MANUAL PRÁCTICO DE

MICROBIOLOGÍA CLÍNICA

PRACTICA N° 8

IDENTIFICACIÓN DE ENTEROBACTERIAS
OBJETIVOS
 Desarrollar técnicas de aislamiento e identificación para Enterobacterias.

 Conocer y aplicar la utilidad de las pruebas bioquímicas para la identificación de microorganismos

 Comprender el fundamento de las pruebas bioquímicas.

 Interpretar clínicamente los resultados arrojados por las pruebas bioquímicas

PRELABORATRORIO

1. ¿Mencione dos sistemas de identificación rápida?

- LIA: Lisina hierro agar

- Citrato de Simons

2. Exponga ventajas y desventajas de la utilización de los sistemas rápidos de identificación.

VENTAJAS DESVENTAJA

- Eficiente al momento de la identificación rápida. - Poca investigación al momento de saber el

comportamiento de enterobacter.
- Es extremadamente rápida.
- Requieren, para más seguridad, un método de
respaldo.

- Distensibilidad fuerte a los antimicrobianos

ensayados.

- Su alto costo lo hace un sistema poco rentable.

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3. Complete la tabla con los componentes de los medios selectivos y diferenciales para enterobacterias

Medio de cultivo Carbohidratos Sustancias selectivas Indicador de pH

Agar MacConkey Sales biliares y cristal 7,1 +/- 0,2

Lactosa violeta
Rojo negativo

Agar EMB
(Eosina, Azul de metileno) Lactosa y sacarosa Eosina, azul de metileno y 7,1 +/- 0,2
fosfato

Eosina y azul de metileno

Agar SS
(Salmonella-Shiguella) Lactosa pluripectona Sales biliares y verde 7,1 +/- 0,2
brillante

Rojo

Agar Hektoen Lactosa, sacarosa y Sales biliares 7,1 +/- 0,2

saucina
Azul

4. Mencione dos especies por cada género de Enterobacterias

Genero Especies

Klebsiella - Klebsiella pneumoniae

- Klebsiella oxytoca
Proteus - Proteus mirabilis
- Proteus vulgaris
Salmonella - Salmonella enterica
- Salmonella bongori
Shiguella - Shigella dysenteriae
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- Shigella boydii
Yersinia - Yersinia pestis
- Yersinia enterocolitica
Enterobacter - Enterobacter sakazakii
- Enterobacter aerogenes
Citrobacter - Citrobacter amalonaticus
- Citrobacter rodentium
Vibrio - Vibrio parahaemolyticus
- Vibrio vulnificus
Morganella - Morganella morganii
- Morganella psychrotolerans

INTRODUCCIÓN
Los miembros de la familia Enterobacteriaceae son bacilos gramnegativos, anaerobios facultativos que
fermentan la glucosa en anaerobiosis; citocromo oxidasa negativos; reducen los nitratos a nitritos. Algunas
de estas bacterias son móviles, en cuyo caso utilizan como estructura de movilidad flagelos perítricos. Son
llamadas Enterobacterias porque con frecuencia residen en el aparato digestivo de animales y humanos,
pero algunas especies también viven en la tierra y en el agua. Incluye los géneros Escherichia, Shigella,
Edwardsiella, Salmonella, Citrobacter, Enterobacter, Hafnia, Klebsiella, Serratia, Morganella, Proteus,
Providencia, Yersinia, Erwiniay Pantoea. La mayoría forman parte de la flora normal o son bacterias
ambientales, a excepción de los géneros Salmonella, Shigellay Yersinia, quienes son causantes de
infecciones gastrointestinales; es por eso que cuando se detectan en heces, es muy probable que estén
causando alteraciones fisiopatológicas.
Cuando las enterobacterias se introducen a un sitio del cuerpo estéril, producen enfermedades como
neumonía, infecciones de vías urinarias, septicemia, infecciones neonatales, infecciones de heridas y de
cirugías. Se comportan como patógenos oportunistas sobre todo en pacientes inmunocomprometidos.
La identificación de las Enterobacterias se basa principalmente en la presencia o ausencia de diferentes
enzimas codificadas por el material genético del cromosoma bacteriano. Los sustratos con los cuales
pueden reaccionar estas enzimas se incorporan al medio de cultivo junto con indicadores que detectan la
utilización del sustrato o la presencia de productos metabólicos específicos, estableciéndose así un perfil
bioquímico para hacer la identificación de la especie. Por tanto, los medios de cultivos deben satisfacer las
exigencias de crecimiento de cada microorganismo.
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MATERIALES
 Bata*

 Guantes *

 Tapabocas*

 Encendedor*

 Marcador de vidrio (por grupo de trabajo). *

 Papel filtro.

