Reprinted from New Beer in an Old Bottle: Eduard Buchner and the Growth of Biochemical

Knowledge, pp. 33–40, ed. A. Cornish-Bowden, Universitat de València, Spain, 1997

FERMENTACIÓN ALCOHÓLICA
SIN CÉLULAS DE LEVADURA*

Eduard Buchner

Hasta ahora no se había conseguido separar la acción fermentativa de las

células vivas de levadura. Se describe a continuación un procedimiento
que resuelve el problema.
Para obtener levadura desecada limpia, todavía sin diluir en
almidón de patata, se mezcla y luego se tritura un kilogramo de levadura
de cerveza1 con el mismo peso de arena de cuarzo2 y 250 gramos de
polvo silíceo, hasta que la masa está húmeda y moldeable. Se añade a la
pasta 100 gramos de agua y se la coloca en una prensa, en la que se la va
sometiendo paulatinamente desde una presión de 4 hasta 500
atmósferas; se obtienen 300 centímetros cúbicos de jugo. La masa
restante vuelve a triturarse, se filtra y se le añade 100 gramos de agua;
sometida de nuevo en la prensa hidráulica a la misma presión, se
obtienen otros 150 centímetros cúbicos de jugo. Así pues, de un
kilogramo de levadura se consiguen 500 centímetros cúbicos de jugo,
que contienen en torno a 300 de sustancias celulares. Para evitar un
enturbamiento residual, el jugo se agita finalmente con 4 gramos de
tierra silícea y se filtra con papel de filtro, vertiendo varias veces la
primera parte.
El jugo así obtenido es un líquido amarillo claro, sólo opalescente,
con agradable olor a levadura. Su peso específico a 17° C es de 1.0416.
Con la cocción se produce un intenso precipitado de coágulos, de

*Comunicación preliminar, recibida el 11 de enero. Traducido de Ber. Dt. Chem.

Ges. 30, 117–124 (1897) por José M. López Piñero.
1 Se quita el agua contenida en la superficie y a una presión de 25 atmósferas ya
no expulsa más.
2 El polvo de cristal resulta poco adecuado, debido a su acción débilmente
alcalina.

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forma que el líquido se solidifica casi completamente; la formación de

grumos insolubles comienza a los 35–40°, observándose antes la apari-
ción de burbujas, que se ha comprobado que son de anhídrido carbó-
nico y que después llenan todo el líquido3. El jugo contiene más del
10 % de sustancia seca. En otro obtenido anteriormente con un procedi-
miento menos perfeccionado, se encontró 6.7 % de sustancia seca,
1.15 % de cenizas y, como estimación del contenido nitrogenado, 3.7 %
de albúmina.
La característica de mayor interés del jugo es que fermenta los
hidratos de carbono. Al mezclarlo con el mismo volumen de una
solución concentrada de azúcar de caña, entre un cuarto de hora y una
hora comienza la formación regular de anhídrido carbónico, que dura
todo el día. Lo mismo sucede con el azúcar de uva, de fruta y de malta;
por el contrario, no aparece ningún fenómeno fermentativo al mezclar
el jugo con azúcar concentrado de leche o con una solución de manitol,
ya que ambas tampoco son fermentadas por células vivas de levadura de
cerveza. Las mezclas de jugo y de solución azucarada que están en
fermentación varios días en la nevera se enturbian lentamente, sin que
aparezcan microorganismos; por el contrario, con 700 aumentos se
observan coágulos de albúmina bastante numerosos, cuyo precipitado
está probablemente condicionado por los ácidos resultantes de la
fermentación. La impregnación con cloroformo de la mezcla del jugo y
la solución de sacarosa no inhibe la fermentación, pero conduce pronto
a un descenso del precipitado de la albúmina. Tampoco anula la fuerza
fermentativa el filtrado del jugo con un filtro de Berkefeldt de polvo
silíceo, que retiene con seguridad todas las células de levadura; la mezcla
del líquido filtrado, completamente claro, con una solución esterilizada
de azúcar de caña conduce también a la fermentación, aunque con
retraso, al cabo de un día aproximadamente, incluso a la temperatura de
la nevera. Al colocar un tubo de papel pergamino lleno de jugo en una
solución al 37 % de azúcar de caña, la superficie del tubo se cubre, al
cabo de unas horas, de numerosas y minúsculas burbujas; por supuesto,
en su interior se observa también una activa producción de gas,
consecutiva a la difusión de la solución de azúcar. Experiencias
posteriores decidirán si el vehículo de la fuerza fermentativa puede
atravesar efectivamente, como parece*, el papel pergamino. La
capacidad fermentativa del jugose va perdiendo lentamente con el

3 Los fisiólogos vegetales decidirán si este anhídrido carbónico tiene relación con
el procedente de los procesos oxidativos respiratorios.
*Esta observación era retirado por Buchner y Rapp [Ber. Dt. Chem. Ges. 31,
209–217 (1898), pág. 213] [Nota del editor].

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iempo; el jugo mantenido cinco días en agua helada en frascos a medio

llenar carece de actividad ante la sacarosa. Es notable, en cambio, que el
jugo diluído con azúcar de caña, es decir, con actividad fermentativa,
conserve dicha actividad al menos dos semanas. Debe pensarse ante todo
en una influencia favorable del anhídrido carbónico producido por la
fermentación en el oxígeno del aire; no obstante, el azúcar fácilmente
asimilable puede contribuir también al mantenimiento del agente.
Para obtener conclusiones acerca de la naturaleza de la sustancia
activa del jugo, se han realizado hasta ahora solamente unos pocos
experimentos. Al calentar el jugo a 40–50° apareció primero la produc-
ción de anhídrido carbónico y luego, paulatinamente, el precipitado de
la albúmina coagulada; al cabo de una hora, se filtró, con vertidos
reiterados. En un experimento, el líquido filtrado claro conservaba aún
una escasa fuerza fermentativa para el azúcar de caña, mientras que en
otro había desaparecido; en consecuencia, ya a esta baja temperatura, la
sustancia activa parece perder su acción o coagularse y desaparecer.
Posteriormente se disolvieron 20 centímetros cúbicos del prensado en el
triple volumen de alcohol absoluto, aspirando luego el poso y secándolo
al vacío con ácido sulfúrico; quedaron 2 gramos de sustancia seca, que
volvieron a ser diluídos al máximo en 10 centímetros cúbicos de agua. El
filtrado carecía de acción fermentativa ante el azúcar de caña. Estos
experimentos tienen que ser repetidos; en especial hay que intentar
aislar la sustancia activa mediante el sulfato amónico.
Para la teoría de la fermentación pueden sacarse hasta el momento las
siguientes conclusiones. En primer término, se ha comprobado que para
producir el proceso fermentativo no es necesaria una estructura tan
complicada como la célula de levadura. Como vehículo de la acción
fermentativa del jugo hay que pensar más bien en una sustancia soluble,
sin duda un cuerpo albuminoide, que debe ser denominado zimasa.
La idea de que un cuerpo albuminoide específico que se desarrolla
en la célula de levadura produce la fermentación fue ya expuesta en
1858 por Moritz Traube como teoría enzimática o fermentativa y, más
tarde, ha sido defendida sobre todo por Felix Hoppe-Seyler. Sin embargo,
la separación de tal enzima de la célula de levadura no se había
conseguido hasta ahora.
Resulta todavía hoy problemático si la zimasa debe incluirse entre
las enzimas conocidas desde hace mucho tiempo. Existen importantes
diferencias entre la acción fermentativa y las de las enzimas habituales,
como ha puesto de relieve Carl von Naegeli4 . Estas últimas son meras
hidrólisis que pueden ser reproducidas con medios químicos sencillos.
Aunque Adolf von Baeyer5 ha contribuido a que entendamos mejor el

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BUCHNER
proceso de la fermentación alcohólica, explicándolo con principios
químicos relativamente sencillos, la disgregación del azúcar en alcohol y
anhídrido carbónico continúa perteneciendo a las reacciones químicas
complejas; en ella se separan los enlaces del carbono de una forma tan
completa que no se consigue por otro medio. También en la producción
de calor hay una diferencia significativa6.
La invertina puede extraerse con agua de las células de levadura
muertas por el calor seco (una hora a 150°) y aislarse por precipitación
en alcohol en forma de un polvo muy soluble en agua. De este modo no
puede obtenerse la sustancia con actividad fermentativa. En las células
de levadura calentadas a tan alta temperatura no se encuentra en
absoluto; del experimento antes expuesto puede deducirse que por
precipitación en alcohol se convierte en otra sustancia insoluble en agua.
En consecuencia, apenas cabe duda de que la zimasa pertenece a las
sustancias albuminoides genuinas y que está mucho más cerca del proto-
plasma vivo de las células de levadura que la invertina.
Parecidos puntos de vista ha manifestado el bacteriólogo francés
Miquel en relación con la urasa, enzima segregada por las bacterias de la
llamada fermentación de la urea; la considera simplemente como
protoplasma que, privado de la protección de la membrana celular,
actúa fuera de la misma, diferenciándose únicamente por ello del
contenido celular7. También están relacionados con el tema los
experimentos de E. Fischer y P. Lindner8 relativos a la acción del hongo
de levadura Monilia candida sobre el azúcar de caña. Este hongo
fermenta la sacarosa; sin embargo, ni Ch. E. Hansen ni los autores
citados han conseguido extraer con agua de esta levadura fresca o
desecada una enzima del tipo de la invertina que produzca dicho
proceso en el azúcar de uva y en el de la fruta. Completamente distinto
fue el resultado del experimento cuando Fischer y Lindner utilizaron

