Lab 2 BMH Año 2018

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BACTERIOLOGÍA MÉDICA HUMANA

LABORATORIO. 2 (2018)
Aislamiento e Identificación de Bacilos Gram Negativos fermentadores y no fermentadores
A. Introducción
En este laboratorio se abordarán la identificación de bacterias Gram negativas, a saber: la familia

Enterobacteriaceae (bacilos Gram negativos fermentadores) y bacterias Gram negativas fermentadoras
oxidasa positivas y bacterias Gram negativas no fermentadoras oxidasa positivas y negativas. En el siguiente
esquema simplificado se muestra en tipo de microorganismos que se manejarán.
Trate de memorizar este flujograma de identificación básico que le será de mucha ayuda para que se oriente
en el presente laboratorio
Flujograma de identificación de Géneros de Bacilos Gram negativos más

frecuentes en Microbiología clínica
Bacilos Gram Negativos
Fermenta la glucosa
Si No
Oxidasa positiva Oxidasa Oxidasa

Oxidasa negativa negativa Positiva
Vibrio Peudomonas
Enterobacterias Acinetobacter ( cocos)
Aeromonas Bulkolderia
(excepto Plesiomonas) Stenotrophomonas
Plesiomonas Shewanella
etc
etc etc
Después de identificar en la coloración de Gram de la muestra la presencia de bacterias Gram negativas (Ver
Anexo 3), la siembra de la muestras se hace empleando los medios básicos de rutina como: agar Sangre y
Mac Conkey (o EMB). No obstante, en los laboratorios de microbiología clínica, cuando se parte de muestras
no estériles o polimicrobianas, se pueden adicionar medios selectivos específicos para algunas bacterias,
como son: XLD, SS o Hectoen para aislamiento de Salmonella o Shiguella, TCBS para Vibrio cholerae, Agar
Aeromonas o Agar cetrimide para Pseudomonas entre otros. También se pueden emplear medios líquidos de
enriquecimiento selectivo en algunos casos.
Si en la coloración de Gram de la muestra, se observan bacilos Gram negativos o cocos Gram negativos y no
crecen en los medios de rutina mencionados arriba, se debe sospechar de la presencia de un organismo
2
exigente o complicado y debe recurrirse a medios líquidos o solidos especiales como puede ser el agar
chocolate, entre otros.
No siempre es necesario esperar a que el microorganismo no crezca en el medio de cultivo rutinario para
adiconar un medio enriquecido, sino, que el origen de la muestra o los antecedentes del paciente o su
diagnóstico presuntivo, puede sugerir la posible presencia de un microorganismo exigente dado y por esto
desde el inicio el bacteriólogo debe tomar la decisión de sembrar el medio enriquecido adecuado que permita
su aislamiento.
I. Enterobacteriaceas
La familia Enterobacteriaceae está compuesta por bacilos Gram negativos, muchos de ellos capsulados, que
se encuentran ampliamente distribuidos en la naturaleza; forman parte de la flora normal del tracto intestinal
del hombre y de los animales. Son el grupo bacteriano que se aíslan con mayor frecuencia de los
especímenes clínicos..
En el agar sangre de cordero las colonias de las Enterobacteriaceae son mucosas o lisas, grisáceas y la
mayoría presentan sus bordes enteros. La hemólisis es variable sin que constituya una característica de
identificación. En agar EMB (Agar Eosina, Azul de Metileno ) y en Agar MacConkey , las colonias pueden ser
rojizas, lo cual depende de la capacidad de fermentar la lactosa. Esta característica permite hacer una
diferenciación rápida entre las enterobacterias que pueden hidrolizar el disacárido, las llamadas “lactosa
positivas”, y las que no pueden hacerlo; “lactosa negativas”; que son transparentes o de un color rosado muy
pálido.
La diferenciación de las enterobacterias (como muchas de las demás bacterias) se basa principalmente en la
determinación de sus enzimas. Estas enzimas pueden ser identificadas utilizando medios de prueba, que
contienen los sustratos específicos para ellas e indicadores que puedan detectar su utilización por la
presencia de compuestos intermediarios o finales de su metabolismo. Vale la pena destacar dentro de las
enterobacterias, las colonias de Proteus sp, que presentan alrededor un crecimiento a manera de velo, que
difunde por el medio de cultivo, esto es conocido como el fenómeno de swarming.
La mayoría de las bacterias de esta familia presentan las siguientes características:

- Son bacilos Gram negativos
- Fermentan glucosa.
- No poseen enzima citocromo oxidasa (Con excepción de Plesiomonas)
- Reducen nitratos a nitritos
Una vez se sospeche que se ha asilado una enterobacteriacea se procede a su identificación empleando la
“Tabla Para la identificación de las Enterobacterias Más Comunes” que se adjunta para este laboratorio,
en esta se incluye la reacción frente a pruebas bioquímicas como TSI; Urea, Citrao, MIO, LIA, malonato y
DNAsa.
II. Bacilos Gram Negativos, Fermentadores de la Glucosa, Oxidasa Positivos
Una forma fácil de recordar las características de este grupo es considerarlos como si fuesen enterobacterias
pero con enzima oxidasa. Dentro de este grupo podemos considerar cinco géneros como los que más
3
frecuentemente ser relacionan con infecciones en el humano: Vibrio, Aeromonas, Plesiomonas,

