Bioquímica Aplicada 2021-II

UNMSM – Fac. Odontología

César A. Bonilla F.
Sofía Espinoza E.; Jorge Colchado C., Carlos Linares W.

PRACTICA Nº 3

EVALUACIÓN DE LA HEMOSTASIA DEL HIERRO

HEMOGLOBINA (Hb)

ASPECTOS GENERALES:
La hemoglobina es una proteína globular constituida por un grupo
prostético Hemo y una porción proteica la globina, el grupo hemo es una molécula de porfirina que
contiene un átomo de hierro al centro del anillo tetrapirrólico.

La molécula de hemoglobina está conformada por cuatro cadenas polipeptídicas: 2 cadenas  y las dos
cadenas restantes pueden ser 2 cadenas , ,  o  dependiendo del tipo de hemoglobina.
La síntesis de hemoglobina se realiza de manera independiente:
La porción hemo se sintetiza en todos los tejidos, pero su síntesis se hace más pronunciado en la medula
ósea y en el hígado en dos fases: la primera parte se sintetiza en las mitocondrias y la segunda en el
citosol, siendo la molécula precursora el succinil CoA + la glicina, pasa por una serie de reacciones
complejas hasta formar una porfirina. En la segunda fase la globina se sintetiza como toda proteína en
todas las células a partir de aminoácidos. La porción hemo más la globina se unen dentro de los
eritrocitos y forma la hemoglobina.

Tipos: La hemoglobina humana es de varios tipos:

Hemoglobina adulta A1.- Constituida por dos cadenas alfa con una secuencia de 141 aminoácidos y dos
cadenas beta con 146 residuos de aminoácidos, es el principal tipo de hemoglobina humana.
Hemoglobina adulta A2.- Constituido por dos cadenas alfa y dos cadenas delta.
Hemoglobina embrionaria. - Constituido por 2 cadenas alfa y dos cadenas épsilon, se sintetiza
aproximadamente en los dos primeros meses de vida intrauterina.
Hemoglobina fetal. - Constituido por dos cadenas alfa y por 2 cadenas gama, se forma del segundo al
octavo mes de vida intrauterina.
La diferencia entre los tipos de hemoglobina está en la secuencia de sus residuos de aminoácidos.
Formas de hemoglobina. -
La estructura cuaternaria de la hemoglobina se encuentra en dos formas:
-Forma desoxigenada o desoxihemoglobina, que se caracteriza porque la conformación de su estructura
cuaternaria está en estado tenso y se denomina estado T.
-Forma Oxigenada u Oxihemoglobina se encuentra en estado relajado y se denomina estado R.
Hemoglobinas anormales. –
Constituyen un grupo de enfermedades caracterizadas por defectos en la estructura de la molécula de
hemoglobina por alteración de los genes responsables, una de las hemoglobinas anormales más
estudiadas es la hemoglobina S que se caracteriza por la alteración de la secuencia de aminoácidos en la
cadena beta, produce la anemia falciforme, los eritrocitos de un paciente con anemia falciforme tienen la
forma de hoz, son más frágiles que las normales, se hemolizan fácilmente llegando a una anemia que
puede llegar a ser grave cuando las células falciformes son muy altas.

Significado clínico
El cuadro común relacionado con la disminución de hemoglobina sérica es la anemia.
Esta patología implica una reducción por debajo de lo normal en el número de glóbulos rojos, en la
cantidad de hemoglobina y en el volumen globular y consecuente disminución desde la capacidad de
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transporte de oxígeno en la sangre, son los rasgos característicos del cuadro clínico y constituyen las
bases patológicas para la mayoría de los síntomas y signos, tales como taquicardia, debilidad etc.
Existen situaciones en las que la concentración de hemoglobina se encuentra anormalmente elevada
debido a una superproducción de glóbulos rojos: este trastorno puede ser primario como en el caso de la
policitemia vera o secundarios como en ciertos tumores renales u ováricos.
La única condición natural y fisiológica que afecta los niveles de hemoglobina es la altitud, puesto que a
bajas presiones de oxígeno se produce una compensación mediante el incremento de glóbulos rojos y en
la concentración de hemoglobina circulante.
En general debe tenerse en cuenta que un aumento excesivo de la concentración de hemoglobina libre
en sangre produce efectos tóxicos sobre los túbulos renales que pueden conducir a daño renal severo.

