APLICACIONES DE CROMATOGRAFÍA EN CAPA FINA Y

CROMATOGRÁFIA DE GASES.
Braulio Jacob Almengor Quintero1-2, Maricarmen Batista Zambrano2-2, Brenda Mabel Verga
Gonzales3-2.

Licenciatura en Química, 2Facultad de Ciencias Naturales, Exactas y Tecnología, 2Universidad

2

Nacional de Panamá

INTRODUCCIÓN

A través del estudio de la química, podemos observar que existe una gran variedad de métodos de
separación de sustancias, según nuestras necesidades, muchas de ellas son aplicadas y tienen
una gran importancia en las diferentes industrias, ya sea: Alimentaria, Farmacéutica, Manufacturas,
Medicina, entre otras. Tal es el caso de la cromatografía, un método permite la separación,
identificación y determinación de los componentes químicos en mezclas complejas. Ningún otro
método de separación es tan potente, efectivo y de aplicación tan general.
Se trata de procesos que abarcan varias técnicas separativas, basadas en diferentes aspectos
químicos.

Con el desarrollo de la tecnología, las técnicas cromatografías se diversificaron y mejoraron

sensiblemente su capacidad para resolver mezclas de distinta naturaleza, por lo que actualmente
existen una gran cantidad de cromatografías que aun teniendo la misma base común, poseen
ciertas diferencias en donde la industria las aprovecha acorde a sus propósitos. Específicamente
trataremos la cromatografía de capa fina (TLC), que es aspectos generales, es una técnica
cromatografía que utiliza una placa inmersa verticalmente en una fase móvil y la cromatografía
de gases, en donde la muestra se volatiliza y se inyecta en la cabeza de una columna
cromatografíca. Cada una de ellas con aplicaciones importantes y de gran impacto en la sociedad
actual.

 CROMATOGRÁFIA DE CAPA FINA

La cromatografía de capa fina presenta los pacientes o consumidores, a los cuales

varias aplicaciones como la purificación, son aplicados, debido a que pueden generar
aislamientos e identificación de productos una serie de complicaciones médicas e
naturales, separación de metabolitos inclusive en el peor de los casos la muerte.
bioquímicos y la identificación de Debido a esta problemática las industrias
multicomponentes en los conservantes, farmacéuticas han implantado técnicas
edulcorantes y diversos productos cromatografíca para el control de calidad de
cosméticos, pero principalmente aplicaciones fármacos esenciales, un ejemplo claro es la
orientadas a la industria farmacéutica y a la pirazinamida, un fármaco utilizado para el
alimenticia, tales como: control en el tratamiento de tuberculosis,
consiste de la siguiente forma:
Industria farmacéutica:
-Determinación de pirazinamida
La falsificación de productos farmacéuticos y
la proliferación de medicamentos de baja Inicialmente se da una verificación de la
calidad representan un problema muy identidad y la cantidad a través del ensayo
frecuente en la sociedad actual, ya que, con cromatografía en capa fin, Se extrae de
representa un riesgo latente para la tabletas y cápsulas con metanol y se
población por los efectos que tienen sobre determina con cromatografía en capa fina
(CCF) con referencia a un estándar usando el pistilo. Se desocupa
secundario. En combinaciones con otros cuidadosamente el contenido del papel
medicamentos antituberculosos, todos los aluminio en un frasco de vidrio de laboratorio
componentes pueden ser extraídos y de 100 ml y se enjuagan todos los residuos
analizados simultáneamente. con 50 ml de metanol usando una pipeta
graduada. Se cierra la botella y se agita por
Para esto se utiliza equipos y reactivos, tales unos tres minutos, hasta que se haya
como: disuelto la mayor parte de los sólidos. Se
 Pistilo deja reposar la solución por unos cinco
 Papel aluminio minutos más, hasta que los residuos no
 Embudo disueltos se asienten en el fondo del frasco.
 Cinta adhesiva La solución obtenida debe contener 10 mg
 Rotulador del agente activo por ml y se debe rotular
 Lápiz “Solución madre del estándar de
 Viales de 10 ml pirazinamida”. Para cada prueba se
 Juego de pipetas graduadas (1 a 25 preparará una nueva solución. Se continúa
ml) trabajando con el líquido turbio sobrenadante
 Juego de frascos de vidrio de o la dilución clara obtenida.
laboratorio (25 a 100 ml) 2-PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN
 Placas Merck CCF de aluminio con ESTÁNDAR DE TRABAJO AL 100%
recubrimiento de (LÍMITE SUPERIOR)
 gel de sílice 60 F 254, de 5 x 10 cm
 Microcapilares de vidrio de 2 μl de Se pipetea 1 ml de la solución madre del
capacidad estándar a un vial de 10 ml y se añaden 7 ml
 Cámara de revelado para CCF de metanol. Se tapa y agita el vial. La
(frasco de 500 ml) solución obtenida debe contener 1.25 mg del
 Plancha caliente agente activo por ml y se debe rotular
 Papel de filtro “Solución estándar de trabajo de
 Tijeras pirazinamida al 100%”. Esta solución
 Pinza estándar representa un fármaco de buena
 Luz ultravioleta de 254 nm calidad con un contenido de 100% de
 Cámara de manchado con yodo pirazinamida.