Chromomobacterium, Campylobacter y Helicobacter
El género Vibrio comprende bacilos gramnegativos, ligeramente curvos, oxidasa positivos, fermentadores de
la glucosa. No son exigentes y crecen sobre los medios de rutina. La mayoría son halófilos; la especie más
conocida en el V cholerae., el agente causal del Cólera. Para el aislamiento selectivo del V. cholerae a partir
de heces se emplea el medio TCBS (tiosulfato citrato bilis sacarosa), en el cual el V cholerae se diferencia de
la mayoría de los demás Vibrios por presentar colonias amarillas debido a que fermenta la sacarosa. No
obstante lo demás vibrios se pueden presentar ocasionalmente en diferentes muestras clínicas y es
importante tener en cuenta de que pueden llegar a crecer en medios como agar sangre y MacConkey sin
evidenciar características específicas en la colonias que hagan sospechar de su presencia particular (es decir,
pueden confundirse con colonias de enterobacterias). Por esto, la morfología antes mencionada y la prueba
de oxidasa son claves para sospechar de su presencia. Resulta muy útil en la diferenciación de especies los
diferentes niveles de tolerancia al NaCl. (ver Tabla 1)
El género Aeromonas comprende bacilos Gram negativos fermentadores, móviles, y que presentan enzima
citocromo oxidasa. Esta última característica los diferencia de las bacterias de familia Enterobacteriaceae
cuya morfología de colonias es similar. Crecen bien en agar sangre y en los medios entéricos y fermentan
glucosa. Presenta frecuentemente hemólisis en agar sangre, característica que ayuda a su detección en
muestras polimicrobianas.
Aeromonas hydrophila sbs hydrophila se asocia con enfermedad diarreica, celulitis e infecciones de piel,
septicemia e infecciones urinarias. El fenómeno suicida ayuda a la rápida diferenciación de especies de
Aeromonas1. Este fenómeno ocurre cuando ponemos las bacterias a crecer en una solución que contenga
0.5 % de glucosa. La A hydrophila es no suicida, aerógena y esculina positiva, A sobria es suicida variable,
aerógena y esculina negativa; y A caviae es suicida, anaerógena y esculina positiva. Para otras
características de identificación consulte las Tabla 1 y 2.
Plesiomonas posee un único género, P shigelliodes, es un bacilo gram negativo, móvil, recto, redondeado y
corto. Crece bien en agar sangre y en Mac Conkey. Produce colonias no hemolíticas en agar sangre. . Son
1Namdari H; Bottone EJ. Suicide phenomenon in mesophilic aeromonads as basis for species identification. J Clin
microbiol. 1989; 27: 788-789
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oxidadoras de la glucosa y citocromo oxidasa positivas y no producen DNAsa; ésta última característica
ayuda a diferenciarla de la mayoría de la Aeromonas y Vibrios (ver Tablas 1 y 2).
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Tabla 1. Identificación de especies de Vibrio y géneros relacionados encontrados en clínica humana.

CARACTERÍSTICA V. V. V. V. parahaemolythicus V. alginolyticus V. V. V. furnisii V.
cholerae mimicus metschnikovii vulnificus fluvialis damsela Aeromonas Plesiomonas
Oxidasa (Kovacs) + + - + + + + + + + +
Lisina decarboxilasa + + d + + + - - d + +
Ornitina decarboxilasa + + - + D D - - - - +
Indol + + d + D + d d - + +
Citrato de Simmons + + D - - D + + - d -
Hidrólisis de la urea - - - D - - - - - - -
Acido a partir de glucosa + + + + + + + + + + +
Gas a partir de glucosa - - - - - - - + d D -
DNAsa a 25ºC + d d + + d + + D + -
Movilidad a 36 ºC + + D + + + D D d + +
Prueba de la cuerda + + + D + + + + D - -
Crecimiento en TCBS A v A v A v A A v d -
Crecimiento en NaCl 0% + + - - - - - - - + +
Crecimiento en NaCl 3% D d D + + D + + + + +
Crecimiento en NaCl 6% - - d D + - D D - - -
Crecimiento en NaCl 8% - - - - D - - - - - -
Hidrólisis del ONPG + + D - - D d d - + +
Acido a partir del m-inositol - - - - - - - - - - +
+ : 90% o más de las cepas son positivas; - : 0% o más de las cepas son negativas, A : Amarillo; D : variable, más del 50% de las cepas son positivas, d :
variable, menos del 50% de las cepas son positivas; S : Sensibel ; R : Resistente; v : Verde
Adaptado de por Andrey Payán Koneman, E.W. et al. Diagnóstico Microbiológico Texto y Atlas color. 5a ed. Editorial Médica Panamericana1999 y Murray P, Baron E,
Pfaller M, Tenover F, Yolken R. Manual of Clinical Microbiology. 7 th ed. ASM 1999.
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Tabla 2. Identificación de especies clínicamente importantes de Aeromonas y diferenciación de Plesiomonas shigelloides

Microorganismo β hemólisis Oxidasa Movilidad DNAsa Indol Voges DECARBOXILASAS Esculina Gas a FERMENTACIÓN
en A. Sangre
37 ºC 25 ºC Proskauer partir de
de cordero
la
glucosa
Lisina Ornitina Arginina L- Sacarosa Manitol Inosiltol
arabinosa
Grupo
A. hydrophila
A. hydrophila + + + + + + + - + + + + + + -
Grupo
A. caviae
A. caviae - + + + + - - - + + - + + + -
A. media ND + - + V - - - + + - + - ND ND
A. eucrenophila ND + + + ND - - - + + + V V + -
Grupo
A. sobria
A. sobria + + + + + + + - + - + V + + -
A.veronii + + + + + + + - + - V - + + -
bio.sobria
A.veronii bio + + + + + + + + - + + - + + -
veroni
A. jandei + + + ND + + + - + - + - - + -
A. schubertii V + + + - V + - + - - - - - -
A. trota + + + ND + - + - + - + - - + -
P.shigelloides - + + - + - + + + - - - - - +
+ : 90% o más de las cepas son positivas; - : 90% o más de las cepas son negativas; V : variable, 11% al 89% de las cepas son positivas; ND: no se
dispone de resultados.
Adaptado por Andrey Payán de : Koneman, E.W. et al. Diagnóstico Microbiológico Texto y Atlas color. 5a ed. Editorial Médica Panamericana1999
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III. Bacterias no Fermentadores de la Glucosa
Actualmente existen varios sistemas de identificación automáticos de bacilos no fermentadores, sin embargo,
como estos sistemas dependen del crecimiento de las bacterias en sustratos y la formación de productos
bioquímicos en medios convencionales o sustratos nutritivos pobres, solo pueden identificarse las especies
más activas metabólicamente con un grado aceptable de precisión. Aún, si se emplean métodos manuales,
la identificación de bacilos no fermentadores es dificultosa; los factores que contribuyen a las dificultades
generales en su identificación se mencionan en el cuadro 1.
Cuadro 1: Factores que contribuyen a las dificultades en la identificación de los no fermentadores 2