HEMATOCRITO (Hto)

Es un examen de sangre que mide el porcentaje de los glóbulos que se encuentran en la sangre total. La
medición depende del número de glóbulos rojos y de su tamaño.
El hematocrito casi siempre se ordena como parte de un conteo sanguíneo completo.
El médico puede ordenar este examen si se presentan signos de anemia, leucemia, deficiencia en la dieta
u otra afección médica.

Significado clínico
Los valores bajos de hematocrito se asocian a:
• Anemia
• Pérdida de sangre (hemorragia)
• Insuficiencia de la médula ósea
• Destrucción de los glóbulos rojos
• Leucemia
• Desnutrición o deficiencia en la dieta específica
• Mieloma múltiple
• Artritis reumatoide
Los valores altos de hematocrito se asocian a:
• Deshidratación
o quemaduras
o diarrea
• Eritrocitosis
• Niveles bajos de oxígeno en la sangre (hipoxia)
• Policitemia vera

Los rangos de los valores normales pueden variar ligeramente entre diferentes laboratorios. Hable con el
médico acerca del significado de los resultados específicos de su examen.

FIERRO (Fe) Y TRANSFERRINA (Trf)

ASPECTOS GENERALES:

El fierro es uno de los micronutrientes más estudiado y mejor conocido, la cantidad de fierro existente en
el organismo es aproximadamente 3.5g. en el varón y 2.3g. en la mujer, está distribuida según su función.
Presenta distintas funciones como formar parte de la proteína heme en el grupo prostético de porfirina -
fierro de la hemoglobina y la mioglobina; en el metabolismo energético oxidativo formando parte de los

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citocromos que transportan los electrones para la producción oxidativa de energía celular (ATP): también
formando parte de la estructura de enzimas como la catalasa y peroxidasa.
El fierro circula en estado férrico (Fe+3) unido a la Transferrina, cuya función es captar el fierro de la
mucosa intestinal o de los depósitos y forma un complejo transferían-Fe, los que son transportados a los
órganos hematopoyéticos para su uso.
El Fe es almacenado como ferritina y hemosiderina, encontrándosele en el sistema retículo endotelial del
hígado, bazo, médula ósea.

Significado clínico
La disminución patológica de los niveles de fierro sérico se puede producir por:
-Pérdida por hemorragias o nefrosis
-Carencia de fierro en la dieta
-Infecciones crónicas
-Tumores malignos
-Artritis reumatoide
Otras causas son la pérdida de sangre a través del tracto intestinal, úlceras gástricas o duodenales y
carcinomas de estómago y colon.
Fisiológicamente existe disminución en la anemia ferropénica durante el embarazo.
Por otra parte, varias enfermedades o situaciones conducen al incremento de fierro sérico como:

El incremento patológico de los niveles de fierro sérico se puede producir por:

-Anemia hemolítica
-Intoxicación por plomo
-Necrosis aguda de células hepáticas (por aumento en la liberación de fierro en las reservas corporales)
-Hemocromatosis y siderosis por transfusión (mayor velocidad de absorción de fierro)
-Por síntesis defectuosa de hemoglobina

Fisiológicamente solo la tercera parte de la transferrina se satura con fierro, el resto está libre para unirse
y transportar cualquier eventual aporte de fierro y su actividad fisiológica se determinar midiendo la
capacidad total de fijación de fierro.

La capacidad total de fijación de fierro está aumentada patológicamente en las anemias post-
hemorrágicas y ferropénicas y en general, en las insuficiencias hepáticas y fisiológicamente en el
embarazo. En cambio, se encuentra disminuido en ciertas anemias con disproteinemia, en las
hepatopatías crónicas y en las grandes pérdidas proteicas del síndrome nefrótico.