 Metanol
 Tolueno 3-PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN
 Hidróxido de amonio (solución al ESTÁNDAR DE TRABAJO AL 80% (LÍMITE
25%) INFERIOR)
 Estándar secundario de referencia, p. Se pipetea 1 ml de la solución madre del
ej. Tabletas de pirazinamida de 500 estándar a un vial de 10 ml y se añaden 9 ml
mg de metanol. Se tapa y agita bien el vial. La
solución obtenida debe contener 1.0 mg del
Los procedimientos detallados, son los agente activo por ml y se debe rotular
siguientes: “Solución estándar de trabajo de
pirazinamida al 80%”. Esta solución estándar
1-PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN representa un producto farmacológico de
MADRE DEL ESTÁNDAR: baja calidad y bajo contenido de pirazinamida
de solo 80% de lo indicado en la etiqueta del
La preparación de la solución madre del producto. En la investigación actual, este
estándar requiere de un producto auténtico nivel de contenido de fármaco representa el
usado como referencia, por ejemplo, tabletas límite de concentración inferior aceptable de
con contenido de 500 mg de pirazinamida. un determinado producto.
Se envuelve la tableta usada como referencia
en papel aluminio y se reduce a polvo fino
4-PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN
MADRE DE LA MUESTRA DE UN
PRODUCTO QUE DICE CONTENER 100
MG DE PIRAZINAMIDA POR UNIDAD
Se toma una tableta o cápsula completa del
producto farmacológico de las muestras
recogidas durante el trabajo de campo. Como
se indicó anteriormente, las tabletas se
envuelven en papel aluminio y se trituran
hasta obtener un polvo fino. Se transfiere
todo el polvo obtenido a un frasco de
laboratorio de 25 ml. Para el caso de las
cápsulas, se desocupa primero el polvo
contenido en la cápsula de muestra, seguido
de la tapa y el cuerpo, directamente en el
frasco. Para la extracción se añaden 10 ml
de metanol usando una pipeta graduada. Se
tapa el frasco y se agita por unos tres
minutos, hasta que la mayor parte de los
sólidos se haya disuelto. Se deja reposar la
solución por unos cinco minutos más, hasta
que los residuos que no se hayan disuelto
queden asentados en el fondo del frasco.
• 300 MG DE PIRAZINAMIDA POR
UNIDAD
Se toma una tableta o cápsula completa y se
extrae el polvo obtenido con 30 ml de
metanol usando una pipeta graduada y un
frasco de laboratorio de 40 ml para contener
la muestra. Se continúa el procedimiento
como se ha descrito arriba.
• 400 MG DE PIRAZINAMIDA POR
UNIDAD
Se toma una tableta o cápsula completa y se
extrae el polvo obtenido con 40 ml de
metanol usando una pipeta graduada y un
frasco de laboratorio de 100 ml para contener
la muestra. Se continúa el procedimiento
como se ha descrito arriba.
• 500 MG DE PIRAZINAMIDA POR
UNIDAD
Se toma una tableta o cápsula completa y se
extrae el polvo obtenido con 50 ml de
metanol usando una pipeta graduada y un
frasco de laboratorio de 100 ml para contener
la muestra. Se continúa el procedimiento
como se ha descrito arriba.
5-PREPARACIÓN DE LA SOLUCIÓN DE
TRABAJO DE LA MUESTRA
Se pipetea 1 ml de la solución madre de la
muestra a un vial de 10 ml y se añaden 7 ml
de metanol. Se tapa y agita bien el vial,
rotulándolo “Solución de trabajo de la
muestra de pirazinamida”. La concentración
esperada de pirazinamida en esta solución
de trabajo deberá ser de 1.25 mg por ml y
corresponder a la concentración de
pirazinamida de la solución estándar de
trabajo superior elaborada arriba.
6-APLICACIÓN DE LOS PUNTOS
Se traza una línea de origen paralela a una
distancia de 1.5 cm del extremo inferior de la
placa cromatográfica y se aplican con las
pipetas microcapilares suministradas 2
microlitros (μl) de la solución de ensayo y del
estándar como se indica en la fotografía.
Hasta cinco puntos se pueden aplicar en la
placa cromatográfica. Se comprueba la
uniformidad de los puntos usando luz UV de
254 nm. Todos los puntos deben tener forma
circular y ser aplicados equidistantes sobre la
línea de origen. Aunque su intensidad puede
diferir, su diámetro no. Mientras que la
diferencia en la intensidad se debe a la
diferente cantidad de los residuos de
excipientes o la cantidad de agente activo
contenidos en las tabletas o de las cápsulas,
una diferencia de diámetro resulta de la
aplicación incorrecta. Se debe repetir el paso,
si no se logra una aplicación homogénea la
primera vez.
RESULTADOS
REVELADO DE LA PLACA
CROMATOGRÁFICA
Se pipetean 12 ml de metanol, 10 ml de
tolueno y 0.5 ml de solución concentrada de
amoníaco al frasco usado como cámara de
revelado. Se cubren las paredes del frasco
con papel de filtro y se espera por unos 15
minutos para asegurar que el interior del
frasco se sature con los vapores de solvente.