 Cultivos de Enterobacterias.

 Portaobjetos.

 Asas calibradas y rectas.

 Pipetas de pasteur.

 Tubos de ensayo

 Gradillas.

 Medios de cultivos: TSI, LIA, SIM, Citrato, RMVP

 Reactivo de Kovacs

 Incubadora

PROCEDIMIENTO
1. Agar TSI (agar Triple azúcar hierro)
Siembre el agar TSI con asa recta haciendo una punción central hasta el fondo del tubo y estrías en la
superficie.
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Principio: en el agar TSI se determina la capacidad de un microorganismo para hidrolizar los hidratos de
carbono Glucosa, lactosa y sacarosa, la producción de gases y la producción de ácido sulfhídrico (H2S).

Lectura: se efectúa después de 18 a 24 horas de incubación a 37°C. Se hace la lectura como un quebrado, la
reacción ocurrida en la superficie del medio corresponde al numerador (parte aerobia) y la reacción ocurrida
en la profundidad del medio corresponde al denominador (parte anaerobia) la acidez se denomina con la letra
A (color amarillo) y la alcalinidad con la letra K (color rojo).

Interpretación: en este medio se leen las siguientes reacciones bioquímicas:

Fermentación de la glucosa (K/A).

Fermentación de glucosa, lactosa y sacarosa (A/A).

No fermentación de los carbohidratos (K/K), la bacteria no utiliza hidratos de carbono, produciendo aminas
que alcalinizan el fondo y la superficie del medio. Algunas bacterias no fermentadoras solamente atacan la
peptona aeróbicamente dando un TSI (K/N), es decir que no hay cambio en el fondo del tubo.

Producción de gas: ruptura del medio

Producción de H2S: ennegrecimiento del medio.

2. Agar LIA (agar Lisina Hierro)

Sembrar con asa recta haciendo una punción central hasta el fondo del tubo y estría en la superficie.

Principio: En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura aportan los nutrientes para el desarrollo
bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, y la lisina es el sustrato utilizado para detectar la
presencia de las enzimas decarboxilasa y deaminasa. El citrato de hierro y amonio, y el tiosulfato de sodio, son
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los indicadores de la producción de ácido sulfhídrico. El purpura de bromocresol, es el indicador de pH, el cual
es de color amarillo a pH igual o menor a 5.2, y de color violeta a pH igual o mayor a 6.8.

Por decarboxilación de la lisina, se produce la amina cadaverina, que alcaliniza el medio y esto produce el
viraje del indicador al color violeta. La decarboxilación de la lisina, tiene lugar en medio ácido, por lo que es
necesaria que la glucosa sea previamente fermentada.

Los microorganismos que no producen lisina decarboxilasa, pero que son fermentadores de la glucosa,
producen un viraje de la totalidad del medio de cultivo al amarillo, pero a las 24 hs de incubación se observa el
pico de color violeta debido al consumo de las peptonas, y el fondo amarillo. La producción de sulfuro de
hidrógeno se visualiza por el ennegrecimiento del medio debido a la formación de sulfuro de hierro.

Las cepas de los géneros Proteus, Providencia y algunas cepas de Morganella, desaminan la lisina, esto
produce un ácido alfa-ceto-carbónico, el cual, con la sal de hierro y bajo la influencia del oxígeno forma un
color rojizo en la superficie del medio.

Lectura: se efectúa después de 18 a 24 horas de incubación a 37 ° C .se lee un quebrado, la reacción ocurrida
en la superficie del medio corresponde al numerador (parte aerobia) y la reacción ocurrida en la profundidad
del medio corresponde al denominador (parte anaerobia). La acidez se denomina con la letra A (color
amarillo) y la alcalinidad con la letra K (color purpura).

Interpretación: en este medio se leen las siguientes reacciones bioquímicas:

Fermentación de la glucosa (K/A), la bacteria no ataca aminoácidos solo fermenta la glucosa.

Descarboxilación de la lisina:

Prueba Positiva: Pico violeta/fondo violeta.

Prueba Negativa: Pico violeta/fondo amarillo.

