Siembra e identificación de bacterias presentes en una muestra

de queso
Tania Lucia Armero Valdes
Juliana Benavides
Santiago Carreño Calvo

Resumen
Esta práctica de laboratorio se realizó para identificar carga bacteriana presente en una
muestra específica (queso). Se utilizaron varios medios de cultivos para observar el
crecimiento de diferentes bacterias que pueden estar presentes en el queso, como el BP, EMB
CM y Cs. La técnica de siembra utilizada fue la "siembra mediante extensión en superficie",
después de un proceso de dos diluciones seriadas para disminuir la cantidad de bacterias
presentes en la muestra. La carga bacteriana de la muestra se determinó mediante el conteo de
UFC. Se realizó la tinción de Gram para identificación de las bacterias presentes en la
muestra.

Palabras clave: bacteria, medios de cultivo, siembra mediante extensión en superficie, diluciones
seriadas, carga bacteriana, tinción de Gram, morfología, clasificación.

1. Introducción
El queso artesanal se obtiene a partir de la
fermentación de la leche cruda de ovinos,
bovinos y caprinos principalmente,
utilizando mano de obra de familias
campesinas. La forma de elaboración de
este queso está determinada por las
tradiciones, preferencias y condiciones
ambientales de cada región. Los
productores informales creen que el uso de
sus propias técnicas garantiza una textura,
sabor y aroma superiores, y consideran que
la introducción de nuevas tecnologías
puede afectar negativamente el resultado
final del queso. Este producto lácteo
derivado es destacado por su alta calidad
sensorial en comparación con variedades
similares de quesos producidos
industrialmente a partir de leche
pasteurizada. Esto se debe a la presencia
de una diversa microbiota que desempeña
un papel importante en la maduración,
incluyendo procesos como la glucólisis, la
proteólisis y la lipólisis, los cuales son
esenciales en la producción de queso. La
demanda del consumidor por este alimento
ha ido en aumento, sin embargo, los
alimentos naturales no son siempre más
seguros que los sometidos a procesos
industriales [1].
Varias investigaciones han señalado que el
consumo de queso artesanal ha contribuido
al aumento de brotes de enfermedades
transmitidas por alimentos (ETA), ya que
en el proceso de fabricación,
especialmente en puntos críticos como el
uso de leche cruda, la manipulación,
transporte, almacenamiento y aumento de
humedad, entre otros, presentar una gran
deficiencia, y estos elementos impiden
mantener un nivel de higiene adecuado en
el alimento, lo que resulta en un producto
inapropiado para el consumo humano.
La carga microbiana presente en el queso
es un claro indicador de su calidad. Los
microorganismos presentes en el queso
incluyen bacterias, mohos y levaduras que
pueden desarrollarse en presencia de
oxígeno. La presencia de contaminación en
la materia prima, temperaturas
inadecuadas durante los procesos, y
condiciones deficientes de
almacenamiento y transporte, son factores
que contribuyen a este problema. Además
de la microbiota normal, el queso artesanal
también puede albergar otras bacterias que
son patógenas y esto puede alterar el
producto, como la Salmonella spp.,
Staphylococcus aureus, Listeria
monocytogenes y Pseudomonas
aeruginosas, entre otras, estas son las
