PRUEBAS BIOQUIMICAS PARA LA IDENTIFICACION DE

ENTEROBACTERIAS.
RECUENTO DE COLONIAS CON ASA CALIBRADA.
Maicol Andrade (218095012); Karen Jaramillo (218095141);
Johan Mejia (218095177); Camilo Obando (218095226); Laura Valdes
(218095337)
Departamento de Biología, Facultad de Ciencias Exactas y Naturales,
Universidad de Nariño, Sede Torobajo.
RESUMEN

El reconocimiento de microorganismos ha sido de vital importancia en la microbiología,

permitiendo conocer e identificar los géneros y especies de las familias bacteriana, en este
caso las enterobacterias. El laboratorio se llevó a cabo en dos partes, la primera en la que a
microorganismos como Salmonella, Kebsiella , E. Coli y Proteus se aplicó pruebas bioquímicas
como: TSI,LYS,UREASA, MIO Y CITRATO, la clasificación se la presenta en la tabla 1, la segunda
parte consistió en llevar los microorganismos donde existió un crecimiento satisfactorio para
el recuento de colonias de Salmonella y Proteus. Por consiguiente, se realizó la interpretación
de cada prueba que permitió conocer cualitativamente las propiedades bioquímicas del
microorganismo estudiado, y cuantitativamente el recuento de colonias.

PALABRAS CLAVE: Enterobacteriaceae, salmonella, Escherichia Coli, Proteus,Klebsiella,

pruebas bioquímicas,

INTRODUCCION forman esporos. Desarrollan en presencia o

Enterobacterias:
Esta familia comprende un numero muy
variado de géneros y especies bacterianos
cuyo hábitat natural es el tubo digestivo
del hombre y los animales. No todos los
bacilos Gram negativos que tienen este
hábitat forman parte de la familia
Enterobacteriaceae. Se los encuentra en el
suelo, agua, frutas, vegetales y otras
plantas y en los animales desde los insectos
al hombre. La familia está definida por un
conjunto de características fenotípicas
(bioquímicas, fisiológicas e inmunológicas)
a las que se han agregado posteriormente
otros elementos establecidos por técnicas
de hibridización de ácidos nucleicos que
miden distancias evolutivas y han definido
mejor la interrelación de todos los
microorganismos integrantes de la familia.
Son bacilos Gram negativos rectos, con un
diámetro de 0.3 a 1.5 micras. Si son
móviles, presentan flagelos perítricos. No
en ausencia de Oxígeno (aerobios-
anaerobios facultativos). Desarrollan
rápidamente en medios simples, no siendo
exigentes desde el punto de vista
nutricional. Algunos desarrollan en glucosa
como única fuente de carbono, mientras
otros requieren el agregado de vitaminas
y/o minerales en el medio de cultivo. Son
quimioorganotrofos, poseen metabolismo
fermentativo y respiratorio. Son catalasa
positivos y oxidasa negativos; reducen los
nitratos a nitritos. El contenido de Guanina
+ Citosina del DNA total es de 38 a 60
moles %. En los medios de cultivo forman
colonias lisas, convexas y circulares de
bordes definidos. Algunas especies
desarrollan colonias más mucoides que
otra (por ejemplo la Klepsiella).
Caracteres bioquímicos
Los bacilos Gram negativos que integran
esta Familia pueden identificarse por
medio de la expresión fenotípica de
algunos caracteres genéticos. Los métodos - Las fimbrias permiten la adherencia a la
utilizados tienen como principio: célula huésped e impiden el barrido por las

- La investigación de la fermentación de barreras mecánicas de defensa del

azucares o alcoholes en un medio organismo.
peptonado con el agregado de un indicador
- Algunas especies producen exoenzimas
de pH para detectar la producción de
como ureasa, gelatinasa, lipasa,
metabolitos ácidos.
desoxirribonucleasa, las cuales actúan
- La investigación de la utilización de un permitiendo la sobrevida de la bacteria
substrato como única fuente de C. dentro del órgano afectado.

