RECUENTO DE BACILLUS CEREUS, EPORAS SULFITO REDUCTORAS,

MOHOS Y LEVADURAS
1 David Andres Arias; 2 Juliana Cano Madrid; 3 Maria Camila Castaño Hoyos

RESUMEN

Antecedentes: En esta práctica se desarrolló el cultivo de una muestra de leche en polvo

KLIM; de la cual se toma una alícuota de 11,08 g para proceder a la disolución agua
peptonada y poder realizar su montaje en un medio de Agar MYP, para hacer el recuento
de Bacillus; esta misma cantidad de muestra se utiliza para el recuento de mohos y
levaduras. Como sabemos Los alimentos más susceptibles de ser contaminados por
cepas de B. cereus, mohos y levaduras  incluyen, harinas, carnes, leches, quesos y
formulas infantiles de leche en polvo, por ende estos microorganismos son el causante de
intoxicaciones en recién nacidos o niños menores de siete años. En la actualidad las
fórmulas infantiles con leche en polvo son consumidas a gran escala ya que las madres
no cuentan con un tiempo adecuado para alimentar a sus hijos de forma natural; es por
esto que la industria alimentaria debe tener varios filtros de calidad; para que dichos
microorganismo no lleguen al consumidor final. Mientras que para las esporas
sulfitoreductoras se utiliza una muestra de chorizo de la marca D1, con una alícuota de
10, 08 g, donde se hace el respectivo procedimiento para el recuento de dichos
microorganismos. Objetivo: Aislar B. cereus, mohos y levaduras a partir de la muestra de
leche en polvo, para así identificar la falla en su proceso de calidad. Con la muestra del
chorizo se busca determinar la presencia de Clostridium perfringens sulfito reductores de
y plicar el método de conteo de bacterias anaerobias en alimentos.

PALABRAS CLAVES: B. cereus, esporulado, calidad, Clostridium, mohos y levaduras

CARACTERISTICAS DE LA MUESTRA:

 BACILLUS CEREUS – MOHOS Y LEVADURAS

Para estos dos cultivos se utilizó una muestra de leche en polvo KLIM. Como sabemos
la leche en polvo se obtiene al deshidratar leche pasteurizada se elimina la mayor parte
de su agua de constitución, dejando un máximo del 5%. El 95% restante corresponde a
proteínas, lactosa, grasa, sales minerales, etc. Este producto tiene un pH alrededor de
6.6, su actividad acuosa es muy baja al ser un producto en polvo y con mucha grasa; ya
que a mayor contenido grasa menor es la adsorción de humedad.

 ESPORAS SULFITO-REDUCTORES: CLOSTRIDIUM

Para este cultivo se utilizó un chorizo de la marca D1, como sabemos el chorizo se
elabora con carne picada, grasa de cerdo, pimentón, aditivos y muchas veces colorantes,
también se utilizan las bacterias ácido lácticas (BAL) para su elaboración, donde se
comprenden un número elevado de bacterias Gram-positivas, cuya característica común
es la producción de ácido láctico a partir de los carbohidratos.

MEDIOS DE CULTIVO:

 BACILLUS CEREUS

Se utilizó agua peptonada para hacer la disolución de la muestra, esta se emplea como
diluyente en muestras alimentarias, aguas y materiales diversos. Para la realización de la
prueba del Indol en aquellos microorganismos capaces de producirlo, este medio es
adecuado para determinar los organismos Indol-positivos y puede utilizarse en lugar de
los Caldos Triptófano. En usos generales se puede emplear para el cultivo de una gran
variedad de microorganismos, siempre y cuando no presenten exigencias particulares.

Se sembró en agar MYP (Manitol-Yema de huevo y Polimixina), este es un agar selectivo

y diferencial recomendado para el aislamiento y recuento de Bacillus cereus en muestras
de alimentos y ambientales.
El agar MYP es un medio selectivo y diferencial, específico para el aislamiento de B.
cereus en alimentos. En el medio B. cereus no utiliza el manitol y la mayoría de las cepas
producen fosfolipasa C (lecitinasa). El manitol es el carbohidrato y su fermentación es
detectada por el indicador de pH rojo fenol. La yema de huevo permite la detección de
actividad de lecitinasa (precipitación). Polimixina B inhibe a microorganismos Gram (-) y el
NaCl mantiene el ambiente osmótico. La peptona aporta la fuente de nitrógeno, vitaminas
y carbono. El agar es adicionado como agente solidificante.
  MOHOS Y LEVADURAS

Se utilizó el agua peptonada como anteriormente se mencionó en el proceso de B. cereus

y para su cultivo el agar Sabouraud que es un medio de cultivo que por sus características
funciona como medio de enriquecimiento para hongos y que en caso de contener cloranfenicol
u otro antibiótico, se convierte en un medio selectivo para los mismos.

