Diagrama de flujo simplificado

yema de huevo

aislar LF y LNF
Prof Fdo Fco Hdz Clemente
Digestión
Kjeldahl
Curva
Cromatografía en Cuantificación
estándar de
capa fina: de P
fosfatos
(la corrección
(requiere
Preparación para obtener
cálculos
Aplicación/Elución la [ original]
adicionales y
Revelado de P es
diferentes)
diferente de
la de
albúmina)

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 Lípidos: cuantificación de P
Método de Fiske & Subbarow

R1

R2

Patrón
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 Patrón de fosfatos y curva estándar

En el manual falta indicar

la preparación del blanco
de reactivos, que se usa
para calibrar el
espectrofotómetro
¿cómo lo prepararías?

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Cálculos para generar Curva Estándar para cuantificación de P
1) Relación teórica
KH2PO4 (Peso fórmula 136 g/mol)… P (peso atómico 31g/mol)

2) Dato de la solución patrón (de las instrucciones del manual)

Solución patrón KH2PO4
0.4394g/1000 ml= 4.394 X 10-4 g/ ml Solución Stock

Se diluye 1:10 por lo tanto se divide entre 10

4.394 X 10-4 g/ ml entre 10 = 4.394 X 10-5 g/ ml
4.394 X 10-5 g/ ml
Solución de trabajo (ésta es la que se usa para la curva estándar)

3) Para calcular cuántos microgramos de P hay en cada vaso de precipitados

Regla de tres:
En 136 g/mol de KH2PO4 hay 31g/mol de P
Entonces en 4.394 X 10-5 g KH2PO4 / ml…….hay «X» P

«X»= 1.001573 X 10-5 g de P

Convirtiéndolo a µg:

1 X 10-5 g de P X 106 µg/1g = = 10 microgramos P /ml

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4) Obtener [P] microgramos en cada vaso precipitados
Volúmenes de solución patrón añadidos en el experimento:
0.2 ml, 0.6 ml, 1 ml, 2 ml y 3 ml

Soln. Trabajo del patrón: en 1 ml hay 10 microgramos P

Entonces en 0.2 ml hay «X» microgramos de P

10 microgramos P X 0.2 ml = 2 microgramos de P

1 ml
repetir el cálculo con 0.6 ml, 1 ml, 2 ml, 3 ml

Los microgramos de P obtenidos se grafican en el Eje de las X

5) Curva estándar
Graficar Absorbancia (en Y) vs [microgramos P] (en X)

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 5) Curva estándar
Graficar Absorbancia (en Y) vs [microgramos P] (en X)
linealizar
obtener r2

Curva estándar para la determinacón de Fósforo en

lípidos de la yema de huevo por el método de Fiske y
0.4
Subbarow
Absorbancia

0.35 y = 0.0805x - 0.0235

R² = 0.9963
0.3

0.25

0.2

0.15

0.1

0.05

0
2
10μg 6 10
30μg 20 50μg 30 µg 100μg
P
Fosforo (μg)

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 6) Interpolación de absorbancia de muestras problema
LF y LNF

Curva estándar para la determinacón de Fósforo en

lípidos de la yema de huevo por el método de Fiske y a) Interpolar
0.4
Subbarow Absorbancia de
Absorbancia

LF(0.19) y NF (.08)
0.35 y = 0.0805x - 0.0235
R² = 0.9963
para obtener
0.3 microgramos de P
0.25

0.2 b) Sumar los microgramos de P

LF=
0.19 anteriores para obtener P total,
0.15
p.ej
0.1 5.2 + 21= 26.2 microgramos de P
NF=
.08
0.05

0
2
10μg 6 10
30μg 20 50μg 30 µg 100μg
P
5.2 21
Fosforo (μg)
= NF = LF

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 7) Correcciones para obtener la concentración
original de P y su %

(x)

(x)

a) Factor de corrección para la muestra problema:

Pasos 4-5 del procedimiento : de los 50 ml que contienen toda la masa de P sólo se toma 1 ml para
la cuantificación. por lo tanto se requiere multiplicar X 50
En el ejemplo considerado sería:
26.2 microgramos de P X 50= 1310 microgramos de P total (x) Hay otra dilución 1:10 pero también se hace en la
Soln. Patrón por lo que no se considera (o se tendría que
considerar tanto para el problema como para el patrón)

b) Expresar el P total obtenido como % del LF pesado (el procedimiento indica pesar 10 mg de LF
aunque cada equipo pesa una cantidad aproximada a este valor pero diferente.
(otra alternativa es reportarlo en relación al fosfolípido más abundante)