principales responsables de las ETA
asociadas al consumo de queso elaborado
de forma artesanal [2].
2. Materiales y métodos
Preparaciòn de la muestra
Se pesaron 10 gramos de queso, se
introdujeron en el erlenmeyer, el cual tenía
90 ml de agua peptona y con ayuda de una
varilla de vidrio se trituró el queso,
finalmente se dejó sedimentar y se
iniciaron las diluciones sucesivas.
Medios de cultivo
Bair Parker (BP)
Baird Parker Agar es un medio de cultivo
selectivo y diferencial utilizado para el
aislamiento y enumeración de
Staphylococcus aureus en alimentos y
muestras ambientales. Contiene emulsión
de yema de huevo y telurito, que inhiben el
crecimiento de la mayoría de las bacterias
excepto Staphylococcus aureus. El medio
está disponible como base, que puede
complementarse con otros agentes
selectivos según sea necesario. Baird
Parker Agar es moderadamente selectivo y
diferencial, lo que lo hace útil para la
detección y enumeración de estafilococos
coagulasa positivos [3][4].
EMB
EMB Agar (Agar eosina azul de metileno)
es un medio de cultivo selectivo y
diferencial utilizado para el aislamiento y
diferenciación de bacterias Gram-
negativas, particularmente miembros de la
familia Enterobacteriaceae. El medio
contiene tintes de eosina y azul de
metileno, que inhiben el crecimiento de
bacterias Gram-positivas y permiten la
diferenciación de bacterias fermentadoras
de lactosa y no fermentadoras de lactosa
en función del color de la colonia. El agar
EMB se usa comúnmente en microbiología
clínica y ambiental para la detección y
enumeración de coliformes fecales [5].
Cetrimide (CN)
Cetrimide Agar es un medio de cultivo
selectivo y diferencial utilizado para el
aislamiento e identificación de
Pseudomonas aeruginosa a partir de
diferentes materiales. El medio contiene
cetrimide, que inhibe el crecimiento de la
mayoría de las bacterias excepto
Pseudomonas aeruginosa y aumenta la Se realizó la tinción a las diferentes
producción de pigmentos de fluoresceína y colonias que se obtuvieron en los
piocianina. El agar cetrimida se usa diferentes medios de cultivo de las cajas
comúnmente en microbiología clínica y petri que corresponden a las diluciones 10-3
ambiental para la detección y enumeración y 10-4, se tomaron la muestras con ayuda
de Pseudomonas aeruginosa [6][7]. del asa metálica y se agregaron los
siguientes reactivos en su respectivo orden
Citrato de Simmons (Cs) y respetando los tiempos de reacción de
Simmons Citrate Agar es un medio de cada uno, reactivo de cristal violeta, lugol,
cultivo selectivo y diferencial utilizado alcohol acetona y por último reactivo
para la diferenciación de bacterias gram Safranina o fucsina.
negativas en función de la utilización de
citrato. El medio prueba la capacidad de 3. Resultados y Discusión
los organismos para utilizar el citrato Identificación de colonias de la muestra
como única fuente de carbono. El medio láctea (queso)
contiene dihidrógeno fosfato amónico
como única fuente de nitrógeno, fosfato
dipotásico como tampón, cloruro sódico
para mantener el equilibrio osmótico del
medio y citrato sódico como única fuente
de carbono. El agar citrato de Simmons se
usa comúnmente en microbiología clínica
y ambiental para la identificación de
Enterobacteriaceae [8][9].