1. La mayoría de especies sólo se encuentran rara vez
2. Debido a esta poca frecuencia es posible que el personal de laboratorio no esté familiarizado
con muchos de los no fermentadores.
3. Muchos de los medios de cultivo convencionales no son apropiados para su crecimiento
4. Muchas especies crecen lentamente, la reactividad bioquímica es débil y requiere una
experiencia considerable para interpretar resultados ambiguos
5. El control de calidad de los medios de cultivo puede ser difícil y , debido a su uso infrecuente,
su vencimiento representa un problema para mantenerlos disponibles en el laboratorio
6. Los equipos comerciales a menudo tienen baja precisión para la identificación de cepas no
fermentadoras con requerimientos nutricionales mayores especiales y requieren de uso de
medios adicionales
Pseudomonas sspp. y Acinetobacter ss pp son los dos microorganismos no fermentadores que más
frecuentemente se aíslan de muestras clínicas. Éstos tienen importancia porque pueden llegar a comprometer
seriamente la vida de los pacientes infectados. Aunque Acinetobacter hace parte de la familia Neisseriaceae
y como tal presenta forma de diplococos, también puede desarrollar formas bacilares muy largas en especial
en cultivos viejos. Por esta razón usualmente en los libros de texto los describen equivocadamente como
cocobacilos, en vez de describirlos como diplococos Gram negativos que pueden presentar ocasionalmente
formas bacilares.
El género Pseudomonas comprende bacilos oxidasa positivos, móviles, no exigentes, aerobios estrictos,
cuya especie más representativa es la P. aeruginosa. La producción de un pigmento fluorescente permite
agrupar a P. aeruginosa, junto con P. fluorescens y P. putida en el grupo Fluorescente. Este pigmento se
detecta fácilmente con la ayuda de una lámpara de luz ultravioleta. Sin embargo, P. aeruginosa puede
producir una amplísima variedad de pigmentos adicionales dentro de los cuales está el que el es exclusivo,
que es la Piocianina. La piocianina es una fenacina (phenazine) azul-verdosa, que es tóxica para una gran
variedad de bacterias, hongos y células humanas. Para efectos prácticos, se acepta que si en un aislamiento
clínico se aísla un bacilo Gram negativo no fermentador, oxidasa positivo cuyas colonias son planas, opacas y
presentan un borde aserrado, fluorescente a la luz ultravioleta y con un olor característico (descrito
frecuentemente como a tierra húmeda), sólo resta confirmar si crecen a 42 °C para identificarlas como P
aeruginosa. Ver tabla 3. Recuerde que existen otras Pseudomonas que no son fluorescentes y para su
identificación se sigue la llave del Anexo 4.
2 Koneman. Diagnóstico microbiológico texto y atlas en color (6 ed.) (2013). Winn, Washington C.; Allen S D.; Janda W
M.; Koneman E W.; Procop G W.; Schreckenberger P C.; Woods G L.; Giovanniello O A.; Klajn D; Pertierra, A M.. pg
339
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Tabla 3: Género Pseudomonas del grupo fluorescente3

Especies Crecimiento a Oxidasa OF Hidrólisis de
42°C gelatina
P aeruginosa 100 99 97 82
P fluorescens 0 97 100 100
P putida 0 100 100 0
El género Acinetobacter comprende diplococos que no poseen enzima citocromo oxidasa. Son inmóviles, no
exigentes, aerobios, y el complejo que más frecuente se recupera de muestras clínicas es A. baumannii-
calcoaceticus. Se consideran patógenos oportunistas y generalmente se encuentran en procesos infecciosos
acompañando a otras bacterias. Es muy notoria su amplia resistencia a los antibióticos, como corresponde a
un habitante normal de la piel. Como es tan frecuentemente aislada de muestras clínicas, su presencia se
debe sospechar cuando se obtiene un diplococo Gram negativo con ocasionales bacilos largos, no
fermentador, oxidasa negativo, que producen colonias lactosa negativas en el agar MacConkey. Para
determinar la especie se sugiere emplear la Tabla 4.
Tabla 4: Identificación de bacterias del género Acinetobacter más frecuentes en clínica**, 4
Especie A. calcoaceticus A. A. haemolyticus A. lwofii A. junni A

Prueba baumannii .johnsonii
Ácido de glucosa 100 95 52 6 0 0

en medio OF
Hidrólisis de la 0 0 96 0 0 0
Gelatina**
Crece a 37 ºC 100 100 100 100 100 0
41 ºC 0 100 0 0 90 0
44 ºC 0 100 0 0 0 0
Citrato 100 100 91 0 82 100
Malonato 100 98 0 0 0 13
Hemólisis en 0 0 100 0 0 0
sangre de cordero
** Hay otras genoespecies no mencionadas en esta tabla, que pueden dar otras combinaciones de pruebas bioquímicas, en ese caso
se debe informar Acinetobacter spp
Vale la pena mencionar, por su singularidad bioquímica, dentro de los no fermentadores oxidasa positivos, a
la Shewanella putrefaciens, que es un bacilo Gram negativos, oxidasa positivo, móvil. Habita en ambientes
acuáticos y se ha asociado a infecciones en el hombre como úlceras cutáneas, infecciones óticas,
3Adaptado por Andrey Payán del Manual de Microbiología Clínica, Sociedad Americana de Microbiología, 7ª Edición,
1999. P R. Murray, E JO Baron, M A. Pfaller, F C. Tenover, R H. Yolken
4Tomado del Manual de Microbiología Clínica, Sociedad Americana de Microbiología, 7ª Edición, 1999. . P R. Murray, E
JO Baron, M A. Pfaller, F C. Tenover, R H. Yolken
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osteomielitis y bacteriemias. Se reconoce fácilmente porque es el único no fermentador que produce H 2S en

el TSI.
Algunas características de este y otros bacilos Gram negativos no fermentadores frecuentes en aislamientos
clínicos se muestran en la tabla 4. Recuerde que no es una tabla que deba abordar inmediatamente si
obtiene un no fermentador, solo pretende mostrar algunas características de los más recuentes, por esto,
más adelante en esta guía se recomiendan un enfoque más práctico en el proceso de identificación, antes de
ponerse en la tediosa e infructuosa labor de hacer pruebas bioquímicas al azar.
En la identificación de los bacilos Gram negativos no fermentadores de la glucosa, no se pueden utilizar