- La investigación de producción de ciertas - Debido a que el hierro es indispensable

enzimas sobre substratos generadores de
color.
- La investigación de la producción de un
metabolito, producto final característico de
una vía metabólica.
- La investigación de la aptitud de
desarrollar en presencia de un inhibidor.
Factores determinantes de patogenicidad
-La cápsula tiene propiedades de adhesina
y es antifagocitaria.
para ciertas funciones de las bacterias,
estos microorganismos producen
aerobactinas que permiten la captación de
hierro desde el medio.
- Todas las enterobacterias poseen el
lipopolisacárido (LPS) de pared, el cual
tiene acción de endotoxina, la cual se libera
al destruirse la bacteria.
-Exotoxinas: no todas las especies las
producen. Sólo son producidas por las
patógenas obligadas y poseen efectos
específicos. [1]

ANALISIS DE RESULTADOS

PARTE I: PRUEBAS BIOQUIMICAS

El análisis cualitativo para las pruebas bioquímicas se empezó haciendo una clasificación de las
pruebas aplicadas de TSI, CITRATO, UREASA, LISINA, MIO. para cuatro especies de
Enterobacteriaceae (E. Coli, Salmonella, Kebsiella, Proteus), se profundizó en que consiste en
cada prueba con el fin de realizar un análisis para cada especie de enterobacterias.

Tabla 1: Propiedades bioquímicas de Enterobacteriaceae.

REACCION E. Coli Salmonella Kebsiella Proteus

TSI A/K K/A A/A K/A
TSI(H2S) N N N P
GAS P P P N
C. SIMONS N P-N P P-N
LIS K/A K/A A/A K/A
UREASA N N P P
MOVILIDAD P P P P
INDOL N N N N
 ORNITINA P N P P

Resultados experimentales para TSI: (Triple Iron Sugar ) Esta prueba se recomienda para la
identificación de patógenos entéricos Gram negativos. Se emplea para detectar la
fermentación de lactosa, sacarosa y glucosa, con formación de ácido y gas, y también para
detectar producción de ácido sulfhídrico. K: Reacción alcalina(rojo), A: Reacción acida
(amarillo).[2]

CITRATO SIMONS

En el medio de cultivo, el fosfato monoámoniaco es la única fuente de nitrógeno y el citrato de

sodio es la única fuente de carbono. Ambos componentes son necesarios para el desarrollo
bacteriano. Las sales de fosfato forman un sistema buffer, el magnesio el cofactor enzimático.
El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, el azul bromometiol es el indicador de PH ,
que vira el color en medio alcalino y el agar es el medio solidificante.[3]

LISINA

En el medio de cultivo, la peptona y el extracto de levadura proporcionan los nutrientes

necesarios para el desarrollo bacteriano. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable y la
lisina es el sustrato utilizado para detectar la presencia de las enzimas descarboxilasas y
deaminasa. El citrato de hierro y amonio y tiosulfato de sodio son los indicadores de ácido
sulfúrico. El purpura de bromocresol, es indicador de pH (su color amarillo a pH igual 0 menor
a 5.2 y violeta pH igual o mayor a 6.8).[4]

UREA

En el medio de cultivo, la tripteína y la glucosa, aportan los nutrientes para el desarrollo de

microorganismos. El cloruro de sodio mantiene el balance osmótico, y el rojo fenol es el
indicador de pH. El agar es el agente sodificante.

Las bacterias hidrolizan la urea por medio de una enzima ureasa liberan amoniaco y CO2 .
Estos productos alcalizan el medio de cultivo haciendo virar el color rojo fenol del color
amarillo a rojo. [5]

MIO

Medio de cultivo altamente nutritivo por la presencia de levadura, peptona y tripteína. La

tripteína aporta gran cantidad de triptófano, sustrato de la enzima triptofanasa a partir del
cual se produce indol. La glucosa es el hidrato de carbono fermentable, la ornitina es el
sustrato para detección de la enzima descarboxilasa, el purpura de bromocresol es el indicador
de pH, que en medio alcalino es de color purpura y en medio acido es de amarillo. El agar es el
agente sodificante, y a esta concentración le otorga al medio de la propiedad de medio sólido,
condición necesaria para detectar movilidad, que se evidencia por el enturbiamiento del
medio o por el crecimiento que difunde más allá de la línea de inoculación del microorganismo
de estudio. [6].
 Tabla 2. Resultados experimentales de pruebas bioquímicas para Escherichia Coli.