Preparación de diluciones seriadas

Posteriormente se prepararon cinco
diluciones desde 10-2 hasta 10-6, para
preparar las diluciones se usaron cinco
tubos de ensayo, cada uno con 9 ml de Imagen 1. Colonias de queso en los 4
agua peptona. medios de cultivo.

Siembra mediante extensión en

superficie
Para este proceso se contó con la
disposición de 16 cajas de Petri, usando 4
tipos de Agar como son : BP, EMB CM y
Cs. La siembra mediante extensión en
superficie se realizó por duplicado para las
diluciones 10-3 y 10-4.

Técnicas de tinción de Gram

Tinción en bacterias
 negro brillante y alrededor un halo claro de
lipolisis el cual es representativo de esta
especie.Las tinciones de las placas 1 y 2 se
obtienen resultados iguales a nivel
microscópico, dado que se ven cocos
Grampositivos en agrupaciones que se
asemejan a racimos de uvas, confirmando
que se trata de bacterias del género de
Staphylococcus.

Imagen 2. Colonias en el medio BP

diluciones 10-3, 10-4 por duplicado

Como se puede observar en la imagen

anterior , se obtuvo buenos resultados en
las disoluciones y en la siembra ; por lo
tanto podemos decir que desarrollamos de
manera adecuada la respectiva aplicación.
El recuento de las unidades formadoras de
colonia (UFC),dio de la siguiente manera:
En la caja petri con disoluciòn 10-3 se
obtuvo 8 UFC y en en su duplicado se
obtuvo la misma cantidad de UFC, en la
siguiente disoluciòn que corresponde a 10-
4
, en una de las cajas y en su duplicado son
incontables las colonias debido a la gran
unión que hay entre ellas, se observa una
mancha.
Las colonias son redondas y convexas,
algunas varían en color, puesto que se ven
unas negras brillantes, negras con un
borde blnaco fino y otras negras opacas, en
cuanto al tamaño unas son más pequeñas
que otras, sin embargo, el tamaño no varía
de manera significativa.

Según las características anteriores, no se

tiene indicios de que la muestra de queso
tenga colonias sospechosas positivas para
Staphylococcus aureus puesto que sus
colonias generalmente presentan un color
 Imagen 4. Colonias en el medio CS
diluciones 10-3, 10-4 por duplicado

Imagen 3. Colonias en el medio EMB

diluciones 10-3, 10-4 por duplicado

En la dilución 10-3 se observan colonias

grandes de color verde metalizado con
Imagen 5. Colonias en el medio CM
bordes no regulares con lo que se prodia
diluciones 10-3, 10-4 por duplicado
identificar como Enterobacteria,
probablemente E. coli presente en la
muestra de queso. Tambien se pudo
4. Bibliografía
observar colonias de color morado con un
halo alrededor redondo y planas.
[1] Determinación de la inocuidad
En la dilución 10-4 se observó colonias de
microbiológica de quesos artesanales
color morado redondas convexas, unas
según las normas técnicas colombianas.
mas grandes que otras.
(2019, junio). search.scielo.org.
Recuperado 11 de mayo de 2023, de
https://search.scielo.org/?
q=bacterias+en+queso+artesanal&lang=es
&count=15&from=0&output=site&sort=&
format=summary&fb=&page=1#

[2] Merchán, N. Y. T., T, S. Z., Niño, L.

R., & Urbano, E. X. (2019).
Determinación de la inocuidad
microbiológica de quesos artesanales
según las normas técnicas colombianas.
Revista chilena de nutrición.
https://doi.org/10.4067/s0717-
75182019000300288
[3] Baird Parker Agar Base. (s. f.).
https://www.britanialab.com/. Recuperado
13 de mayo de 2023, de
https://www.britanialab.com/back/public/u
pload/productos/upl_607060f71db9b.pdf

[4] INSTRUCCIONES DE USO –

MEDIOS EN PLACA LISTOS PARA
USAR BD Baird-Parker Agar. (s. f.).
legacy.bd.com. Recuperado 13 de mayo de
2023, de
https://legacy.bd.com/europe/regulatory/A
ssets/IFU/HB/CE/PA/ES-PA-255084.pdf

[5] E.M.B. Agar (con Eosina y Azul de

Metileno). (s. f.). britanialab.com.
Recuperado 13 de mayo de 2023, de
https://www.britanialab.com/back/public/u
pload/productos/upl_6054e713a290e.pdf

[6] Cetrimide Agar (Pseudomonas

Selectice Agar Base). (s. f.).
www.sigmaaldrich.com. Recuperado 13 de
mayo de 2023, de
https://www.sigmaaldrich.com/deepweb/as
sets/sigmaaldrich/product/documents/
522/533/22470dat.pdf

[7] Cetrimide Agar | Principle |

Preparation | Results. (s. f.).
https://microbiologie-clinique.com/cetrimi
de-agar.html

[8] Aryal, S. (2022). Simmons Citrate

Agar- Composition, Principle, Preparation,
Results, Uses. Microbe Notes.
https://microbenotes.com/simmons-citrate-
agar/

[9] Simmons Citrate Agar | Principle |

Preparation | Interpretation. (s. f.).
https://microbiologie-clinique.com/simmo
ns-citrate-agar.html