medios que como el agar hierro -lisina (LIA) ni el Movilidad -Indol -Ornitina (MIO); ya que éstos dependen de
la fermentación de este azúcar para poder evidenciar algún tipo de reacción en esas pruebas y esto como es
obvio los no fermentadores no lo hacen. En otras palabras, si no fermentan la glucosa contenida en estos
medios no podemos ver el paso siguiente que es la descarboxilación del aminoácido (o sea, no hay cambio
primario a amarillo por la fermentación del azúcar y no podemos ver si la reacción se devuelve a purpura al
ocurrir la descarboxilación). Por esta razón, para determinar la hidrólisis de estos y otros aminoácidos se
emplean otros medios que contengan el aminoácido en cuestión como pueden ser los caldos de MØeller o
Falkow y que no dependen de que previamente se fermente la glucosa. De igual forma, la movilidad para los
no fermentadores, debe ser evaluada por la prueba de gota pendiente, pues los agares semisólidos no son
útiles para este propósito; esto incluye a los medios de MIO, SIM y OF.
Enfoque práctico para la identificación de bacilos Gram negativos no fermentadores
El enfoque diseñado por P.C. Schreckenberger5 se presenta como una metodología práctica para la
identificación manual de no fermentadores y es ampliamente explicado en el libro de texto “Koneman.
Diagnóstico microbiológico texto y atlas en color”6. En este enfoque de identificación, los bacilos Gram
negativos no fermentadores se dividen en cuatro grupos funcionales de acuerdo con las pruebas de oxidasa y
la movilidad que presenten7 (ver Cuadro 1 y Anexo 4). Una vez se identifica a que grupo pertenece, se puede
realizar la identificación definitiva remitiéndose al cuadros de identificación subsiguientes.; para esto se
recomienda consultar el texto antes mencionado. Al seguir estos cuadros es posible identificar en forma
definitiva más del 95% de los bacilos Gram negativos no fermentadores que se aíslan en muestras clínicas.
5 Schreckenberger P.C. Practical Approach to the identification of Glucose – nonfermenting Gram Negative Bacili: A
guide to identification. Ed 3. Maywood,IL: Loyola University.2005
6 Koneman. Diagnóstico microbiológico texto y atlas en color (6 ed.) (2013). Winn, Washington C.; Allen S D.; Janda W
M.; Koneman E W.; Procop G W.; Schreckenberger P C.; Woods G L.; Giovanniello O A.; Klajn D; Pertierra A M .
Capítulo 5
7 Recuerde que en este tipo de bacterias la movilidad debe ser determinada por la prueba de gota pendiente.
10
Cuadro 1: Algunos No Fermentadores de Importancia Médica agrupados según PC Schreckenberer8
Negativa OXIDASA Positiva
Movilidad ( - ) Movilidad ( + ) Movilidad ( - ) Movilidad ( + )
-Acinetobacter baumannii- Algunas especies de los Algunas especies de los - Pseudomonas

calcoaceticus siguientes géneros: géneros: aeruginosa y la mayoría
-Acinetobacter lwoffii - Burkholderia - Chryseobacterium de especies de ese
-Otras especies de - Chryseomonas - Flavobacterium género
Acinetobacter - Flavimonas - Sphingobacterium - Alcaligenes
-Bordetella parapertussis - Stenotrophomonas - Moraxella - Agrobacterium
-Bordetella holmesii Etc etc - Acidovorax
etc - Shewanella
Algunas especies de los
Géneros:
- Comamonas
- Roseomonas
- Burkholderia
- Sphingomonas
etc
B. Materiales, medios y reactivos:
30 Asas de argolla Toallas desechables (No Lápices de Colores (No suministrado)

suministrado)
(Para el segundo día) 30 asas de 20 Frascos de descarte con 2 juegos de colorantes de Gram
punta hipoclorito al 1%
30 Caldos tripticasa (con cepas de: (Para el segundo día) 3 Cajas de Palillos de dientes (al menos 40)
Enterobacteriaceas, DNAsa
Aeromanadaceas, Pseudomonas y 60 tubos de OF
Acinetobacter)
(Para el segundo día) 30 tubos de: 30 trapos para limpiar 2 frascos goteros con Aceite de
Agar TSI, LIA, MIO, Citraro, Urea, 30 Tiras de Papel de filtro inmersión
Caldo Malonato 30 Pinzas
Gafas antisalpicadura y tapabocas Guantes de Latex (No suministrado) 30 Vasos de plástico pequeños o
(No suministrados) soportes de icopor para tubos
2 Gradillas de coloración 10 cajas de agar cetrimide 20 microscopios (sólo el Primer día)
previamente secos
30 cajas de agar sangre previamente 2 frascos de Reactivo de oxidasa 30 Láminas portaobjetos en alcohol
secas (Fresco, max 24 horas)
8Adaptado de Koneman. Diagnóstico microbiológico texto y atlas en color (6 ed.) (2013). Winn, Washington C.; Allen S
D.; Janda W M.; Koneman E W.; Procop G W.; Schreckenberger P C.; Woods G L.; Giovanniello O A.; Klajn D; Pertierra
A M.. pg 343
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2 Encendedores 30 mecheros (Para el segundo día) 5 gradillas de 30

tubos
Alcohol para mecheros Jabón para manos (No (Para el segundo día) dos frasco
suministrado) reactivo de Kovacs para Indol (p-
dimetilamino-benzaldehído)
30 agar MacConkey o EMB 3 frascos goteros con Aceite mineral
C. Desarrollo del Laboratorio:
C.1. Primer día:

 A partir del caldo tripticasa inocule agar sangre y agar EMB o Mc Conkey, utilizando las técnicas de
siembra indicadas en el documento “Metodología Para Siembras De Placas de Agar En Cajas De
Petri” que se encuentra en “Procedimientos paratécnicos”. Utilice la técnica en cada mitad de cada
agar y otra técnica en el otro. Incube a 35 –37º C en aerobiosis.
 Adicionalmente realice un frotis para coloración de Gram; para esto, tome 2-5 gotas del caldo con el
asa de argolla, deposítela sobre una placa portaobjetos, déjela secar, fíjela a la llama y coloréela con
Gram. Es recomendable que previamente a depositar la muestra, se dibuje un círculo de aprox 0,5
cm de diámetro en la parte reversa de la placa con lápiz de cera, para saber en dónde quedará la
muestra y facilitar su enfoque posterior en el microscopio. Deje secar a temperatura ambiente o a 37
°C completamente, fije a la llama y coloree con el kit de coloración de Gram de Hucker.
 Observe el Gram al microscopio e identifique la morfología bacteriana
 Este día , el profesor, sembrará un frotis de la boca y otro de una materia fecal..
C.2. Segundo día:

 Observe y describa la morfología de las colonias en cada medio: tamaño, aspecto, bordes,
propiedades hemolíticas, producción de pigmentos, fermentación de lactosa, etc. Para esto,
consulte el documento “Procedimientos paratécnicos”, en el apartado: “Términos Empleados Para La
Descripción De Las Colonias”. Adicionalmente cuantifique el crecimiento de las colonias sobre el
agar de acuerdo con lo indicado en ese mismo documento.
 Realice una prueba de oxidasa de la colonias en agra sangre
 Es importante notar que en la microbiología rutinaria, se sospecha que la bacteria a la que se trata
de identificar es una bacteria no fermentadora de la glucosa si no se observa coloración de la
colonia o es de color rosado muy pálido. El principio de este razonamiento es que si es “Lactosa
negativa” puede llegar a ser también “glucosa negativa”. Es en estos casos en los que se incorpora
desde el principio a la batería de rutina (Citrato, Malonato, LIA, MIO, Urea, TSI, DNAsa), los tubos de
OF, ya que permitirán distinguir entre las no fermentadoras de glucosa a dos grandes grupos: los
oxidadores de glucosa y los asacarolíticos.
 Inocule las pruebas bioquímicas que se aplica para los bacilos Gram negativos. Para esto se
recomienda que se revisen las guías de pruebas bioquímicas del semestre anterior. Recorderis: i)
en profundidad y superficie se siembran: TSI y LIA; ii) en superficie solamente: Urea y citrato, iii) en
profundidad solamente: MIO y OF.
12
NOTA: i) Para la siembra de toda la batería de identificación (Citrato, Malonato, OF, LIA, MIO, Urea, TSI);
toque (no arrastre), una sola vez, una sola colonia aislada y con ésta inocule todos los medios en el orden
mencionado. No tome colonia para cada tubo. Para la DNAsa tome de nuevo muestra de la misma colonia a
estudiar con el asa de argolla y siémbrela haciendo un frotis circular en forma y tamaño de botón de camisa.
ii) una vez sembrados la pruebas bioquímicas no olvide poner aprox un (1) mL de aceite de inmersión en uno
de los tubos de OF
C.3. Tercer día:
a) Coloree los esquemas correspondientes dentro de esta guía, tanto las pruebas sin siembra como los
resultados.
b) Interprete los resultados de las pruebas realizadas e identifique la bacteria que ha procesado. Empiece
utilizando el flujograma presentado en la página inicial de la presente guía.
Encaso de que le haya correspondido una enterobacteria use la tabla de identificación de

enterobacterias que está en el CAMPUS.
En caso de que le haya correspondido una bacteria diferente, emplee las tablas, llaves de identificación
dadas en la presente guía y deberá consultar también los cuadros a que se remita en: Koneman,
Diagnóstico microbiológico texto y atlas en color (6 ed.) (2013).
c) Para enterobacterias, calcule de probabilidad en bases de datos o grado de confianza en la Identificación

(ver Anexo 1). Si usted trabajó otro germen diferente, haga uno de los ejercicios dados para
enterobacterias (Anexo 1) para que pueda practicar la base de datos y reconozca la metodología para
hacerlo. Este es un ejercicio muy importante
d) Correlacione su bacteria identificada con el caso clínico asignado e interprete el antibiograma

correspondiente guiándose por las normas del CLSI. Tiene una semana para entregar ese informe.
e) Guía de realización de pruebas para bacilos Gram negativos
e.1. Citocromo oxidasa
e.1.1. Materiales y reactivos:
Reactivo de Kovacs para oxidasa (Diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina al 1%)

Papel de filtro
Palillos estériles
Pipetas de Pasteur
e.1.2. Procedimiento:
Con un palillo estéril tome la colonia sospechosa y frótela sobre el papel de filtro. Adicione una gota del
reactivo de Kovacs. Deseche el palillo y demás material en un frasco con hipoclorito al 1%
13
e.1.3. Interpretación:
POSITIVO: Colonias color rosado o morado a los 10 segundos de adicionar el reactivo.

Negativo: no se desarrolla ningún color
1. ¿Por qué la prueba de oxidasa no debe ser realizada de un medio que contenga hierro?
2. Mencione otro método para realizar esta prueba.
3. ¿Por qué es importante realizar la prueba de oxidasa a los Bacilos Gram negativos?
e.2. Agar Hierro Triple Azucar (TSI)

e.2.1. Materiales y reactivos:
Tubos con TSI con pico de flauta

Asa de punta
Con el asa de punta toque una colonia aislada e inocule el tubo de TSI en profundidad y superficie. La
superficie debe ser inoculada en forma de zig zag-estrecho.
Incube a 35 ºC. durante 18 - 24 horas.
Ácido/Ácido: (amarillo/amarillo) Lactosa Positivos. Fermentación de todos los
carbohidratos.
Alcalino/Ácido: (rojo/amarillo) “Lactosa negativo”. Fermentación de Glucosa

solamente
Alcalino/Alcalino: (rojo/rojo) No fermentador. No es una bacteria

fermentadora de la glucosa y por ende ni la sacarosa ni la lactosa (OJO: diferencie
de no crecimiento)
Presencia de burbujas o quebradura del medio: Producción de gas (CO2)
H2S (Precipitado Negro): Producción de ácido sulfhídrico

Coloree el resultado de su prueba bioquímica:
Sin inocular Inoculado Muestra #______

1. ¿Qué otros medios se puede utilizar para determinar la fermentación de carbohidratos? ¿Qué
ventajas ó desventajas presenta frente al agar TSI ?
14
2. ¿Cuáles es el indicador de pH que posee el TSI? ¿Que otro indicador posee?
e.3. Lisina decarboxilasa
e.3.1. Materiales y Reactivos:
Tubos con Agar de Hierro y Lisina con pico de flauta

Asa de punta
Con el asa de punta toque una colonia aislada e inocule el agar de Hierro y Lisina en profundidad y superficie.
La superficie debe ser inoculada en forma de zig zag estrecho. Incube a 35 ºC, durante 18 a 24 horas.
e.3.3. Interpretación
Alcalino /Alcalino: : (Púrpura/purpura) Positivo. Decarboxilación de la lisina con producción
de cadaverina
Alcalino /Ácido: (Púrpura/amarillo) Negativo. No hay decarboxilación de la lisina.
Rojo/Ácido: (Rojo/Amarillo) Negativo. No hay decarboxilación. Ha ocurrido desaminación de

la lisina
Precipitado negro: (pigmento negro) Producción de H2S.

Coloree el resultado de su prueba bioquímica
1. ¿Cuál es el indicador utilizado en esta prueba?

2. ¿Qué sucedería si el medio no tuviera glucosa en esta prueba?
e.4. Movilidad –Indol –Ornitina (MIO)
Tubos Agar MIO (Movilidad-Indol-Ornitina)

Asa de punta
15
Con el asa de punta toque una colonia aislada e inocule el MIO por el centro hasta el fondo, teniendo en
cuenta de no mover el asa hacia los lados ya que en este medio se puede determinar también la movilidad de
la bacteria. . Incube a 35 ºC, durante 18 a 24 horas.
e.4.3. Interpretación de la ornitina decarboxilasa:

Alcalino/Alcalino: (Púrpura/purpura) Positivo. Hay decarboxilación de la ornitina con
producción de putrescina
Alcalino/Ácido : (Púrpura/amarillo) Negativo. No hay decarboxilación de la ornitina.
e.4.4. Interpretación de la movilidad

POSITIVO: El crecimiento difunde hacia los lados del sitio de inoculación,
produciendo turbidez en el medio.
NEGATIVO: El crecimiento solamente se presenta en el sitio del hilo de
inoculación. No hay turbidez del medio.
Para facilitar la lectura de esta prueba ponga de fondo la superficie con la rayas que se muestran en el dibujo
a continuación:
Observación: Los medios semisólidos que se utilizan para la movilidad de las bacterias fermentadoras no
son útiles en la determinación de movilidad de las bacterias no fermentadoras, porque ellas sólo crecen en la
superficie del agar debido a su dependencia del oxígeno. Para las bacterias no fermentadoras es mejor
utilizar la técnica de la gota pendiente.
Al momento de la lectura adicione 3 o 5 gotas del reactivo de Kovacs para Indol. Deje caer las gotas
suavemente por las paredes del tubo.
POSITIVO: Anillo rojo en la superficie del medio.