Cuidadosamente se coloca la placa
cromatográfica cargada en el frasco. Se
cierra el frasco y se revela la placa hasta que
el frente del solvente haya impregnado unas
tres cuartas partes de la longitud de la placa,
siendo el tiempo de revelado de unos 20
minutos. Se retira la placa del frasco, se
marca la línea del frente del solvente y se
permite la evaporación del excedente de
solvente, usando la plancha caliente de ser
necesario.
-DETECCIÓN DE LOS AGENTES ACTIVOS
Se seca el resto de la fase móvil y se
observa la placa cromatográfica bajo luz
ultravioleta de 254 nm usando la lámpara a
pilas suministrada. Se utiliza este método
tanto para el proceso de identificación como
para la verificación cuantitativa. Para la
verificación adicional de la identidad y la
cantidad de pirazinamida se observa la placa
a la luz del día tras el manchado con yodo.
En caso de que haya etambutol presente, se
mancha la placa cromatográfica con
ninhidrina para su detección.
Figura1: Placa cromatografíca vista bajo
la luz ultravioleta de 254 NM
Recorrido No. 1: Estándar superior
representando 100% de pirazinamida,
isoniazida y rifampicina
Recorrido No. 2: Fármaco combinado de
buena calidad
Recorrido No. 3: Fármaco combinado de baja
calidad
Recorrido No. 4: Estándar inferior
representando 80% de
Pirazinamida, isoniazida y rifampicina.
OBSERVACIONES:
• A 254 nm: Un punto azul-violeta intenso a
una distancia de recorrido de aprox. 0.56
indica la presencia de pirazinamida en la
solución de ensayo. En formulaciones con
isoniazida y rifampicina se hacen visibles dos
puntos principales más, por debajo y encima
del punto de pirazinamida a una distancia de
recorrido de 0.45 y 0.71, respectivamente.
Puntos fuertes adicionales generados por la
solución de ensayo indican la presencia de
otros agentes activos o una degradación de
la pirazinamida, siendo este último caso más
probable al verse asociados a un punto
principal más pequeño. Los agentes
auxiliares incorporados a las diferentes
formulaciones de las tabletas y cápsulas
pueden generar algunos puntos más pálidos
cerca a o sobre la línea de origen. Los
productos combinados que contengan
etambutol, requerirán del manchado con
solución de ninhidrina, ya que este fármaco
no puede ser detectado con luz ultravioleta
de longitud de onda alguna.
•A LA LUZ DEL DÍA TRAS EL MANCHADO
CON YODO:
Al exponer la placa cromatográfica a los
vapores de yodo, todos los puntos de
pirazinamida detectados bajo la luz
ultravioleta se irán tornando naranja-marrón.
Se continúa observando la placa conforme se
vaya evaporando el yodo. Los puntos
generados por productos de baja calidad
desaparecerán primero gradualmente,
seguidos por los puntos del fármaco de
referencia con un contenido de agente activo
de 80% y 100%, respectivamente.
RESULTADOS Y MEDIDAS A TOMAR:
El punto de pirazinamida en el cromatograma
obtenido con la solución de ensayo debe
corresponder en términos de color, tamaño,
intensidad, forma y distancia de recorrido al
cromatograma obtenido con las soluciones
estándar alta y baja. Este resultado debe
obtenerse con cada método de detección. Si
ese no es el caso, se debe repetir la prueba
desde el principio con una segunda muestra.
El lote es rechazado, si el contenido del
agente activo no puede verificarse a la
tercera prueba. Para obtener una segunda
opinión, se refieren muestras adicionales a
un laboratorio profesional de control de
calidad de fármacos. Las muestras se
retienen y el lote se pone en cuarentena
hasta que se haya tomado una decisión final
respecto a liberar o rechazar el producto.
INTRUSTRIA ALIMENTICIA
En esta industria principalmente se da la
identificación de aminoácidos libres por
cromatografía de capa fina en jugo fresco de
naranja (Citrus sinensis L. Osbeck) variedad
“Valencia”
El jugo de naranja como todos los jugos de
frutas, es una bebida refrescante, fuente
importante de vitaminas, minerales y
azúcares naturales, ingerido principalmente
por niños.
El jugo de naranja al igual que otros jugos y
productos alimenticios altamente apreciados,
es blanco probable de adulteración y fraude.
Entre los principales procedimientos
fraudulentos con fines de lucro más frecuente
aplicado solo o en combinación están:
 Reducción de contenido de fruta
incorporando agua, azúcares sin
declarar, ácidos, lavado de pulpa,
mezclas artificiales o sustitución
parcial del jugo o de la fruta.
Desde el punto de vista de la estabilidad en
el almacenamiento de los jugos de naranjas
procesados, los aminoácidos intervienen en
las reacciones de oscurecimiento no
enzimático y no deseables que suceden
durante su almacenamiento a temperatura
ambiental. Los resultados de Del Castillo,
Corzo et al. (1998) parecen indicar que los
cambios en la composición de aminoácidos y
en los compuestos de Amadori, pueden ser
índices adecuados para establecer las
condiciones de almacenamiento del jugo de
naranja procesado antes que se evidencie el
cambio de color.
A través de cromatografía de capa fina se
termina la calidad de un producto de
constante consumo por niños e incluso
adultos en general.