TSI CITRATO UREA LIS MIO

Escherichia Coli es un bacilo Gram negativo, anaerobio facultativo con un metabolismo tanto
fermentativo como respiratorio. Puede ser inmóvil o móvil por flagelos peritricos. Es miembro
de la familia Enterobacteriaceae, y aunque la mayoría de las cepas de E. coli no son patógenas,
pueden ser patógenos oportunistas que causan infecciones en el hospedador
inmunocomprometido. Fisiológicamente, E. coli es versátil, está adaptado a las características
del hábitat y puede crecer en un medio con glucosa como única fuente orgánica. Puede crecer
en presencia o ausencia de O2 y bajo condiciones anaeróbicas puede proliferar por
fermentación, produciendo una mezcla de ácidos y gas como productos finales. Puede también
crecer por medio de una respiración anaeróbica ya que es capaz de utilizar NO3, NO2 o
fumarato como aceptores finales de electrones mediante procesos respiratorios de transporte
de electrones. [7]

Una vez teniendo el fundamento de la E. Coli se realizó un análisis detallado las diferentes
pruebas, con TSI donde el fondo fue rojo (K: reacción alcanina) y el pico amarillo (A: reacción
acida, lo que significa que fermentó la glucosa, produjo gas que se reflejó en la producción de
burbujas, y no produjo H2S .

Con la prueba de citrato se obtuvo color verde (negativo) concluyendo que la E.coli no
reacciona teniendo un compuesto químico como el citrato de sodio como única fuente de
carbono y el fosfato monoámoniaco como fuente de nitrógeno.

Para la prueba Urea no presentó un cambio de color amarillo a rojo lo que significa que la E.
Coli carece de la enzima ureasa por lo que no le permite liberar amoniaco y CO 2..En la prueba
lisina se obtuvo una superficie violeta (K: reacción alcalina) fondo amarillo (A: reacción acida)
lo que concluye que la e. Coli no descarboxila la lisina.

La prueba para E. Coli donde se puede observar una turbidez en el medio lo que significa que
hay movilidad, para la producción indol no se logró apreciar el anillo rojizo, en la ornitina si se
aprecia un color amarillo fuerte.

Tabla 2: Resultados experimentales de pruebas bioquímica para Salmonella

TSI CITRATO UREA LIS MIO

Los miembros del genero salmonella son bacilos Gram-negativos fermentadores de lactosa ,
anaerobios facultativos, no esporulados, generalemnte móviles por flagelos peritricos con la
expecion de salmonella gallinarum salmonella pollorum, responsables de la tifoidea aviar y
pullorosis respectivamente. Poseen metabolismo fermentativo y oxidativo, fermentan glucosa
con producción de acido y gas.[8]

Ahora bien, en este análisis se hará un hincapié en aquellas pruebas que presentaron algún
tipo de confusión en el momento de interpretar sus resultaos, ya que anteriormente se
presentó la clasificación de las pruebas y el análisis respectivo para cada prueba que siguen el
mismo parámetro para todas. En la prueba citrato se pudo observar un azul verdoso, lo que
impedía dar una clasificación si fue negativa o positiva; sin embargo, remitiéndose a literatura
se encontró que la salmonella si puede tener el citrato de sodio como fuente de carbono,
sabiendo esto se esperaría u color azul fuerte, una limitación que se pudo analizar fue el
tiempo de incubación o un error del analista en la técnica de siembra.

Tabla 3: Resultados experimentales de pruebas bioquímicas para Proteus.

TSI CITRATO UREA E. MIO LIS

El género Proteus forma parte de la familia Enterobacteriaceae. El Bergey’s Manual of
Deteminative Bacteriology define este género como bacilos gramn egativos, móviles, con
flagelos perítricos, aerobios y facultativos anaerobios. Tradicionalmente a este género se le ha
encuadrado en la tribu Proteae que incluye también a los géneros Providencia y Morganella.
Todos ellos se caracterizan por su capacidad para desaminar la fenilalanina trasformándola en
ácido fenilpirúvico debido a la producción de fenilalanina desaminasa, hidrolizar la tirosina,
desdoblar en casi todos los casos la urea y ser resistentes a la colistina. [9]

En esta especie se presentó al igual que en la Salmonella un verde al fondo y un azul en la

superficie lo que significaría que necesitaba más tiempo para que reaccione completamente.

Tabla 4: Resultados experimentales de pruebas bioquímicas para Klebsiella.

TSI CITRATO UREA LIS MIO

La principal especie de este género es Klebsiella pneumoniae, muy expandida en la

naturaleza. Se la aísla frecuentemente de materias fecales del hombre y los animales, pero
también de aguas, vegetales y alimentos. Son bacilos Gram negativos inmóviles, a menudo
capsulados. La cápsula es de naturaleza polisacarídica.. Desde el punto de vista antigénico, es
útil en epidemiología la determinación de los antígenos capsulares. Existen más de 70 tipos
capsulares diferentes. Pueden existir reacciones cruzadas con antígenos capsulares de otras
especies bacterianas. El poseer cápsula otorga a estas bacterias un aspecto colonial mucoide.
Se trata de patógenos oportunistas, pueden provocar diversos cuadros clínicos en el hombre:
infecciones urinarias, bacteriemias, neumonías, infecciones hepato-biliares, etc. Un porcentaje
elevado de aislamientos de Klebsiella, particularmente aquellos de infecciones nosocomiales,
contienen plásmidos de resistencia a los antibióticos.