Desaminación de la lisina:

Pico rojizo/fondo amarillo.

Producción de gas: ruptura del medio

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Producción de H2S: ennegrecimiento del medio

3. Agar citrato de Simmons

Sembrar con asa recta haciendo una punción central hasta el fondo del tubo y estría en la superficie.

Principio: se determina la capacidad de un microorganismo de emplear el citrato como única fuente de

carbono en ausencia de fermentación de azucares o de producción de ácido láctico.

Lectura: se efectúa de 18 a 24 horas de incubación a 37°C.

Interpretación:

La prueba es positiva cuando el medio se alcaliniza y vira a un color azul.

La prueba es negativa cuando no hay cambio de color.

4. Agar urea

Sembrar con asa recta haciendo una punción central hasta el fondo del tubo y estría en la superficie.

Principio: el agar urea se determina la capacidad de un microorganismo para producir ureasa y desdoblar la
urea, formando dos moléculas de amoniaco.
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Lectura: se efectúa de 18 a 24 horas de incubación a 37°C.

Interpretación: la prueba es positiva si el medio vira a un color fucsia que indica la alcalinización del medio.

La prueba es negativa si el medio se torna amarillo.

5. Agar SIM (Sulfuro, indol, motilidad)

Sembrar con asa recta, por picadura central hasta la mitad del tubo.

Principio: determina la capacidad de un microorganismo de moverse (presencia de flagelos), de producir

INDOL y producir H2S.

Lectura: se efectúa de 18 a 24 horas de incubación a 37°C. Primero se debe realizar la lectura de la movilidad
(Observando la presencia o no de turbidez) y luego adicionar 2 o 3 gotas del reactivo de Kovacs para detectar
la producción de indol.

Interpretación: La prueba de motilidad se interpreta realizando un cuidadoso examen macroscópico del

medio para observar crecimiento alrededor de la línea de siembra.

El indol se observa al desarrollarse un anillo de color rojo después de agregar el reactivo de Kovacs lo que
indica una prueba positiva.

La producción de H2S se evidencia por el ennegrecimiento del medio.

6. Caldo Rojo de Metilo VoguesProskauer (MR-VP)

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Para la realización de estas dos pruebas se debe Inocular el tubo de caldo MRVP agitando suavemente el asa
curva y se incuba a 37 °C durante 24 Horas. Al revelar las pruebas, se separa el cultivo en dos porciones que
servirán, para cada uno de los ensayos. Uno para hacer la prueba con rojo de metilo y otro para hacer la
prueba de VoguesProskauer.

Principio de la prueba de Rojo de Metilo: Determinar la habilidad de las bacterias para producir ácidos
estables por fermentación de la glucosa. La bacteria puede fermentar la glucosa por la vía acido mixta con
producción de metabolitos como ácido láctico, fórmico y succínico, los cuales van a hacer descender el pH
inicial lo cual se visualiza al agregar el indicador de pH rojo de metilo, el cual a pH acido vira a un color rojo.

Principio de la prueba de VoguesProskauer: Determinar la capacidad de producir acetoína a partir de la

fermentación de la glucosa por la vía butilenglicólica.

Lectura:

Rojo de metilo: se efectúa después de 18 a 24 horas de incubación a 37°C.agregar 10 gotas de rojo de metilo
al tubo MR, la aparición de un color rojo indica que la prueba es positiva para MR, la aparición de un color
amarillo indica que la prueba es negativa.

VoguesProskauer: al tubo VP agregar 10 gotas de KOH al 40% y 5 gotas de alfa naftol, mezclar fuerte después
de la adición década reactivo, esperar 15 minutos y leer, la aparición de un color rojo indica una prueba de VP
positiva, la aparición de un color amarillo o café indica una prueba de VP negativa.

RESULTADOS
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1. Dibuje y describa la morfología de las colonias en el medio de cultivo MacConkey:

2. Describa y dibuje la morfología, tinción y agrupación observada en la tinción de Gram en el objetivo de
100X.
3. Dibuje y describa los resultados obtenidos en cada una de las pruebas bioquímicas, realizadas en la
práctica.

✓ Agar TSI:

✓ Agar LIA:

 Agar citrato de Simmons:

 Agar urea:

 Agar SIM:

 Rojo de Metilo – VoguesProskauer

 De acuerdo a los resultados obtenidos en las pruebas bioquímicas. ¿Cuál es el microorganismo

identificado? Ver anexo.