NEGATIVO: El reactivo no cambia de color. La aparición de un color
anaranjado indica la producción de ácido antranílico más
que de indol.
Coloree los resultados de su prueba bioquímica:
Resultados:
16
1. Ornitina: _______________________
2. Movilidad _______________________
3. Producción de Indol _______________
Sin inocular Inoculado

Muestra#______
1. ¿Cuál es el indicador de pH utilizado en el medio MIO?

2. ¿Cuál es la diferencia de este medio para determinar la ornitina decarboxilasa y el caldo de Moeller
decarboxilasa?
3. Investigue como se hace la técnica de la gota pendiente. Tome en cuenta medios, tiempos y
temperaturas
e.5. Hidrólisis de la urea
Tubos con Agar Urea de Christensen con pico de flauta.

Asa de punta
Con el asa de punta toque una colonia aislada e inocule el medio de Urea en la superficie en forma de zig zag
amplio. Incube a 35 ºC durante 24 horas.
Algunos microorganismo como Proteus sp. hidrolizan la urea en 4 horas. Hay otros microorganismos que
tardan hasta 7 días para producir la hidrólisis.
POSITIVO: cualquier grado de intensidad de color rosado o fucsia en la
superficie del medio.
NEGATIVO: No se produce cambio de color.
Coloree el resultado de su prueba bioquímicas:
17
1. ¿Cuál es la diferencia entre el Agar Urea de Christensen y el Caldo de Urea de Stuart? ¿Para qué se
utiliza este último?
2. ¿Por cuánto tiempo se debe incubar esta prueba bioquímica antes de considerarla como negativa
definitivamente?
e.6. Utilización de citrato
Tubos con Agar Citrato de Simmons con pico de flauta

Asa de punta
Con el asa de punta toque una colonia aislada e inocule el tubo de Citrato en la superficie en forma de zig zag
estrecho. Incube a 35 ºC durante 24 horas.
POSITIVO: Aparición de un color azul en la superficie del medio o crecimiento en el

área inoculada sin cambio de color. Los dos o cualquiera de los dos
NEGATIVO: No se produce crecimiento ni cambio de color

18
1. ¿Por qué el citrato se puede interpretar como positivo con crecimiento y sin cambio de color?
definitivamente?
e.7. Utilización de Malonato
Tubos con caldo de malonato

Asa de punta
Con el asa de punta inocule el tubo que contiene el caldo de malonato. La inoculación debe hacerse
disolviendo en la pared del tubo el inóculo. Para esto incline el tubo para que el líquido forme un pico de
flauta y en la punta del pico disuelva la colonia frotando contra la pared del tubo. Evite que el mango del asa
penetre en el tubo para evitar la contaminación. Incube a 35 ºC durante 18 - 24 horas.
e.7.3. Interpretación
POSITIVO: La presencia de un color azul intenso ó azul de prusia en el medio indica
utilización del malonato por parte del microorganismo.
NEGATIVO: No hay cambio a color azul del caldo. Solo turbidez o cambio a amarillo

19
1. ¿Cuál es el fundamento de esta prueba bioquímica?

2. ¿Cuál es la composición del medio? Especifique cuál es el indicador.
definitivamente?
e.8. Desoxiribonucleasa (DNAsa) (Cuando se emplea el agar DNA con Azul de

Toluidina))
Cajas de petri con agar DNAsa con Azul de O-Toluidina, asas o palillos estériles.
Con un palillo estéril o un asa haga un frontis de la colonia a estudiar sobre en agar DNAsa que contenga azul
de o-toluidina. Trate de formar una masa en forma de círculo de tamaño cercano aun botón de camisa
estándar. Incube a 25o C durante 24 horas.
Para facilitar la lectura de la prueba, coloque un fondo blanco sobre la mesa y levante la caja a unos 15 cm de
la superficie para observar al trasluz sobe ese fondo
a) Positivo: La aparición de un halo rosado alrededor de la colonia indica hidrólisis del DNA.
b) Negativo: no se observa cambio del indicador o se torna más obscuro.

20
e.9. Óxido Fermentación ( de Glucosa) (OF)
Dos tubos de OF de glucosa

Asa de punta
Aceite mineral
Con el asa de punta toque una colonia aislada e inocule los tubos de OF por el centro hasta el fondo de cada
tubo (tome colonia solo una vez y de esta siembre los dos tubos), teniendo en cuenta de no mover el asa
hacia los lados ya que en este medio se puede determinar también la movilidad de la bacteria. En uno de los
tubos, ponga aproximadamente 1 mL de aceite mineral estéril sobre el agar. Incube a 35 ºC, durante 18 a 24
horas.
e.9.3. Interpretación del OF:

Oxidador: Sólo el tubo sin aceite (“destapado”) presenta color amarillo (cualquier traza)
Oxido-/fermentador : ambos tubos presentan cambio a amarillo
Asacarolítico (no oxida ni fermenta la glucosa): no se presenta ningún cambio en los

tubos, puede verse aparición de un del color azul.
e.9.4. Interpretación de la movilidad

POSITIVO: El crecimiento difunde hacia los lados del sitio de inoculación,
produciendo turbidez en el medio.
NEGATIVO: El crecimiento solamente se presenta en el sitio del hilo de
inoculación. No hay turbidez del medio.
Nota: recuerde que si el organismo es un no fermentador, no se puede tener en cuenta
un resultado negativo.
Sin inocular Inoculado Muestra # ______

21
1. ¿En una batria de identificación se puede presentar un TSI A/A con una combinación de OF como sigue:
tubo con aceite verde y tubo sin aceite amarillo?
2. ¿Cuál es la composición del medio? Especifique cuál es el indicador.
definitivamente?
Ampliación del tema:
1. ¿Qué sustancias inhibidoras poseen los medios que ha utilizado en esta práctica y cuál es su función
específica?
3. ¿Para qué se utiliza la prueba de Voges-Poskauer y cuál es su fundamento?
4. ¿En qué consiste la prueba de ONPG?
5. Mencione cuatro métodos o sistemas para identificación de enterobacterias, diferentes a los
macrométodos que ha realizado en esta práctica.
a) Bibliografía
1. Manual of BBL: Products and Laboratory procedures 6th ed.,Cockeysville, Maryland 1988.
2. Manual de medios de cultivo Merck. E Merck, Darmstadt: Barcelona 1990 y 1994. 3a ed. Panamericana.
B.Aires, 1991.
3. MacFaddin, Jean F. Pruebas bioquímicas para la identificación de bacterias de importancia clínica. - 3ed.
Editorial Médica Panamericana, 2003.
4. Forbes B, Sahm D, Weissfeld A. Bailey and Scott. Diagnóstico Microbiológico. 11a edi. Editorial Médica
Panamericana. Buenos Aires, 2004..
5. Koneman, E.W. y otros. Diagnóstico Microbiológico. la Edición. Texto y Atlas a color. Editorial Médica
Panamericana. Buenos Aires, 2013.
6. Versalovic J.. Manual of Clinical Microbiology. 10th Ed. ASM Press. 2011
7. García LS. Clinical Microbiology Procedures Handbook. 3 th Edition. Asm Press. 2011.
8. The OXOID MANUAL. Bridson E. Y. 9th Edition. 2006.(recurso en línea) Consultado en :
https://firatozel.files.wordpress.com/2011/09/oxoid-manual-9th-edition.pdf.
9. Manual of Clinical Microbiology 11th . Jorgensen J H. & Pfaller M A. ASM Press.. EEUU.. 2015
22
ANEXO 1
Cálculo de Probabilidad en Bases de Datos o Grado de Confianza en la Identificación
Para entender los siguientes cálculos debe recurrir a la “Tabla de Identificación de Enterobacteriaceas”.
Nota: Para el manejo de la “Tabla Para la identificación de las Enterobacterias Más Comunes” (en el
Campus) tenga en cuenta cuatro principios principios:
1. Lo que aparece en la tabla siempre son porcentajes de positividad.
2. Lo que yo anoto para hacer mis cálculos es el porcentaje de CONCORDANCIA con el dato que
aparece anotado
3. Si usted obtiene un resultado negativo en una prueba mientras en la Tabla (en la columna
correspondiente a un germen) aparece un resultado como 100% en esa prueba bioquímica, esto
quiere decir que en esa prueba la concordancia sería 0%. Entonces, este germen al que pertenece
esa columna no puede ser y se descarta. Haga esto inicialmente a “vuelo de pájaro” con todos los
gérmenes y evitará perder tiempo sacando concordancias de pruebas que están en una columna en
donde no existe concordancia laguna (0%)
4. De igual manera, si usted obtiene un resultado positivo en una prueba mientras en la Tabla (en la
columna correspondiente a un germen) aparece un resultado como 0% en esa prueba bioquímica,
esto quiere decir que en esa prueba la concordancia sería 0%. Entonces, este germen al que
pertenece esa columna no puede ser y se descarta. Haga esto inicialmente a “vuelo de pájaro” con
todos los gérmenes y evitará perder tiempo sacando concordancias de pruebas que están en una
columna en donde no existe concordancia laguna (0%)
Ejemplo :
Yo tengo en mis resultados: En la Tabla aparece: Entonces debo anotar :

A/A A/A 0,7
70%
A/A K/A 0,2
80%
Negativo 1% 0,99
Positivo 100% 1
Positivo 1% 0,01
Positivo 0% Se descarta la bacteria a la
cual pertenece esta prueba
Negativo 100% Se descarta la bacteria a la
cual pertenece esta prueba
A continuación se muestran una forma de hacer los cálculos de probabilidad. En la tabla 1.1 se muestran los
resultados obtenidos en las pruebas bioquímicas por un bacteriólogo (que podría ser usted) y su
Concordancia con tres bacterias que se encuentran en la tabla de enterobacterias; al lado está el comentario
final que le ayudará a entender que hacer con los cálculos
23
Tabla 1.1: Ejemplo de lo que se debe anotar para hacer los cálculos de probabilidad de un germen
Prueba Bioquímica Resultados Concordancia con los datos en la tabla (lo

obtenidos que debe anotar)
E. coli Enterobacter Serratia Probabilidad de que sea el

aerogenes marcescens germen:
TSI A/A 0,95 0,95 0,95 i). Se divide el número uno

entre el producto de la
multiplicación de las
concordancias
GAS POSITIVO 0,95 1 0,55
H2S NEGATIVO 0,99 1 1 E. coli: 1 / 0,0000883=11325
CITRATO POSITIVO 0,01 0,95 0,98 E. aerogenes: 1 /

0,0411971= 24
UREA NEGATIVO 0,99 0,98 0,85 S. marcescens: 1 /

0,0079471=126
MOVILIDAD POSITIVA 0,95 0,97 0,97 ii). Orden de probabilidad:
LISINA K/K 0,9 0,98 0,99 1: E aerogenes 1:24
ORNITINA K/K 0,65 0,98 0,99 2. S. marcescens 1:126
INDOL NEGATIVO 0,02 1 0,99 3. E. coli: 1:11325
MALONATO NEGATIVO 1 0,05 0,97 iii). El número más bajo es la

respuesta
DNAsa 25 ºC NEGATIVO 1 1 0,02
Producto de la 0,0000883 0,0411971 0,0079471 iv). Quiere decir que la

multiplicación de posibilidad de que sea E.
las concordancias aerogenes es de 1 en 24
(Frecuencia) veces que se de esta
combinación
Adaptado de Bailey & Scott Diagnóstico Microbiológico. (11ª ED.):BETTY A. FORBES, DANIEL F. SAHM, ALICE S. WEISSFELD,
EDITORIAL MÉDICA PANAMERICANA, 2004 Pag 167-168
24
1.2 Ejercicios de Identificación de Enterobacterias
Identifique las siguientes especies de enterobacterias utilizando la “Tabla Para la identificación de las
Enterobacterias Más Comunes” que usted aprendió a manejar en el laboratorio.
Cepa 1 Cepa 2 Cepa 3 Cepa 4 Cepa 5
TSI K/A A/A K/A A/A K/A
Gas + - + + +
H2S - - + - -
Citrato + - + + -
Urea + + - + +
Movilidad + - + + +
Lisina K/A K/A K/K K/K R/A
Ornitina K/K K/K K/K K/K K/K
Indol + + - - +
Malonato - - - + -
DNAsa 25 °C - - - - -
25
ANEXO 2
Principio generales que rigen las pruebas bioquímicas
Figura 2.1:
Principios Generales Aplicados a Muchos de los Medios

