
ELUYENTE
● Cloroformo
● Éter etílico
● Ácido acético
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REVELADOR
● Reactivo de Dragendorff
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PREPARACION DE REACTIVOS
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DETERMINACION DE MONOXIDO DE
CARBONO (CO)
Este método se basa en la reducción del PdCl2 por acción del CO a Pd0 que aparece en
forma de película plateada sobre la superficie del compartimiento central de la
cámara de Conway.
Material y Equipos
Unidad de Conway
Pipetas de 10 ml y 1 ml.
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Reactivos
- Solución de
- Vaselina
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RESULTADOS.- En caso positivo se formara una película argéntica sobre la superficie
del compartimento central debido a la reducción del Pd Cl2 por acción del CO a Pd0
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Determinación de Colinesterasa
Objetivos
● Interpretación de resultados.
Introducción
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FUNDAMENTO:
FUNDAMENTOS DEL METODO
butiriltiocolina + H2 O Che tiocolina + butirato
tiocolina + DTNB 2-nitro-5-mercaptobenzoato
REACTIVOS PROVISTOS
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CONDICIONES DE REACCIÓN
Longitud de onda: 405 nm
Temperatura de reacción: 25,30 o 37 ºC
Volumen de la muestra: 20 ul
Volumen de reactivo (sustrato):3 ml
o
TABLA (25-30-37 C)
ΔA/30 U/l ΔA/30 seg U/l
seg
0,010 227 0,130 2.952
0,015 341 0,135 3.066
0,020 454 0,140 3.179
0,025 568 0,145 3.283
0,030 681 0,150 3.407
0,035 795 0,155 3.520
0,040 908 0,160 3.634
0,045 1.022 0,165 3.747
0,050 1.136 0,170 3.861
0,055 1.249 0,175 3.974
0,060 1.363 0,180 4.088
0,065 1.476 0,185 4.201
0,070 1.590 0,190 4.315
0,075 1.703 0,195 4.428
0,080 1.817 0,200 4.542
0,085 1.930 0,205 4.655
0,090 2.044 0,210 4.769
0,095 2.157 0,215 4.883
0,100 2.271 0,220 4.996
0,105 2.385 0,225 5.110
0,110 2.498 0,230 5.223
0,115 2.612 0,235 5.337
0,120 2.725 0,240 5.450
0,125 2.839 0,245 5.564
0,250 5.677
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1. Ejemplo:
0,200
0,220
0,240
0,260
0,06 30
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GRUPO 400
0.002 X Fc = 22.710 =0.045 = 1022 UI/L
Otros ejemplos: