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Northern-Blot
Northern-Blot
Índice
Procedimiento
Geles
Sondas
Aplicaciones
Ventajas y desventajas
Northern blot inverso
Referencias
Véase también
Procedimiento
El procedimiento general comienza con la extracción del ARN total de una muestra de tejido
homogeneizado. El ARNm se puede aislar mediante cromatografía para retener solamente los
ARN con colas de poli(A). Las muestras de ARN se separan entonces mediante electroforesis
en gel. Dada la fragilidad de los geles y la dificultad para que las sondas penetren en la matriz,
las muestras de ARN, separadas por tamaño tras la electroforesis, se transfieren a una
membrana de nailon, bien por capilaridad o empleando un sistema de vacío.
Una membrana de nailon cargada positivamente es el soporte más eficaz para realizar la
hibridación en el northern blot ya que los ácidos nucleicos, que están cargados negativamente,
tienen una alta afinidad por estas membranas. El tampón de transferencia que se usa en el
ensayo suele contener formamida, dado que esta reduce la temperatura de interacción de las
muestras, lo que evita la utilización de altas temperaturas que podrían desnaturalizar las
moléculas de ARN. Una vez que el ARN se ha transferido a la membrana, se inmoviliza
mediante enlaces covalentes formados con la membrana, lo cual se consigue por medio de luz
ultravioleta o calor. Después del marcaje de la sonda, ésta
se hibrida con el ARN en la membrana. Las condiciones
experimentales que pueden afectar la eficiencia y
especificidad de la hibridación están determinadas por las
condiciones iónicas, de viscosidad, la presencia de ARN
bicatenario, bases desemparejadas y composición de las Los sistemas de capilaridad iónica
mismas. Finalmente, la membrana debe lavarse para se utilizan pra transferir el ARN
asegurar que la sonda se ha unido de forma específica y desde un gel de electroforesis a una
para evitar ruido de fondo en las señales emitidas por la membrana de northern blot.
misma. Estas señales pueden cuantificarse mediante
densitometría. Para crear controles y poder asegurarnos
de que no se están mostrando genes que no nos interesen se puede realizar posteriormente la
determinación empleando chips de ADN o RT-PCR.
Geles
Los patrones de expresión obtenidos nos ayudan a conocer las funciones de los genes. Desde
que el RNA se separó por su tamaño, las sondas contra el mismo pueden darnos una idea de su
tamaño, sugerir ayuste alternativo, o motivos repetidos en la secuencia. La variación en el
tamaño del producto de un gen puede además indicarnos deleciones o errores en el proceso de
transcripción. Alterando la sonda podemos conocer la secuencia e incluso determinar que
región del RNA ha sido delecionada.
Ventajas y desventajas
El análisis de la expresión génica puede realizarse por diversos métodos, como RT-PCR,
ensayos de protección de RNasa, chips de ADN, análisis seriado de expresión génica así como
el ensayo northern. Los chips de ADN son los más utilizados y son generalmente consistentes
con los datos obtenidos por el ensayo northern. No obstante, en ocasiones éste es capaz de
detectar pequeños cambios en la expresión de genes que los chips de ADN no pueden
identificar.
Esta variante es más compatible con el uso de un chip de ADN, que se ha convertido en
práctica común en la parte final de la década de 1990 y la primera del siglo XXI. Ambas
prácticas requieren la fijación de fragmentos de ADN como su hibridación con sondas de ARN
celular. De esta manera el proceso inverso, aunque inicialmente era poco común, permitió que
el northern blot evolucionara hasta tener un lugar en el desarrollo de los perfiles de expresión
génica.