 ESPORAS SULFITO-REDUCTORES: CLOSTRIDIUM

Se utilizó para la disolución del chorizo agua peptona, que como se mencionó
anteriormente funciona como un medio de cultivo el cual sirve como diluyente potencial y
permite el crecimiento de microorganismos.
Agar sps: la mayor parte de los Clostridios reducen el sulfito a sulfuro, que se puede poner de
manifiesto por el color negro producido con los iones de hierro. El Sulfato de Polimixina y la
Sulfadiazina inhiben el crecimiento de la flora acompañante y la peptona de caseína y el
extracto de levadura representan el aporte de nutrientes.

PROCEDIMIENTO:

 BACILLUS CEREUS

Se procede a diluir 11,08 g de leche en polvo en 90 ml de agua peptonada, el cual se

lleva al stomacher, que nos ayuda a tener una mezcla homogénea en un menor tiempo,
este funciona por la acción de palas gemelas oscilantes sobre la muestra contenida en el
interior de una bolsa de plástico estéril, se procede a realizar disoluciones de 10−1 , 10−2 y
10−3 y pipetear por duplicado 1mL de cada una de las diluciones, los cuales se llevaron al
agar MYP y se dejaron incubación por 48 horas; pasado este tiempo se procede hacer
una tinción para identificar sus microorganismos.

 MOHOS Y LEVADURAS

De las mismas disoluciones utilizadas en B. cereus, se procede a tomar la muestra de

1mL y llevar a una caja petri vacía y después se agregó el agar, se homogeneizó y
finalmente se incuba de forma invertida

 ESPORAS SULFITO-REDUCTORES: CLOSTRIDIUM

Se pesaron 10.0 g de muestra el cual se le adicionó 90 mL de agua peptonada y se llevó

al stomacher por 1:50 ya que al ser una muestra con grasa y trozos de carne su
homogenización es un poco más complicada, luego se procede hacer las disoluciones de
10−1, 10−2 y 10−3 y pipetear por duplicado 1mL de cada una de las diluciones, los cuales
se llevaron al agar SPS que estaba contenido en un tubo de ensayo, Los tubos se llevan
a baño maría a 80°C por 10 minutos, enfriar y adicionar otros 10ml de Agar
SPS para hacer un medio más anaerobio, después de tener los duplicados estos se llevan
a un medio mucho más anaerobio donde se dejan en la jarra de anaerobiosis cerrada por
48h

RESULTADOS

 BACILLUS CEREUS

CULTIVO MICROORGANISMO IMAGEN

10−1 Mohos y levaduras

Positivo para Bacillus

10−2 cereus esporulados, Gram
positivos y Gram negativos

10−3 No se encontró ningún

microorganismo

 MOHOS Y LEVADURAS
 CULTIVO MICROORGANISMO IMAGEN

se encontraron hongos y
10−1 una levadura

se encontraron esporas
10−2 esporulando y hongos

10−3 se encontraron hongos

incontables

 ESPORAS SULFITO-REDUCTORES: CLOSTRIDIUM

CULTIVO MICROORGANISMO IMAGEN

 No se encontraron ningún
10 −1 tipo de colonia

La muestra por duplicado

arrojó dos tubos
incontables; uno
completamente negro y otro
10−2 con esporas
sulfitoreductoas, también
creemos que se generó un
microorganimo que puede
ser Bacillus

se encontraron 3 esporas
sulfitoreductoras y un
microorganismo en forma
10−3 circular y blanca, puede ser
Bacillus

ANÁLISIS DE RESULTADOS

 BACILLUS CEREUS
Como sabemos la leche en polvo contiene un alto contenido de nutrientes y proteína, lo
que lo hace un medio de cultivo muy atractivo para los microorganismos como en la
muestra 10−1 donde se observaron algunos mohos y levaduras, lo que puede inhibir el
crecimiento de Bacillus. Estos microrganismos se pueden generar por muchos aspectos
en el proceso de calidad; como lo son el medio ambiente, inocuidad de superficies,
trasporte e higiene del personal.

En la muestra 10−2 se reconoció un resultado positivo para Bacillus cereus esporulados,

Gram positivos y Gram negativos,  la elevada contaminación de B. cereus puede deberse
a su alto contenido de grasa, ya que este factor tiende a proteger las bacterias frente a
los tratamientos reductores de la carga microbiana como los tratamientos térmicos,
pasteurización y pulverización de la leche en polvo. De igual forma, la actividad de agua
(Aw) de este producto puede favorecer la propagación de esporas, la contaminación de
leche con esta bacteria está muy relacionada a vacas enfermas con mastitis aguda.