MATERIALES Y MÉTODOS
Materia prima y caracterización fisicoquímica
Se adquirió en 2 puntos diferentes del
mercado local de la ciudad de Caracas 2
lotes de 10 kg cada uno de naranjas (Citrus
sinensis L. Osbeck var. Valencia) Se
seleccionaron por tamaño, forma, color del
endocarpio, y atributos de la corteza, gruesa,
dura y coriácea. Los lotes se trasladaron al
Laboratorio de Análisis de Alimentos del
Instituto de Ciencia y 254 Tecnología de
Alimentos (ICTA), Facultad de Ciencias de la
Universidad Central de Venezuela. Las frutas
se lavaron con agua de chorro a presión, se
secaron y se cortaron en mitades
transversales. Se verificaron las
características de la variedad: forma, color
del endocarpio, número de gajos y de
semillas, y porcentaje de jugo. Se obtuvo el
jugo de 4 kg de naranjas (tamaño mínimo de
la muestra de ensayo, directamente por
extracción mecánica con un extractor de
jugos cítricos, casero. Se determinó el
porcentaje de jugo de cada fruto midiendo el
volumen de jugo extraído en un cilindro
graduado. Se contó o extraído en un cilindro
graduado. Se contó el número de semillas
por fruto. Se midió el pH utilizando un
potenciómetro marca HANNA, modelo HI
9321. Se determinaron los parámetros:
sólidos solubles, ácido ascórbico, acidez total
titulable (ATT), nitrógeno de aminoácidos,
azúcares totales y reductores, sacarosa por
diferencia entre los azúcares totales y los
reductores.
•Separación de la fracción de aminoácidos
libres del jugo de naranja recién extraído
El jugo se centrifugó a 960 g (15 min) -1 en
una centrífuga Damon/IEC Division, modelo
CRU-5000. Se recuperó el sobrenadante.
Acondicionamiento del sobrenadante.
Desproteinización: treinta mL del
sobrenadante se homogeneizaron en un
vórtex por 3 s con igual volumen de etanol 95
% (v/v), se dejó reposar 10 s y se centrifugó
nuevamente a 900 g (15 min)-1 en una
centrífuga de mesa marca BHG, modelo
Fixette (Hermle Labortechnik GmbH,
Wehingen, Alemania). Se recuperó el
sobrenadante y se le ajustó el pH a 1,7 para
que los aminoácidos libres en solución se
encontraran en forma catiónica,
considerando que el pK1 del aminoácido
histidina (1,82) es el menor de los
aminoácidos proteicos.
Acondicionamiento y activación de la resina:
se hicieron lavados consecutivos de la resina
con agua destilada hasta obtener pH igual al
del agua destilada de lavado (papel tornasol).
Se continuó el lavado con etanol al 80 %
(v/v), seguido de lavados con agua destilada,
hasta obtener eluatos incoloros. Se activó la
columna añadiendo 200 mL de HCl 2 M con
agitación lenta por 1 h. Se desechó el exceso
del HCl y se lavó con agua destilada hasta
obtener el pH igual al del agua destilada de
lavado (papel tornasol). Todos los lavados se
realizaron con agitación magnética. La resina
así acondicionada y activada se empacó en
la columna de vidrio.
Cromatografía de intercambio iónico: para
eliminar del sobrenadante acondicionado las
impurezas que pudiesen interferir con la capa
fina, se pasó un volumen de 30 mL de este
por la resina de intercambio iónico,
poliestireno Dowex® 50WX4-200R, activada
previamente en forma de H + con 200 mL de
HCl 2 M, empacada en una columna de vidrio
(6 x 1,7 cm), cuidando no perturbar el lecho
de la resina al colocar la alícuota. Luego se
lavó la resina con agua destilada hasta que el
pH del eluato fuese igual al del agua
destilada de lavado.
Elución de los aminoácidos: Los aminoácidos
retenidos en la columna fueron desplazados
con 60 mL de NH4OH 1 M. Seguido por igual
volumen de agua destilada. El volumen
recogido se evaporó a 40 ºC a vacío hasta
sequedad. El residuo seco se suspendió en
2,5 mL de una solución metanol: agua 50:50
(v/v) a pH 1,7. Se conservó en refrigeración
(4 ºC) hasta su aplicación en los
cromatóforos. Preparación de la solución de
aminoácidos patrones Se prepararon las
soluciones de los siguientes 18 aminoácidos
patrones, todos de 99 % de pureza,
suspendiendo 1 mg (0,99) de cada
aminoácido/2,5 mL de solución metanol:agua
(50:50, v/v) a pH 1,7: L(+)-ácido glutámico
(Fisher Scientific); L-ácido aspártico, L-
alanina, DL-fenilalanina, L(+)-glicina, lisina
monoclorhidrato y L-tirosina (Merck); L(+)-
leucina, L(-)-treonina y L(+)-valina (Riedel-de
Haën); L-arginina y L-cisteína clorhidrato
anhidro (Scharlau); L-prolina, L-serina y
DLtriptófano (Sigma); monohidrato de
Lasparagina, L-histidina y DL-metionina
(Prolabo). Estimándose cada solución de
aminoácido patrón en 39,6 % (m/v), salvo las
soluciones de lisina 31,69 % y de cisteína
30,44 %. Se guardaron en refrigeración (4
ºC) hasta el momento de su aplicación en los
cromatofolios.
Preparación de las combinaciones de
solventes y el revelador de aminoácidos
Solvente I: cloroformo: metanol: amoníaco 25
% (v/v) (40:40:20).
Solvente II: fenol: agua 80:20 (m/v). A un
recipiente de 500 g de fenol, nuevo, se le
añadió lentamente 125 mL de agua destilada.
Se cerró y se dejó en reposo toda la noche.
La solución es estable indefinidamente en
envase opaco a la luz.
Revelador de aminoácidos: solución de
ninhidrina al 0,2 % (m/v): 0,2000 g de
ninhidrina en 95 mL de n-butanol. Se aforó a
100 mL con ácido Medina-Bracamonte y
Gallo-Gagliotta 255 acético al 10 % (v/v) (5
mL aproximadamente). Se conserva
indefinidamente en refrigeración. Límite de
detección de la ninhidrina: de 0,1 a 1 μg del
aminoácido (Domínguez-S., 1982). En 10 μL
de cada una de las soluciones de aminoácido
de referencia hay 3,96 μg del aminoácido
correspondiente, aproximadamente el
cuádruple del límite superior del intervalo de
detección de la ninhidrina, salvo lisina (3,2
μg) y cisteína (3,0 μg), que lo triplican.
PREPARACIÓN DE CROMATROGRÁFIA
DE CAPA FINA.
El límite de detección de la cromatografía de
capa fina se ubica entre 0,01 y 0,001 μmol
del analito; y 0,1 μmol es suficiente para
identificaciones rápidas (Piez y Saroff, 1961).
Los μg de glicina (MM: 75 g mol-1) y de
triptófano (MM: 204 g mol-1) que
corresponden al límite de detección (0,001
μmol) son 7,5 x 10-2 μg y 20,4 x 10-2 μg,
respectivamente. En las alícuotas de 10 y 5
μl de cada una de las soluciones de
aminoácidos de referencia se supera el límite
inferior para la detección de la glicina (3,96 y
1,98 μg) en cromatografía de capa fina.
Preparación de las cubetas cromatográficas
de vidrio (28 x 13 x 10 cm):
Se vertieron 50 mL de cada una de las
soluciones de solventes en una cubeta
destinada a esa solución. En el caso de la
combinación de solventes II, fenol: agua
80:20 (m/v), una vez decantados los 50 mL
de la solución, en la cubeta correspondiente,
se le añadió 0,25 mL de NH3 0,880 % (v/v).
Las cubetas se taparon y se esperó la
saturación de la atmósfera antes de introducir
en ellas los cromatofolios correspondientes a
la corrida cromatográfica con esa
combinación de solventes.
Preparación de las cromatofolios de sílica gel
60 (Merck) 20 x 20 cm, espesor 0,25 mm, sin
indicador:
No se activaron por calor, por lo cual el gel
de sílice contiene humedad suficiente para
que el mecanismo de reparto de los
aminoácidos sea similar al de la
cromatografía en papel.
Cromatografía monodireccional de las
muestras de jugos y de las soluciones de los
18 aminoácidos patrones: se aplicó en un
extremo, de cada uno de 4 cromatofolios,
una muestra de 10 μL del residuo seco
procedente del jugo de naranja recién
extraído y suspendido en metanol: agua. En
cada par de cromatofolios, a continuación de
la muestra del jugo se distribuyeron, además,
muestras de 10 μL de cada una de las
soluciones de los 9 aminoácidos de
referencia y 9 en la otra. Dos cromatofolios
para la cromatografía monodireccional I (con
la combinación de solventes I), y 2 para la
cromatografía monodireccional II (con la
combinación de solventes II).
Cromatografía bidireccional: se aplicó, en un
extremo de cada uno de 2 cromatofolios, una
muestra de 5 μL del residuo seco procedente
de la muestra del jugo de naranja recién
extraído y suspendido en metanol:agua. Se
aplicaron los volúmenes de muestras con
una micropipeta digital Calibra® 822,
capacidad 2-20 µL (Socorex Isba, S. A.,
Ecublens, Suiza). Se secaron con corriente
de aire caliente, y una vez secos, se
colocaron 2 cromatofolios con las superficies
de trabajo contrapuestas para la corrida
monodireccional en la cubeta con la
combinación de solventes I, y 2 en la cubeta
con la combinación de solventes II. Se dejó
ascender el solvente de ambas cubetas
sobre los cromatofolios, hasta que el frente
de este alcanzó una distancia de 150 mm en
cada una. Se sacaron los cromatofolios y se
dejaron expuestos al aire bajo campana y a
temperatura ambiental hasta evaporación
completa del solvente. Se revelaron los
aminoácidos.
Corrida bidireccional: se colocaron 2
cromatofolios, ya preparados, en la cubeta
con la combinación de solventes I, con las
superficies de trabajo contrapuestas. Una vez
el frente recorrió los 150 mm, se sacaron, se
dejó evaporar el solvente completamente
bajo campana, se giró cada placa 90º en el
sentido de las agujas del reloj y se colocaron
en la cubeta para el desarrollo con la
combinación de solventes II. Una vez el
frente recorrió los 150 mm, se sacaron y se
dejó evaporar el solvente completamente
bajo campana. Se revelaron los aminoácidos.
REVELADO DE AMINOÁCIDOS.
Se roció cada cromatofolio con el revelador y
se dejó evaporar el solvente, en corriente de
aire, bajo campana y a temperatura
ambiental. Luego se colocaron las láminas en
estufa a 100 ºC x 5 min hasta el desarrollo
del color azul característico de la reacción de
condensación entre la ninhidrina y cada
aminoácido. Si la reacción ocurrió entre el
revelador y los α-aminoácidos el color se
desarrolla en frío, mientras que los
aminoácidos heterocíclicos no aromáticos y
los alifáticos, desarrollan el color en caliente.
Identificación de los aminoácidos separados
en la capa fina Una vez revelados los
aminoácidos, se delineó el borde de cada
uno de ellos y se marcó el centro respectivo
con lápiz de grafito. Se obtuvo el Factor de
Retardo (Rf) para cada reacción revelada
midiendo la distancia recorrida por cada
aminoácido en cada combinación de
solventes, desde el punto de origen en la
línea base del cromatofolio, donde se sembró
la muestra, y el centro de cada una de las
reacciones reveladas. Luego se calculó el
cociente de cada una de las distancias con
respecto al recorrido del frente del solvente
(150 mm). Se expresa en porcentaje del
desplazamiento (Rf %). Ese cociente es
característico para cada uno de los
aminoácidos en iguales condiciones de
trabajo. Con la intención de controlar algunas
de las variables que afectan al Factor de
Retención (Rf): humedad de las fases móvil y
estacionaria, temperatura, grado de
saturación de la cámara de desarrollo con los
Resultados de la cromatografía en Capa Fina
figura 1.- Cromatografía monodireccional del jugo de
naranja Valencia extraído del lote 1, y aminoácidos
patrones en la combinación de solventes II
(fenol:agua) 80:20
cromatografía monodireccional del jugo de
naranja del lote 1 en la combinación de
solventes II (fenol:agua), por duplicado, y en
ambos cromatofolios se distribuyeron los 18
vapores de la fase móvil, se obtuvo el Factor
de Retención Relativo (Rx) para cada
aminoácido libre revelado con respecto al del
aminoácido de referencia asociado, o
cociente entre las distancias recorridas por el
aminoácido a identificar y el patrón asociado
en igualdad de condiciones. Si bien no es
posible un dominio absoluto de las mismas
se minimiza el efecto. La identificación se
realizó comparando: 1º, los Rf % de cada una
de las reacciones positivas a la ninhidrina
desarrollada a partir de cada muestra de
jugo, con los Rf % obtenidos de las muestras
de las soluciones patrones de cada uno de
los 18 aminoácidos. 2º, superponiendo la
reacción a identificar con el patrón asociado.
3º, considerando el color de las reacciones
desarrolladas frente a la ninhidrina por los
aminoácidos libres en cada una de las
muestras con el color desarrollado por los
aminoácidos patrones en igualdad de
condiciones. 4º, considerando el Rx entre el
aminoácido libre revelado con respecto al del
aminoácido de referencia asociado. 5º,
considerando las ubicaciones relativas de los
aminoácidos revelados.
figura 2- Cromatografía monodireccional del jugo de
naranja Valencia extraído del lote 1, y 2
aminoácidos de referencia. Se aislaron 10
reacciones positivas a la ninhidrina.
La cromatografía bidireccional presenta
aminoácidos patrones como los separados
en ambos lotes de jugo de naranja
desarrollaron color rosado azulado salvo los
aminoácidos, prolina (amarillo) y asparagina
(marrón).
Los aminoácidos predominantes en el jugo
del lote 1 en orden decreciente fueron 8:
prolina, VIII, ácido glutámico, serina, lisina,
asparagina, alanina, triptófano y/o
fenilalanina. Mientras que los aminoácidos
predominantes en el jugo del lote 2 fueron 9:
prolina y ácido aspártico en proporción casi
iguales, le siguen en orden decreciente, el
aminoácido VI, alanina, glicina y/o histidina,
serina, triptófano y/o fenilalanina, metionina y
valina. Todos estos aminoácidos fueron
identificados en la naranja Valencia de
California, Estados Unidos, en donde
además sobresalieron alanina, asparagina, el
ácido aspártico, glutámico y - aminobutírico,
serina y arginina
 CROMATOGRÁFIA DE GASES
La cromatografía de gases es utilizada
en una gran diversidad de sectores que
se pueden agrupar en las siguientes
categorías: alimentario y farmacéutico,
petróleo y químicos, ambiental y médico-
biológica.
PETRÓLEO Y QUIMÍCOS
ANÁLISIS DE HIDROCARBUROS DE
PETRÓLEO EN AGUA MEDIANTE
CROMATOGRAFÍA DE GASES
En la actividad petrolera, el manejo diario de
hidrocarburos, en algunos casos conlleva a la
contaminación del agua cuando tanques de
reserva, oleoductos y diversas instalaciones
sufren pérdidas por fallas o descuidos
humanos estos líquidos por el relieve de la
topografía migran hacia cursos de agua,
suelo, subsuelo, y hacia aguas subterráneas.