DETERMINACIÓN DE HEMOGLOBINA (Hb)

I.- OBJETIVO:
- Determinar la concentración de hemoglobina en sangre y el % de hematocrito

II.- FUNDAMENTO DEL METODO:

La hemoglobina presente en la muestra en presencia del ferrocianuro se oxida y forma la

Metahemoglobina que a su vez se combina con iones de cianuro a pH 7.2 formando el cianuro de
hemoglobina o Cianometahemoglobina.

III.- MATERIALES Y REACTIVOS.

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-Reactivo de Drabkin -Estándar de hemoglobina -Micropipeta -Espectrofotómetro

IV.- PROCEDIMIENTO:

Material biológico: sangre total extraída mediante punción en el pulpejo del dedo.
Rvo. / Tubo BLANCO STANDARD MUESTRA
Rvo. Drabkin 5 mL 5 mL 5 mL
Estándar de Hb -- 20 uL --
Muestra (sangre) -- -- 20 uL
Mezclar y esperar 3 minutos para hacer la lectura en el espectrofotómetro a 540 nm.

V.- CALCULOS
Hemoglobina (g/dL) = Abs. Muestra x f f = [Std. g/dL]
Abs. Std

DETERMINACIÓN DE HEMATOCRITO (Hto)

I.- OBJETIVO:
- Determinar el % de hematocrito de cada uno de los alumnos

II.- FUNDAMENTO DEL METODO:

La sangre colectada en capilares heparinizados (cintillo rojo) se sedimenta por centrifugación, luego de lo
cual se determina la medida del volumen total de sangre (borde superior del plasma) al cual se le
considera el 100% y la medida del volumen del paquete corpuscular (masa roja), determinándose
finalmente a que porcentaje le corresponde. No se necesita preparación especial para este examen.
III.- MATERIALES Y REACTIVOS.

-Plastilina para hematocrito -Centrífuga -Regla -Alcohol

IV.- PROCEDIMIENTO:

1.-Desinfecte con alcohol el pulpejo del dedo Anular

2.-Retire la lanceta de su envase y pinche el pulpejo del dedo anular, con decisión y de manera lateral.
3.-Deje fluir la sangre hasta que forme una buena gota, coloque la punta del capilar en ángulo de -30º
(inclinado hacia abajo) en relación al dedo, deje que llene hasta medio centímetro antes del cintillo rojo.
4.-Retirar el capilar lleno, colocarlo sobre la plastilina presionándolo a fin de que esta tapone el extremo
del capilar, paralelamente coloque un algodón, sin alcohol, sobre la herida.
5.-Rotular el capilar y proceder a centrifugar por 5 minutos a 3,000rpm.
6.-Retirar el capilar y medir con una regla: Volumen total de sangre (100%) que es la distancia total,
desde el borde superior de la plastilina al borde superior del plasma; y Volumen del paquete globular
(¿%?) que es la distancia desde el borde superior de la plastilina al borde superior de la masa roja.

V.- CALCULOS
% Hto = Medida del paquete globular x 100
Medida de la sangre total
DETERMINACIÓN DE FIERRO (Fe) Y TRANSFERRINA (Trf)

I.- OBJETIVOS

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-Determinación de fierro y transferrina en suero por el método colorimétrico
-Determinación de la saturación de transferrina en suero

II.- FUNDAMENTOS DEL METODO:

a) Determinación de Fierro:

El fierro sérico se libera de su unión con la proteína transportadora específica, la transferrina, en

buffer succinato de pH 3.7 y en presencia de un reductor, el ácido mercaptoacético; posteriormente
reacciona con el reactivo de color, peridil bis–fenil triazina sulfonato, dando un complejo color
magenta, que se mide a 560nm.

b) Determinación de Transferrina:

La transferrina se determina por su actividad fisiológica de captar Fe+3 a un pH mayor de 7.2, donde
la transferrina se satura en presencia de Fe+3 en exceso. El remanente de Fe+3 no ligado se elimina
totalmente por co precipitación con carbonato de magnesio.