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Diagrama de flujo simplificado
yema de huevo

aislar LF y LNF
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Digestión
Kjeldahl
Curva
Cromatografía en Cuantificación
estándar de
capa fina: de P
fosfatos
(la corrección
(requiere
Preparación para obtener
cálculos
Aplicación/Elución la [ original]
adicionales y
Revelado de P es
diferentes)
diferente de
la de
albúmina)

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 Lípidos: aislamiento
• Yema de huevo + 90 ml
CHCl3/MetOH homogenizar,
dejar 10 min
• Dar la mitad al equipo
vecino
• Filtrar
• Lavar con NaCl 1 % 25 ml en
embudo de separación,
dejar 15 min (hacer
suavemente para no
emulsionar
• Dejar reposar para separar
las fases. Recuperar la fase
clorofórmica en vaso de
precipitados http://mcat-review.org/separations-
purifications.php/

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 Lípidos: aislamiento
• Eliminar agua con Na2SO4
(aproximadamente 2 g o una
cucharadita), agitar con varilla, y
filtrar. Si la solución es límpida,
proceder a evaporar. Si esta
turbia agregar más Na2SO4 agitar
y volver a filtrar.
• Evaporar (*ver diapositiva
siguiente) usando un vaso de
——>
precipitados de buen tamaño en
baño María en campana de
extracción hasta que tenga
consistencia aceitosa y no huela
a solvente.
• (*) Hidroquinona o diterbutil-
metil-fenol o atmósfera de N2
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En la metodología original recomiendan agregar el antioxidante
desde el paso de evaporación, ya que con el calentamiento y el
aire, los lípidos son más susceptibles de oxidarse.

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 Aislamiento: separación de LF y LNF
(*)

(x)

Las muestras de LF y LNF se distribuyen c/u en 2 alícuotas: una pequeña

porción en un microtubo Eppendorf (para cromatografía) y la porción de mayor
volumen en un frasco ámbar con tapón de rosca (para digestión Kjeldahl).
(*) Antes de eliminar todo el solvente y de agregar la acetona, se pide a algún
equipo que separe una alícuota de Lípidos totales
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 Lípidos: digestión Kjeldahl

Este
documento
está en el
classroom

Proteínas + H2SO4 (NH4)2SO4 +SO2 +SO3 + H2O+ CO + CO2 + (Minerales)

Originalmente lo desarrolló el químico danés Johan Kjeldahl para determinar contenido de N como
medida INDIRECTA de contenido de proteína de granos usados en producción de cerveza

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 Cuantificación de N por método Kjeldahl
aplicado a diversos tipos de muestras

En alimentos se usa como medida INDIRECTA de contenido de proteína pero...........

Susceptible de error (y de engaños!)
2008 en China: se vendieron fórmulas lácteas para niños con melamina (resinas con N)!!
que artificialmente hacían que el supuesto contenido proteico de las fórmulas lácteas fuera
excelente!!!! Obviamente hubo niños que fallecieron.

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 Lípidos: digestión Kjeldahl
Condiciones y reactivos
• Ácido sulfúrico, calentamiento en digestor
• Agentes oxidantes: H2O2 : permanganato de
potasio (ya no se usa para N), persulfato de K
• Catalizadores: CuSO4 , HgO (complejos con
NH4), Se ( sensible a sales, ácido, pérdidas),
titanio, o mezclas incluyendo vanadio y telurio

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 En nuestro experimento con lípidos, la digestión
Kjeldahl nos servirá para obtener P
LÍpídos + H2SO4 (NH4)2SO4 +SO2 +SO3 + H2O+ CO + CO2 + (Minerales, P2 O7 -4)

Evaporar el solvente de LF y LNF. Pesar aproximadamente 10 mg de cada lípido (LF y

LNF) sobre papel filtro.

Depositar cada papel con lípido LF y LNF en su matraz MicroKjeldahl respectivo.

Añadir 1 ml de H2SO4 a cada matraz , colocar perlas de ebullición y poner en digestor

(entre los números 7 y 8 de la perilla del digestor)

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Colocación matraces microKjeldahl
en el digestor
https://www.youtube.com/wa
Calentar por 10-15 min, retirar con tch?v=LTddjI6jkp4
cuidado, dejar enfriar un poco, añadir
gotas de peróxido de hidrógeno y poner
nuevamente a digestión.
Repetir el proceso hasta que el líquido se
vea incoloro y transparente tanto para LF
como LNF.

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 Aspecto de las muestras durante y al final de la
digestión Kjeldahl
https://www.youtube.com/watch?v=LTddjI6jkp4

DURANTE: AL FINALIZAR:
Mezcla oscura Líquido límpido e incoloro
= seguir la digestión = listo para cuantificar P

Transferir los líquidos obtenidos de la digestión de LF y LNF

respectivamente a un matraz limpio y aforar cada uno a 50 ml con agua.
Tomar 1 ml de cada uno (LF y LNF) y volver a aforar por separado en otro
matraz a 10 ml con agua.