METODOLOGÍA:
La metodología está basada en el Método
de la Agencia de Protección del Medio
Ambiente (EPA) 8015B y el Método EPA
3015. La validación del método se realizó con
cinco estándares conocidos de 500ppm,
1000ppm, 1500ppm, 2000ppm, y 3000ppm,
el análisis de muestras fortificadas a tres
niveles de concentración (750ppm, 1000ppm
y 1860ppm), y el análisis de muestras reales
tomadas del Río Santa Clara, en un intervalo
de trabajo de 500ppm a 3000ppm.
RECOLECCIÓN DE LA MUESTRA:
La muestra de agua se recolecta en botellas
color ambar de 1L con tapa rosca, dejando
como mínimo dos centímetros de aire, y
colocando papel parafilm alrededor de la tapa
para evitar contaminación o derrame de la
muestra. Para las muestras tomadas en el
Río Santa Clara es importante conocer que el
agua debe ser tomada del agua superficial,
ya que si se introduce la botella al fondo del
río puede darse la presencia de una cantidad
excesiva de sedimentos.
PROCESO DE EXTRACCIÓN:
Para la extracción de hidrocarburos totales
de petróleo en matriz acuosa se utilizó la
extracción líquido-líquido. Se realizaron
extracciones de las muestras fortificadas a
tres diferentes concentraciones, y se
realizaron ocho extracciones a las muestras
tomadas del Río Santa Clara.
Proceso de Purificación o Clean Up
El proceso de purificación se debe hacer
a muestras demasiado turbias, caso
contrario se puede omitir este paso.
PROCESO DE CONTRADO Y
ALMACENAMIENTO
El extracto se concentra hasta
aproximadamente 5mL y luego se pasa
al Kuderna-Danish dónde se concentra a
1mL, luego se coloca en un vial para
cromatografía. Las muestras deben ser
preservadas en refrigeración a 4ºC por
40 días.
CUANTIFICACIÓN MEDIANTE
CROMATOGRAFÍA.
Los hidrocarburos totales de petróleo son
cuantificados mediante cromatografía
gaseosa con detector FID, inyectando un
1µL de muestra
CONDICIONES INSTRUMENTALES PARA
CUANTIFICACIÓN:
Validación del Método Para la validación
es requerida los siguientes pasos:
• Preparación de soluciones Fortificadas
• Preparación de Extractos (tres
concentraciones) y blancos.
• Cuantificación, para la validación del
método se inyecta cada estándar por
cinco días incluido un blanco. Para las
extracciones se realiza la inyección de
cada muestra por triplicado por tres días
incluido un blanco analítico. La inyección
es de 1µL
• Determinación y cálculo de parámetros
estadísticos
• Linealidad, función respuesta.
• Precisión (Repetibilidad y
Reproducibilidad), tres repeticiones en
tres días diferentes.
• Límite de detección, obtenida mediante
el uso de los blancos de las mediciones •
Límite de cuantificación, obtenida
El método de extracción líquido-líquido, es
eficaz, rápido y reproducible además de la
utilización en él de solventes de fácil
disponibilidad como el diclorometano. Se
obtuvo un promedio de 88% en los valores
de recuperación en las muestras fortificadas,
el mismo que entra dentro del rango de
aceptación que es del 70% al 110%. En las
MEDICIONES BIOLOGÍCAS
mediante el uso de los blancos de las
mediciones.
• Intervalo de trabajo/rango, se determina
mediante el límite de cuantificación como
valor inferior.
• Incertidumbre, Se calcula del método y
soluciones.
• Porcentaje de recuperación, se aceptan
valores entre el 90 – 100%
RESULTADOS
Los resultados del análisis de
hidrocarburos de petróleo se presentan
en las siguientes tablas.
muestras tomadas del Rio Santa Clara
después de la extracción y la cuantificación
no se encontró la presencia de hidrocarburos
de petróleo, basados en los límites
permisibles del TULAS y el RAHOAE, estos
resultados son de la toma de muestra a
orillas del río, lo que impide tener el 100% de
certeza.
Determinación por cromatografía de
gases, el valor del cociente: etanol en
humor vitreo/sangre en cadáveres
necropsiados de la Morgue del Cusco
El análisis del humor vítreo (HV) es útil
para corroborar en la necropsia la
concentración de etanol en sangre (CES)
y esto, ayuda para distinguir la
intoxicación ante-mortem de la síntesis
postmortem de alcohol. El Humor Vítreo,
puede servir también como una muestra
post mortem alternativa para el análisis
de alcohol si por alguna razón la sangre
no está disponible o está contaminada.
Toma de muestra
Se tomaron postmortem, muestras de
sangre y de humor vítreo de cada uno de
los 45 sujetos necropsiados durante el
2013 en la morgue central del Cusco. El
humor vítreo fue obtenido de un ojo, por
punción perpendicular usando una aguja
hipodérmica estéril (21Gx40 mm) y una
jeringa estéril de un solo uso (10 ml). El
fluido se transfirió después a un vial de
vidrio tapa rosca esterilizado con fluoruro
de sodio (NaF) al 0.1%. Los volúmenes
recogidos oscilaron entre 2.0 y 3.5 ml.
Las muestras recogidas de esta forma
son incoloras y transparentes. La sangre
fue tomada de la vena femoral
(aproximadamente 5 ml) con la misma
metodología usada para el humor vítreo.