4 Theorie der Gährung (Teoría de Fermentación), München, 1879, pág. 15.

5 En estos Berichte, vol. 3, pág. 73.
6 Recientemente, A. Bouffard ha vuelto a determinar la producción de calor en la
fermentación alcohólica por células germinales. Compt. rend. 121, 357.
7 En todo caso, hay que poner de relieve que la llamada fermentación de la urea,
o disgregación de la urea en amoníaco y anhídrido carbónico, es muy diferente desde
el punto de vista químico de los procesos fermentativos propiamente dichos, por lo que
no es considerada por muchos autores como fermentación. Se trata de una simple
hidrólisis, que se obtiene con agua a 120°.
8 En estos Berichte, vol. 28, pág. 3037.

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 F ERMENTACIÓN ALCOHÓLICA SIN CÉLULAS DE LEVADURA

levadura de Monilia fresca, fragmentando parte de las células mediante

una cuidadosa trituración con polvo de cristal. La acción catalizadora de
la hidrólisis no se produjo entonces. “Por lo demás, el agente no parece
ser en este caso una enzima estable soluble en agua, sino un
componente del protoplasma vivo.”
La fermentación del azúcar por la zimasa puede producirse en el
interior de la célula de levadura9; sin embargo, las células de levadura
probablemente segregan este cuerpo albuminoide en la solución de
azúcar en la que producen fermentación10. En la fermentación alcohó-
lica hay quizá que entender el proceso como una acción puramente
fisiológica, ya que son las células de levadura vivas las que segregan la
zimasa. Naegeli11 y O. Löw han indicado que, a 30° y a partir de las 15
horas, de las células de levadura salen por diósmosis considerables
cantidades de sustancias albuminoideas coagulables por el calor a una
solución nutritiva, que al principio reacciona de forma débilmente alca-
lina (con PO4K3) y luego es neutra. De hecho, la zimasa atraviesa
también el papel pergamino, como indica el experimento antes
expuesto.

EXPERIMENTOS SOBRE LA FERMENTACIÓN

Sol. de hidratos Contenido

Jugo de carbono azúcar Temperatura
N° cc cc % experimental Observaciones

1 30 Sacarosa 30 37 Nevera Al cabo de una hora, clara pro-

ducción de gases, que no había
terminado a las 14 horas. Capa de
espuma de 1 cm de espesor.

9 Pueden considerarse posibles los procesos diosmóticos. Véase Naegeli, loc. cit.,
pág. 39.
10 Con ello se explican también seguramente los experimentos de J. de Rey-
Paihade (Comptes rendues, vol. 118, pág. 201), que ha obtenido un débil extracto
alcohólico con levadura fresca de cerveza, añadiendo un poco de azúcar de uva. Tras
eliminar los microorganismos mediante filtrado con una bujía de Arsonval estéril, en
este extracto con contenido de azúcar aparece espontáneamente anhídrido carbónico
al agotarse el oxígeno.
11 Loc. cit., pág. 94. Estos experimentos han sido repetidos con los mismos
resultados; únicamente se ha comprobado que se producían también con soluciones de
sacarosa y de lactosa. Por lo tanto, los procesos de difusión no están asociados a la
actividad fermentativa, como suponen los autores citados.