Diferenciales Basados en Cambios de pH
R eacción Actividad R eacción aparente.
Substrato Algunos ejemplos
aeróbica o
(Notada por el indicador
microbiana apropiado en el medio))
anaeróbica
O F y medios de
Varios aminoácidos en
Aeróbica desaminación alcalina fermentación, TSI, LIA , Mack
peptonas, extracto de
Conkey y otros medios
levaduras, etc..
diferenciales
En cantidad cantidad relativamente O/F y medios d e

fermentación
relativamente grande de ácido fermentación, Mac Conkey,
Uno o más grande TSI
Azucares
específicos
En cantidad cantidad relativamente
fermentación Agar, KIA, TSI
relativamente pequeña de ácido
pequeña.
Anaeróbica
Aminoácidos específicos en descarboxilac
alcalina MIO, LIA
cantidades relativamente ión
pequeñas
Reducción Color Negro

Tiosulfato con formación (no es una reacción XLD, Hecktoen, SS, LIA, TSI
de H 2S relacionada con el pH)
Modificado por Andrey Payán G. Tomado de: http://www.jlindquist.net/generalmicro/102diff.html Consultado el 01 -04-2008
Figura 2.2:
Nota: Recuerde que una bacteria siempre utilizará primero la Glucosa y luego buscará (si es que tiene la
enzima necesaria) desdoblar los azucares compuestos para seguir los ciclos del carbono a partir de azucares
(produciendo residuos ácidos); si no tiene la disacaridasa, entonces el siguiente paso metabólico será
emplear los aminoácidos y las peptonas como fuente de carbono (que producirá residuos alcalinos). Por esto,
para que Ud entienda el porque de los virajes de los medios, debe conocer la composición de ellos y los
indicadores de pH que tienen y como varían estos ante as condiciones de pH.
26
ANEXO 3
Figura 3.1: Morfología Típica en la coloración de Gram de diferentes géneros de bacterias Gram negativas
Tomado de: . García LS. Clinical Microbiology Procedures Handbook. 3 th Edition. Asm Press. 2011.
27
Anexo 4
Tomado de Koneman. Diagnóstico microbiológico texto y atlas en color (6 ed.) (2013). Winn, Washington C.; Allen S D.; Janda W M.; Koneman E W.; Procop G
W.; Schreckenberger P C.; Woods G L.; Giovanniello O A.; Klajn D; Pertierra, A M. Pg: 343

Lab 2 BMH Año 2018

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1

BACTERIOLOGÍA MÉDICA HUMANA

Aislamiento e Identificación de Bacilos Gram Negativos fermentadores y no fermentadores

En este laboratorio se abordarán la identificación de bacterias Gram negativas, a saber: la familia

Flujograma de identificación de Géneros de Bacilos Gram negativos más

Bacilos Gram Negativos

Oxidasa positiva Oxidasa Oxidasa

La mayoría de las bacterias de esta familia presentan las siguientes características:

II. Bacilos Gram Negativos, Fermentadores de la Glucosa, Oxidasa Positivos

frecuentemente ser relacionan con infecciones en el humano: Vibrio, Aeromonas, Plesiomonas,

Tabla 1. Identificación de especies de Vibrio y géneros relacionados encontrados en clínica humana.

Acido a partir de glucosa + + + + + + + + + + +

Gas a partir de glucosa - - - - - - - + d D -

Hidrólisis del ONPG + + D - - D d d - + +

Acido a partir del m-inositol - - - - - - - - - - +

Tabla 2. Identificación de especies clínicamente importantes de Aeromonas y diferenciación de Plesiomonas shigelloides

III. Bacterias no Fermentadores de la Glucosa

Cuadro 1: Factores que contribuyen a las dificultades en la identificación de los no fermentadores 2

Tabla 3: Género Pseudomonas del grupo fluorescente3

Tabla 4: Identificación de bacterias del género Acinetobacter más frecuentes en clínica**, 4

Especie A. calcoaceticus A. A. haemolyticus A. lwofii A. junni A

Ácido de glucosa 100 95 52 6 0 0

osteomielitis y bacteriemias. Se reconoce fácilmente porque es el único no fermentador que produce H 2S en

En la identificación de los bacilos Gram negativos no fermentadores de la glucosa, no se pueden utilizar

Enfoque práctico para la identificación de bacilos Gram negativos no fermentadores

Cuadro 1: Algunos No Fermentadores de Importancia Médica agrupados según PC Schreckenberer8

Negativa OXIDASA Positiva

Movilidad ( - ) Movilidad ( + ) Movilidad ( - ) Movilidad ( + )

-Acinetobacter baumannii- Algunas especies de los Algunas especies de los - Pseudomonas

B. Materiales, medios y reactivos:

30 Asas de argolla Toallas desechables (No Lápices de Colores (No suministrado)

2 Encendedores 30 mecheros (Para el segundo día) 5 gradillas de 30

C. Desarrollo del Laboratorio:

C.1. Primer día:

 Observe el Gram al microscopio e identifique la morfología bacteriana

C.2. Segundo día:

 Realice una prueba de oxidasa de la colonias en agra sangre

C.3. Tercer día:

Encaso de que le haya correspondido una enterobacteria use la tabla de identificación de

c) Para enterobacterias, calcule de probabilidad en bases de datos o grado de confianza en la Identificación

d) Correlacione su bacteria identificada con el caso clínico asignado e interprete el antibiograma

e) Guía de realización de pruebas para bacilos Gram negativos

e.1. Citocromo oxidasa

e.1.1. Materiales y reactivos:

Reactivo de Kovacs para oxidasa (Diclorhidrato de tetrametil-p-fenilendiamina al 1%)

POSITIVO: Colonias color rosado o morado a los 10 segundos de adicionar el reactivo.

e.2. Agar Hierro Triple Azucar (TSI)

Tubos con TSI con pico de flauta

Alcalino/Ácido: (rojo/amarillo) “Lactosa negativo”. Fermentación de Glucosa

Alcalino/Alcalino: (rojo/rojo) No fermentador. No es una bacteria

Presencia de burbujas o quebradura del medio: Producción de gas (CO2)

H2S (Precipitado Negro): Producción de ácido sulfhídrico

Sin inocular Inoculado Muestra #______

2. ¿Cuáles es el indicador de pH que posee el TSI? ¿Que otro indicador posee?

e.3. Lisina decarboxilasa

e.3.1. Materiales y Reactivos:

Tubos con Agar de Hierro y Lisina con pico de flauta

Rojo/Ácido: (Rojo/Amarillo) Negativo. No hay decarboxilación. Ha ocurrido desaminación de

Precipitado negro: (pigmento negro) Producción de H2S.

Sin inocular Inoculado Muestra #______

1. ¿Cuál es el indicador utilizado en esta prueba?

e.4. Movilidad –Indol –Ornitina (MIO)