Biosíntesis de etanol

Los seres humanos han estado preparando bebidas fermentadas por más de 5000 años.
Materiales excavados en tumbas egipcias que datan del tercer milenio a.c demostraron las
operaciones utilizadas en la elaboración de cerveza y pan con levadura. La historia de la
fermentación, por la cual el azúcar se convierte en etanol por la acción de la levadura, es también
una historia de la química. La palabra gas fue acuñada por van Helmont en 1610 para describir las
burbujas producidas en la fermentación. Leeuwenhoek observó y describió las células de la
levadura con su microscopio recién inventado en 1680. Joseph Black descubrió en 1754 el dióxido
de carbono y demostró que era un producto de la fermentación, la combustión del carbón y la
respiración. Lavoisier en 1789 mostró que el azúcar produce etanol y dióxido de carbono y realizó
mediciones cuantitativas de las cantidades consumidas y producidas.

Una vez que se estableció el concepto de mol, Gay-Lussac 1815 pudo mostrar que 1 mol de
glucosa da exactamente 2 moles de etanol y 2 moles de dióxido de carbono. Pero el proceso de
fermentación dejó perplejos a algunos grandes químicos. El poco conocido Kutzing escribió en
1837, sobre la base de la observación microscópica, "Es obvio que los químicos ahora deben quitar
la levadura del rollo de compuestos químicos, ya que no es un compuesto sino un cuerpo
organizado, un organismo". En el otro lado había químicos como Berzelius, que creían que la
levadura tenía una acción catalítica; y Liebig, quien presentó una "teoría del movimiento de los
elementos dentro de un compuesto que causó una perturbación del equilibrio que se comunicó a
los elementos de la sustancia con la que entró en contacto formando así nuevos compuestos".

Quedó para Pasteur demostrar que la fermentación fue una acción fisiológica asociada con los
procesos vitales de la levadura. A través de su microscopio pudo ver las células de levadura que
crecían naturalmente en la superficie de las uvas. Mostró que el jugo de uva extraído
cuidadosamente del centro de una uva y expuesto al aire limpio no fermentaría. En su artículo
clásico de 1857, describió la fermentación como la acción de un organismo vivo; pero debido a que
la conversión de glucosa a etanol y dióxido de carbono es una ecuación equilibrada, otros
químicos disputaron sus hallazgos. Ellos buscaron la sustancia en la levadura que podría causar la
reacción. La búsqueda duró 40 años, y finalmente terminó con un inteligente experimento de
Eduard Büchner. Hizo un extracto de levadura sin células que aún causaría la conversión de azúcar
en alcohol. Este extracto sin células contenía los catalizadores, que ahora llamamos enzimas, que
eran necesarios para la fermentación, un descubrimiento que le valió el premio Nobel de 1907. En
1905, Harden descubrió que el fosfato inorgánico agregado a las enzimas aumentaba la tasa de
fermentación y se consumía. Este resultado lo llevó a aislar finalmente la fructosa 1,6-difosfato.
Claramente, la historia de la bioquímica está íntimamente asociada con el estudio de la
fermentación alcohólica.

Los pueblos antiguos descubrieron muchas de las reacciones esenciales de la fermentación

alcohólica completamente por accidente. El hecho de que las uvas trituradas pronto empiecen a
formar burbujas y producir una bebida agradable es un descubrimiento perdido en el tiempo.
Pero, ¿qué pasa con aquellos que vivían en climas más fríos donde la uva no crecía? ¿Cómo
descubrieron que el almidón de trigo o cebada podía convertirse en azúcar por las enzimas en la
malta? Cuando el grano germina, se producen enzimas que convierten el almidón en azúcar. El
proceso de malteado consiste en dejar que el grano comience a germinar y luego calentar y secar
los brotes para detener el proceso antes de que se agoten las enzimas. El color de la malta
depende de la temperatura de secado. El más oscuro se usa para la cerveza fuerte y el porteador,
el más claro para el marrón, el ámbar y la cerveza clara. Debido a un descubrimiento hace un
tiempo que la bebida resultante no se echó a perder tan rápidamente si se agregaron lúpulos,
ahora también tenemos cerveza.

Existen otras fuentes para las amilasas que catalizan la conversión de almidón en glucosa. Los
campesinos (campesinos) peruanos hacen una bebida llamada "chich" de trigo masticado, que se
seca en pequeños pasteles. Cuando se agregan agua, levadura y más trigo molido, la mezcla
resultante se fermenta a una bebida parecida a la cerveza. La enzima amilasa salival es el
catalizador para esta conversión de almidón a glucosa.

Los panaderos hacen uso de la fermentación aprovechando el gas liberado para fermentar el pan.
En el presente experimento, la levadura de panadería se usa para convertir sacarosa, azúcar de
mesa común, en etanol y dióxido de carbono con la ayuda de unas 14 enzimas como catalizadores,
además del trifosfato de adenosina (ATP),

el ion fosfato, el pirofosfato de tiamina, el ión magnesio y el di nucleótido adenina nicotinamida

reducida (NADH), todos presentes en la levadura. El proceso de fermentación, conocido como el
esquema de Emden-Meyerhof-Parnas, implica la hidrólisis de la sacarosa a glucosa y fructosa, que,
como sus fosfatos, se escinden en dos fragmentos de tres carbonos. Estos fragmentos, como sus
fosfatos, eventualmente se convierten en ácido pirúvico, que se descarboxila para dar
acetaldehído. El acetaldehído, a su vez, se reduce a etanol en la fase final. Cada paso requiere una
enzima específica como catalizador y, a menudo, un ion inorgánico: como el magnesio y, por
supuesto, el fosfato. Se liberan 31 kilocalorías de calor por mol de glucosa consumida en esta
secuencia de reacciones de anaerobia.

Esta misma secuencia de reacciones, hasta la formación de ácido pirúvico, ocurre en el cuerpo
humano en momentos de estrés cuando se necesita energía, pero no hay suficiente oxígeno
disponible para la oxidación aeróbica normal. El ácido pirúvico en estas condiciones se convierte
en ácido láctico. Es la acumulación de ácido láctico en los músculos que es en parte responsable de
la sensación de fatiga.
El primer paso en la secuencia es la formación de glucosa-6-fosfato (2) a partir de glucosa (1). La
reacción requiere trifosfato de adenosina (ATP), que se convierte en difosfato (ADP) mediante
catálisis con la enzima glucoquinasa, que requiere el ion magnesio para funcionar. Esta conversión
es una de las reacciones en las que se libera energía. En el organismo vivo esta energía puede ser
usada para hacer trabajo; en la fermentación simplemente crea calor.
En la siguiente etapa, la glucosa-6-fosfato (2) se convierte a través del enol del aldehído en
fructosa-6-fosfato (3) por la enzima fosfoglucoisomerasa. El monofosfato de fructosa (3) se
convierte en bisfosfato (4) por la acción del ATP bajo la influencia de la fosfofructoquinasa con la
liberación de más energía. Este bisfosfato (4) sufre una reacción aldólica inversa catalizada por la
aldolasa para dar fosfato de dihidroxiacetona (5) y gliceraldehído-3-fosfato (6). Los dos últimos son
interconvertidos por medio de triosfosfato isomerasa. El grupo aldehído de gliceraldehído fosfato
(6) es nicotinamida adenina dinucleótido oxidado (NAD +) en presencia de otra enzima a un grupo
carboxilo que se fosforila con fosfato inorgánico. En la siguiente reacción, el ADP se convierte en
ATP, ya que 7 pierde fosfato para dar 8. Una mutasa convierte el 3-fosfato (8) en el 2-fosfato (9).
Un enolasa convierte de 9 a 10, y una quinasa convierte 10 en ácido pirúvico (11). Una
descarboxilasa convierte el ácido pirúvico (11) en acetaldehído (12) en el proceso de
fermentación. El alcohol de levadura deshidrogenasa (YAD), una enzima bien estudiada, cataliza la
reducción de acetaldehído a etanol. El agente reductor se reduce nicotinamida adenina
dinucleótido, NADH.
Las enzimas son catalizadores notablemente eficientes, pero también son lábiles (sensibles) a
factores tales como el calor y el frío, los cambios en el pH y varios inhibidores específicos. En el
primer experimento de este capítulo, tendrá la oportunidad de observar la biosíntesis del etanol y
probar los efectos de varios agentes sobre el sistema enzimático.