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BUCHNER

2 50 ” 50 37 ” Fuerte producción de gases y capa

de espuma. La solución, clara al
principio, se hizo opalescente a los
3 días, sin que hubiera precipitado.
3 150 ” 150 37 ” Capa de espuma de 3/4 cm de
espesor a los 3 días
4 20 ” 20 37 ” La producción de gases apare- ció a
las 2 horas y no había cesado a los
14 días. El líquido, claro al prin-
cipio, presentaba al final solamente
un mínimo enturbiamiento. Capa
de espuma de 1.5 cm de espesor.
5 30 ” 30 37 ” La producción de gases comenzó al
cabo de un día y no había
terminado en una semana. La
solución era entonces completa-
mente clara.
6 20 ” 20 37 Temp. Producción intensa de gases al
ambiente cabo de un día; a las dos semanas
de mantenía un poco con un
enturbiamiento mínimo.
7 20 ” 20 37 40° A las dos horas, una capa de espu-
ma de 10 cm de espesor; al cabo de
un día, intensa formación de
coágulos y final de la formación de
gases.
8 30 ” 30 12 Nevera A los 6 días de mantenía una in-
tensa producción de gases; por otra
parte, enturbiamiento consistente
de coágulos finamente divididos.
9 5 Maltosa 5 33 ” Al cabo de una hora, comienzo de
la producción de gases, que
mantenía a los 12 días.
10 10 ” 5 26 ” La producción de gases era ya
extraordinariamente intensa a las 3
horas.
11 10 Glucosa 10 33 ” La producción de gases inició a las
20 horas, pero se mantenía a los 12
días. Capa de espuma de 3/4 cm de
espesor.
12 10 ” 10 26 ” A la media hora, producción de
gases bastante intensa, que se
mantuvo 12 días. La solución se
enturbió y presentaba algo de
sedimento.
13 10 Fructosa 10 37 ” La producción de gases era ya muy
intensa a la media hora y se
mantuvo activa 3 días. La solución

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 F ERMENTACIÓN ALCOHÓLICA SIN CÉLULAS DE LEVADURA

se conservó clara.
14 10 ” 10 25 ” La capa de espuma era visible a los
15 minutos y alcanzó 1 cm de
espesor a los 3 días.
15 10 Lactosa 10 Sol. sat. Temp. No se produjeron gases, ni
ambiente siquiera a los 6 días.
16 10 Manita 10 ” ” Igual que la lactosa

NOTAS

En el experimento 1, el gas producido se condujo a agua caliza a las tres horas del
comienzo de su aparición, siendo identificado como anhídrido carbónico. En los
números 2 y 3, se determinó a los tres días el alcohol formado por la fermentación:
había 1.5 gramos de alcohol etílico en el número 2 y 3.3 gramos en el número 3; de
aquí hay que descontar las cantidades que tenía la levadura utilizada, procedentes de la
preparación de la cerveza. En el número 2, la levadura, antes de obtener el jugo, fue
lavada cuatro veces con 5 litros de agua en cada una; luego se determinó el alcohol en
2/3 del total, utilizándose el resto para el jugo; según los resultados, había en la
levadura utilizada 0.3 gramos de alcohol como máximo. En el número 3, para la
obtención del jugo mediante prensado, se utilizó directamente levadura de cerveza
comercial depurada pero sin concentrar; el contenido alcohólico de la levadura
necesaria para obtener 150 centímetros cúbicos de jugo era, de acuerdo con la
correspondiente determinación, de 1.2 gramos. Por consiguiente, en el número 2 se
produjo por la fermentación 1.2 gramos de alcohol y 2.1 en el número 3. En todos los
casos se identificó el alcohol mediante la reacción yodofórmica, separándolo luego con
potasa de la solución acuosa. El precipitado obtenido en el número 3 se completó
entre 79 y 81° (734 mm), siendo el líquido destilado incoloro, inflamable y con olor a
alcohol etílico.
Se realizaron indagaciones microscópicas en los experimentos números 2 y 3 a los
tres días, en el número 8 a los seis y en el número 9 a los doce de fermentación
continuada del pequeño poso; en ninguno de los casos aparecieron microorganismos,
sino únicamente coágulos albuminosos como causa del mayor o menor
enturbiamiento. En el experimento número 3 se prepararon, además, seis placas de
cultivo, tras interrumpirlo a los tres días de duración. En una ocasión se puso como
siembra un centímetro cúbico de líquido en tres tubos con gelatina fluida de mosto de
cerveza y, en otro, un centímetro cúbico en tres tubos con gelatina fluida de peptona
de caldo de carne. A los seis días, había 11 colonias en una de las placas con gelatina de
mosto, permaneciendo estériles las dos restantes; en tres con gelatina de peptona
aparecieron al mismo tiempo de 50 a 100 colonias, que se licuaron. Teniendo en
cuenta la considerable cantidad de fluido utilizado como siembra en estos
experimentos, los resultados demuestran que la acción fermentativa no depende de
microorganismos, lo que, por otra parte, se deduce de la rápida aparición de los
fenómenos de la fermentación.
Por último, en los experimentos números 4 y 5, el jugo se pasó a través de filtros
esterilizados de Berkefeldt de polvo silíceo. En el número 5, la solución de azúcar de caña
fue, además, esterilizada en un autoclave y la mezcla de ambos líquidos se manejó con
todas las reglas preventivas de la asepsia.

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El método expuesto ha resultado también adecuado para obtener el

contenido de la células bacterianas, estando en curso de realización
experiencias al respecto, incluso con bacterias patógenas, en el Instituto
de Higiene, de Munich.

Tübingen, 9 de enero de 1897

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