El fierro unido a la transferrina se libera y determina colorimetricamente con la técnica de Fer color.
La cantidad de transferrina se expresa como los microgramos de Fe +3 con que está saturada

III.- MATERIAL Y REACTIVOS:

-Reactivo de Fer – color -Agua destilada -Tubos de ensayo -Centrífuga

-Micropipetas -Espectrofotómetro -Kits para determinación de Transferrina

IV.- PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACION DE FIERRO Y TRANSEFERINA:

PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACION DE TRANSFERRINA:

a) En un tubo de ensayo colocar 500 uL de suero y 500uL de solución saturante, mezclar e incubar por 5
min a 37 ºC.
b) Con el dosificador agregar el contenido de una medida al ras del Adsorbente y agitar vigorosamente
por 10 min en sentido longitudinal.
c) Centrifugar por 10 a 15 min a 4000 rpm hasta obtener un sobrenadante límpido.
d) Coger cuidadosamente 500uL del sobrenadante y agregarlos al tubo Mtrf (Transferrina) en el
esquema de trabajo para el dosaje de fierro (*) como se indica.

PROCEDIMIENTO PARA LA DETERMINACION DE FIERRO:

Realizar el siguiente esquema de trabajo rotulando correctamente los tubos:

Rvo. / Tubo B S M (suero) Mtrf (Transferrina)
(*)
Agua bidestilada 500 uL - - -
Standard - 500 uL - -
Muestra (Suero) - - 500 uL -
Sobrenadante de Transferrina - - - 500 uL
Buffer/Reductor 2 mL 2 mL 2 mL 2 mL
Mezclar y leer la absorbancia solo de los tubos “M” (BS, Blanco de suero) y Mtrf (Btrf, Blanco de
transferrina) a 560 nm.

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Agregar, manteniendo el frasco gotero en posición vertical

Rvo. PBTS 1 gota 1 gota 1 gota 1 gota

Mezclar y leer todos los tubos a 560 nm entre 6 y 20 min, llevando a cerro con agua destilada.
V.- CALCULO DE LOS RESULTADOS:

Corregir las lecturas del S y las muestras M (suero) y Mtrf (transferrina), restando la absorbancia de los
blancos correspondientes.

S - B = S (corregida)
M - (B + BS) = M (corregida)
M - (B + Btrf) = Mtrf (corregida)

Fe (ug/dL) = M (corregida) x f f = [Std. 100 ug/dL]

Abs. Std. Corregida

Fe (ug/dL) = Mtrf (corregida) x f

CALCULO DE LOS RESULTADOS:

Corregir las lecturas y efectuar los cálculos de cómo para la determinación de fierro sérico, multiplicando
por dos el resultado final (recíproca de la dilución realizada a la muestra de suero).
Habitualmente se realiza la determinación de fierro sérico juntamente con la de transferrina.

En este caso se informan tres valores:

-Hierro sérico
-Transferrina y
-% de saturación de la transferrina mediante la siguiente fórmula.

Saturación (%) = Fierro sérico ug/ dL x 100

Transferrina (ug/dL)

Si se desea efectuar simultáneamente la determinación de Fierro sérico para emplearlo en la

determinación del % de saturación, se deberá empezar con el ensayo de saturación de transferrina 30
min antes.

VALORES DE REFERENCIA
Hematocrito: Hombre: 40.7 a 50.3 %
Mujeres: de 36.1 a 44.3 %
Hemoglobina: Mujeres 11 - 14 g/dL
Hombre 13 - 16 g/dL
Fierro: 60 a 160 ug / dL
Varones: hasta 114.6ug / dL
Mujeres : hasta 113.3 ug / dL

Transferrina (capacidad total de fijación de fierro): 250 – 400ug/dL

Saturación de la transferrina: 20 – 55 %

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PRACTICA N° 3
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1.-MARCO TEORICO:

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Nombre: ........................................................... Turno: ............................. Profesor: .............................
2.-CALCULOS:

3.-RESULTADOS Y DISCUSIÓN:

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PRACTICA N° 3
EVALUACIÓN DE LA HEMOSTASIA DEL HIERRO
Nombre: ........................................................... Turno: ............................. Profesor: .............................
CUESTIONARIO
1.- Métodos de dosaje de Ferritina y Hemosiderina

2.- Anemias Ferropénicas aguda, causas, manifestaciones

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3.- Interacción del Fe en la estructura del tejido dentario

4.- Absorción del Fe:

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