Este experimento implica la fermentación de azúcar de caña ordinaria utilizando levadura de

panadería. La solución diluida resultante de etanol, después de eliminar la levadura por filtración,
se puede destilar de acuerdo con los procedimientos del Capítulo 5.
Experimento
1. Fermentación de sacarosa
Proceso macro-escala
Macerar (moler) media torta de levadura o la mitad de un sobre de levadura seca en 50 ml de
agua en un vaso de precipitados, agregar 0,35 g de fosfato de hidrógeno disódico y transferir esta
suspensión a un matraz de fondo redondo de 500 ml. Agregue una solución de 51.5 g de sacarosa
en 150 ml de agua y agite para asegurar una mezcla completa. Coloque el matraz con un tapón de
goma de un orificio que contenga un tubo de vidrio doblado que se sumerge por debajo de la
superficie de una solución acuosa saturada de hidróxido de calcio (agua de cal) en un recipiente de
6 pulgadas. Tubo de ensayo (fig. 65.2). El tubo en el agua de cal actuará como un sello para evitar
que el aire y las enzimas no deseadas entren al matraz, pero permitirán que el gas se escape.
Coloque el conjunto en un lugar cálido en su escritorio (la temperatura óptima para la reacción es
de 35 ° C) durante una semana, momento en el cual la evolución del dióxido de carbono habrá
cesado. ¿Cuál es el precipitado en el agua de cal?

Una vez completada la fermentación, añada al matraz 10 g de adyuvante de filtración de Celite

(tierra de diatomeas, polvo facial), agite vigorosamente y filtre. Use un embudo Büchner de 5,5 cm
colocado sobre un adaptador de neopreno o Filtervac sobre un matraz de filtro de 500 ml que está
conectado al aspirador de agua a través de una trampa mediante un tubo de vacío (Fig. 65.3).
Debido a que el aparato es muy pesado, sujete el matraz a un soporte de anillo. Humedezca el
papel del filtro con agua, aplique una succión suave (el suministro de agua al aspirador se activa
con toda su fuerza, la pinza de la ropa en la trampa está parcialmente cerrada) y vierta lentamente
la mezcla de reacción sobre el filtro. Lavar el matraz con unos pocos mililitros de agua de su
botella de lavado, y enjuague la torta del filtro con esta agua. El filtro auxiliar se utiliza para evitar
que los poros del papel de filtro se obstruyan con residuos celulares de la levadura.
El filtrado, que es una solución diluida de etanol contaminado con trozos de material celular y
otros compuestos orgánicos (ácido acético si no tiene cuidado), se guarda en un matraz tapado
hasta que se destila siguiendo el procedimiento descrito en el Capítulo 5.

Limpieza Debido a que la sacarosa, la levadura y el etanol son productos naturales, todas las
soluciones producidas en este experimento contienen material biodegradable y se pueden tirar
por el desagüe después de diluirlas con agua. El agua de cal se puede desechar de la misma
manera. El filtro auxiliar de Celita se puede colocar en el contenedor de residuos sólidos no
peligrosos.

Preguntas
1. Usando levadura, ¿se puede convertir la glucosa en etanol? ¿Se puede convertir la fructosa en
etanol?

2. Escriba la ecuación para la formación del precipitado formado en el tubo de ensayo que
contiene hidróxido de calcio.

3. En este experimento, ¿se podría hacer un 90% de etanol agregando más azúcar al matraz de
fermentación?