Transferir esta 2ª solución a vaso de precipitados.(Método de Fiske y

Subbarow)
Agregar Reactivo 1, Incubar 10 min, luego reactivo 2 incubar por 5 min.
Leer en espectro calibrando con blanco de papel.
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Diagrama de flujo simplificado
yema de huevo

aislar LF y LNF
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Digestión
Kjeldahl
Curva
Cromatografía en Cuantificación
estándar de
capa fina: de P
fosfatos
(la corrección
(requiere
Preparación para obtener
cálculos
Aplicación/Elución la [ original]
adicionales y
Revelado de P es
diferentes)
diferente de
la de
albúmina)

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Cromatografía en capa fina (CCF),
en inglés (TLC)

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 Preparación Placas para CCF
Mezcla de sílica-gel en NaOH .01 N

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 Preparación Placas para CCF
Vaciado de la mezcla en placas de vidrio escrupulosamente lavadas, se esparce la mezcla por
inclinación/rotación. (se puede extender con una varilla de vidrio).

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 Preparación Placas para CCF
Dejar secar (40 min) y activar en estufa a100-120 o C x 1 hora

Una vez secas y activadas:

1) se hace una plantilla en un papel
para posicionar la línea de aplicación
(mínimo a 2 cm del borde inferior de
la placa) y de tal manera que el total
de muestras (LF, LNF y lípidos
totales) de los diferentes equipos
queden equidistantes
2) se hacen 3 aplicaciones de cada
muestra con microcapilares dejando
secar la muestra entre cada
aplicación
3) Se colocan en las cámaras de
elución. Se tapan y sellan con
masking tape y se dejan eluir hasta
que la fase móvil legue a unos 2 cm
del borde superior

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 Esquema del cromatograma original
pag 115 del manual

Frente de fase móvil

DPG y PI X
no se
separan ni
revelan X
PS Y PC
se
separan
de manera Corrimiento vertical
invertida Línea de aplicación
de LF y LNF

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 Cromatograma resultante esperado
en nuestras condiciones de trabajo

LÍPIDO NEUTRO
v v
Prof. Fernando Hdz
Prof. Fernando Hdz
FOSFATIDIL-
ETANOLAMINA

FOSFATIDILCOLINA

FOSFATIDILSERINA

ESFINGOMIELINA

LISOLECITINA

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 Revelado de las placas
1) Se retiran las 4 placas de CCF de la cámara de elución

2) Se secan en la campana de extracción

3) Para su revelado, excepto la de yodo, se colocan en campana cubierta

con papel y con un aspersor se les rocía con el revelador respectivo (debe
uno usar guantes por la toxicidad de los reveladores):

molibdato (a Temp. ambiente)

bismuto (a Temp. ambiente)

ninhidrina (requiere calentamiento a 100- 110 oC X15 min)

yodo ( en una cámara de elución cubierta por fuera con papel aluminio, se
colocan cristales de yodo para que sublimen y se introduce la placa para
revelar a Temp. ambiente durante 10-15 minutos)

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 Revelado con molibdato
(en esta y las siguientes imágenes los lípidos en rojo son los que se espera
que revelen , los lípidos en negro es sólo en referencia al esquema general
del cromatograma de la pag 26 de este documento)
Revelado de lípidos con Iodo

Fosfatidiletanolamina (PE)

Fosfatidilcolina (PC)
Profesor Fernando Hernandez
Fosfatidilserina (PS)

Esfingomielina (SM)

Lisolecitina (LPL)
Revelado de lípidos con ninhidrina

Fosfatidiletanolamina (PE)

Prof. Fernando Hernández

Fosfatidilcolina (PC)

Fosfatidilserina (PS)

Esfingomielina (SM)

Lisolecitina (LPL)
Revelado de lípidos con bismuto

Fosfatidiletanolamina

Fosfatidilcolina (PC)

Prof Fdo Fco Hdz Clemente

Fosfatidilserina (PS)

Esfingomielina (SM)

Lisolecitina (LPL)
 En su informe deberán incluir para
cada revelador:
Bi 1 Nombre de revelador,
2 Tipo general de lípidos que revela
3 La estructura específica de un
lípido de esa categoría indicando
donde reacciona el revelador.

En este ejemplo es
1 Bismuto
2 Revela lípidos con colina
Prof. Fdo Hdz Clemente
3 Lípido específico: lisolecitina
indicando donde reacciona el
bismuto

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