En las pruebas bioquímicas para Kebsiella en la prueba lisina no se pudo apreciar el violeta con
mayor concentración, sin embargo, se observó una mínima coloración, lo que puso ocasionar
esto fue que se inoculo de una manera inadecuada.

PARTE II: RECUENTO DE COLONIAS CON ASA CALIBRADA

En esta parte es importante aclaras que en los cuatro cultivos para Salmonella, Klebsiella,
E.coli y Proteus, solo Proteus y salmonella tuvieron un crecimiento satisfactorio por lo cual
tomamos estos para hacer el respectivo recuento de colonias.

Imagen 1: Resultados para proteus y salmonella en medio CLED

Imagen 2: Recuento de colonias para Proteus.

Raya N⁰1: 6cm completa

Raya N⁰2: 8,5 cm completa

Raya N⁰3: 8,5 cm completa

Raya N⁰4:8.0 cm completa

Imagen 3: Recuento de colonias para Salmonella.

Raya N⁰1: 5,6cm total – 0.5(fragmento pequeño de la línea)cm incompleta

Raya N⁰2: 7,5 cm completa

Raya N⁰3: 8,5 – 0.1 cm incompleta

Raya N⁰4:7,0cm completa

CONCLUSIONES

 Las pruebas bioquímicas para microorganismos son de vital importancia para

reconocer los generos y especies de microorganismos, que causan infecciones
en el hombre o animales.
 En nuestro laboratorio existieron confusiones que nos limitaban de una óptima
interpretación de resultados, lo que nos permite concluir que es de vital
importancia conocer el fundamento previamente antes del laboratorio.
CUESTIONARIO

1. Cual es papel de las enterobacterias en el tracto intestinal humano

 2. Por qué se afirma que algunas enterobacterias son oportunistas.

3. Cuáles son los bacilos Gram negativos no fermentadores y porque no se incluyen en la

familia Enterobacteriaceae.

REFERENCIAS BIBLIOGRAFICAS

1. Algorta, G; BACILOS GRAM NEGATIVOS NO EXIGENTES (ENTEROBACTERIACEAE,

VIBRIONACEAE, PSEUDOMONAS) Disponible en:
(http://higiene.edu.uy/cefa/Libro2002/Cap%2022.pdf). Fecha de consulta
(15/06/2019)
2. Prueba bioquímica TSI Disponible en :
(http://www.ucv.ve/fileadmin/user_upload/facultad_farmacia/catedraMicro/tsi.pdf).
Fecha de consulta(15/06/2019)
3. Prueba bioquímica citrato Disponible en:
(https://www.britanialab.com/back/public/upload/productos/upl_5a29779bd2be8.pd
f) Fecha de consulta(15/06/2019)
4. Prueba bioquímica Lisina hierro agar Disponible en:
(https://www.britanialab.com/back/public/upload/productos/upl_5a282fb7b6204.pdf
) Fecha de consulta(15/06/2019).
5. Prueba bioquímica ureasa disponible en: (
https://.www.britanialab.com/back/public/upload/productos/upl_5af086c156e97.pdf
) Fecha de cocnsulta (15/06/2019).
6. Prueba bioquímica MIO disponible en :
(https://www.britanialab.com/back/public/upload/productos/upl_5a2832fb81126.pdf
) fecha de consulta (15/06/2019).
7. Escherichia coli diponible en :
(http://www.aam.org.ar/descarga-archivos/Parte21Enterobacterias.pdf) fecha de
consulta (16/06/2019)
8. Aislamiento de enterobacterias disponible en :
(file:///C:/Users/ACER/Documents/MICROBIOLOGIA/tesis198.pdf) fecha de consulta
(16/06/2019)
9. Proteus disponible en : (Rafael Cantón; Paz Sánchez
Morenohttps://www.seimc.org/contenidos/ccs/revisionestematicas/bacteriologia/
Ppenneri.pdf) fecha de consulta (16/06/2019)
10. Klepsiella disponible en :( http://higiene.edu.uy/cefa/Libro2002/Cap%2022.pdf) fecha
de consulta (16/06/2019)