El crecimiento y la multiplicación de las células ocurren típicamente dentro del rango de

temperaturas de 10-48 °C, mientras que el óptimo se encuentra entre 28-35 °C. Sin
embargo, se han identificado variantes psicrotróficas de B. cereus en leche pasteurizada
en polvo capaces de crecer e iniciar la descomposición a temperaturas tan bajas como 5
°C. El pH óptimo de crecimiento se encuentra entre 4,3 y 9,3. (scielosp)

 MOHOS Y LEVADURAS

imagen(1)

Los mohos y levaduras se encuentran ampliamente distribuidos en el ambiente, pueden

encontrarse como flora normal de un alimento o como contaminantes en equipos mal
sanitizados; algunas especies de mohos y levaduras son útiles en la elaboración de
ciertos alimentos, sin embargo, también suelen ser causantes de la descomposición en
otros alimentos (1), para el desarrollo del análisis de la leche en polvo (marca klim) con el
fin de detectar si esta contaba con mohos y levaduras se usó el agar sabouraud, es un
agar con medio de uso específico para la detección, cuenta y aislamiento de mohos y
levaduras , por su alto contenido de vitaminas proporciona excelentes condiciones de
crecimiento a una amplia variedad de microorganismos,  como se puede observar en la
imagen(1). 
Debido a que los mohos y levaduras presentan un crecimiento lento, estos se presentan
en alimentos donde su crecimiento bacteriano sea menos favorable, las condiciones de
estos alimentos pueden ser: pH, baja humedad, baja temperatura de almacenamiento,
presencia de antibióticos, exposición del alimento a la irradiación entre otros (1),el
alimento usado para este análisis, la leche en polvo es un alimento el cual no contiene
mucha humedad, es por esta razón que este tipo de microorganismos aprovechan que el
alimento es seco e inician su crecimiento en él. 
  ESPORAS SULFITO-REDUCTORES: CLOSTRIDIUM

El género Clostridium está formado por un grupo heterogéneo de bacilos grampositivos

anaerobios esporulados. Está ampliamente distribuido en la naturaleza, principalmente en
el suelo y en el tracto intestinal de muchas especies animales incluido el hombre, y puede
causar infecciones de origen exógeno y de origen endógeno.
Al ser una muestra de chorizo; este tiene sus ingredientes más heterogéneos lo que
conlleva a un tiempo mucho más prolongado en el stomacher y mucha más atención a la
hora de hacer el cultivo.

En la muestra 10−1 no se encontró ningún microorganimos, esto se pude generar por el

tamaño del tubo o una mala práctica a la hora de hacer el cultivo, mientras que en la
muestra 10−2 se observaron 2 duplicados, uno donde no se podía observar nada, ya que
el tubo estaba completamente negro y el segundo tubo tenia demasiadas colinas negras
con microorganismos de color blanco el cual creemos que pueda ser Bacillus que son
esporulados, ya que este por lo general crece en embutidos y productos cárnicos con alto
contenido de humedad. En el tubo 10−3 se observaron tres esporas sulfito-reductoras.

Es difícil saber si la bacteria es incontable o no por el tamaño de tubos donde se realizó el

cultivo ya que todos los microorganismos se juntaron formando uno solo.

CONCLUSIONES

Para el crecimiento de mohos y  levaduras es necesario tener un medio de cultivo con

nutrientes como C,H,N,P,K,S,Mg,Fe o extracto de levadura, el medio de cultivo agar
sabouraud es el indicado para esto. 

Los hongos son seres vivos que tienen la capacidad de subsistir  en medios específicos
como temperaturas entre 25 y 30* C, pH entre 2 a 8,5, que sean húmedos y contengan la
suficiente cantidad de nutrientes 

B. cereus es un microorganismo que por su naturaleza ubicua y la presencia de la espora

puede contaminar diversos alimentos incluidos lácteos, carnes, ensaladas, cereales; cabe
resaltar que la producción de la toxina emética se ve favorecida por alimentos que tengan
glucosa y un contenido importante de proteína. El suelo es la fuente primaria de
contaminación de los alimentos con esporas de B. cereus, adicionalmente la
contaminación durante el procesamiento puede ocurrir porque las esporas presentan
propiedades de fuerte adhesión, puede formar biopelículas y persistir en la superficie de
equipos de procesamiento.

REFERENCIAS
NORMATIVA: DECRETO 616 de 2006: Por el cual se expide el Reglamento Técnico
sobre los requisitos que debe cumplir la leche para el consumo humano que se obtenga,
procese, envase, transporte, comercializa, expenda, importe o exporte en el país
[https://insumolab.cl/descargas/industria/placas_90mm/ficha_tecnica/12.pdf]

Romero C. R. Microbiologia y parasitologia humana [Internet]. 3rd ed. Editorial medica

panamericana; 2007 [cited 10 March 2019]. Available from:
[https://books.google.com.co/books?id=Wv026CUhR6YC&printsec=frontcover
&source=gbs_ge_summary_r&cad=0#v=onepage&q&f=falsehttp://clos
tridiumt cca902666.blogspot.com/]

Scielosp. 2012 [https://www.scielosp.org/pdf/rcsp/2012.v38n1/98-108]