Todas las muestras recogidas fueron
almacenadas a 4°C hasta el momento
del análisis, período que no superó los 2
días en ningún caso
Determinación de etanol
El análisis de las muestras fue realizado
mediante cromatografía de gases (7,8).
Condiciones Cromatográficas: Las
de 4,0 G/L de etanol, se aceptan valores
con un máximo de 4,13 G/L y/o una
desviación standard de 0,0450. Figura 1.
condiciones típicas de operación para la
cromatografía de gases, fueron:
a) Flujo de gas Helio como gas portador
15 ml/min
b) Flujo de gas Hidrógeno al detector 30
ml/min.
c) Flujo de gas aire al detector 210
ml/min.
d) Temperatura del inyector 80°C
e) Temperatura del detector variable
240°C
f) Temperatura del horno 125 - 240 °C
g) Tiempo de incubación 10 minutos h)
Volumen de inyección 0.1mL
i) Velocidad de inyección 15 mL/min
Los análisis fueron realizados por única
vez y mediante el análisis de regresión
lineal simple se estableció la relación
entre la concentración de etanol en
humor vítreo (variable independiente
CEHV) y la concentración de etanol en
sangre (variable dependiente CES). Se
calculó el intervalo de predicción para la
estimación de CES a partir de una
medida de CEHV.
Resultados:
Para los valores de 0.4 G/L de etanol, se
aceptan valores con un máximo de 0,41
G/L y/o una desviación standard de
0,0043. Para los valores de 2,0 G/L de
etanol, se aceptan valores con un
máximo de 2,0550 G/L y/o una
desviación standard de 0,0300. Para los
valores
El valor absoluto del coeficiente de
correlación, oscilan entre 0 y 1. Cuanto más
cerca de 1 mayor es la correlación, y menor
cuanto más cerca de cero. En este caso el
coeficiente de correlación fue de 0.990,
entonces la relación entre el dosaje etílico en
alcohol y dosaje etílico en sangre es
excelente. R2 = 0,980 indica que el 98% de la
variabilidad en concentración de alcohol en
Tabla 1
La ecuación de regresión lineal nos indica:
• La variabilidad de dosaje etílico en sangre
en función a la variabilidad de dosaje etílico
en humor vítreo.
• Por cada unidad que aumente el dosaje
etílico en humor vítreo, el dosaje etílico en
sangre aumentara en 0.912.
• El coeficiente de determinación, (R
cuadrado), es 0.98, cercano a uno (01),
quiere decir que la regresión lineal se ajusta
adecuadamente a los datos reales. Por lo
tanto, es un modelo confiable para hacer
predicciones o pronosticar, valores de la
concentración de alcohol en sangre. Tabla 2.
Cociente etanol en humor vitreo/etanol en
sangre: Se tiene la ecuación lineal, hallada
con el método de regresión lineal, por medio
de esta se determinará el cociente etanol en
humor vítreo/ etanol en sangre. Por lo tanto,
el cociente etanol en humor vítreo/ sangre,
en la ciudad del Cusco fue de: 1.09
Tabla 2
sangre es explicada por la variación de la
concentración de alcohol en humor vítreo, y
el 2 % restante se explicaría por otras
variables. El error típico de la estimación es
una medida de la variabilidad de los datos
alrededor de la recta de regresión o
desajuste experimental del modelo lineal, el
cual en la investigación es muy significativo.
DISCUSIÓN
Asumiendo que el alcohol etílico, una vez
absorbido, se distribuye por el organismo de
acuerdo con su contenido en agua, es
posible determinar la relación teórica entre
las concentraciones de alcohol etílico en
sangre y humor vítreo. Por otra parte, hay
que tener en cuenta que la relación entre
concentraciones de sangre y humor vítreo en
cualquier estudio depende de la inclusión en
el mismo de casos en los que la muerte del
sujeto se produce cuando aún no se ha
alcanzado el equilibrio de difusión (9-11). Yip
y Shum (12) sugieren que cuando la relación
de concentración sangre/humor vítreo es >
0,95, la muerte del sujeto ha ocurrido durante
la fase de absorción. En nuestro trabajo, los
3 casos excluidos del estudio de acuerdo con
la información disponible sobre las
circunstancias de la muerte presentaban una
relación superior a 0,95. En este caso,
cualquier estimación de CES a partir de
CEHV en un caso individual debe
proporcionar el intervalo de predicción y el
grado de certeza con el que el valor
verdadero cae dentro de ese rango. Tabla 2.
Coeficientes de la ecuación y límites de
predicción. La mejor estimación de CES a
partir de CEHV debe estar basada en el
análisis de regresión y el cálculo del intervalo
de predicción a un nivel de confianza del 95
% (13-16). A la vista de estos resultados,
podría parecer que la determinación de
alcohol en humor vítreo carece de valor
médico legal, pero ello no es cierto. La
determinación rutinaria de etanol en humor
vítreo junto a la determinación en sangre
constituye un buen método para certificar un
valor de etanol en sangre ya conocido. En
algunas ocasiones, se cuestiona en los
tribunales la validez de un valor elevado de
etanol en sangre sobre la base de la posible
contaminación de la muestra. En estos casos
es muy útil la determinación de etanol en
humor vítreo (17,18). En conclusión, la
determinación rutinaria de etanol en humor
vítreo constituye un buen método para
ratificar el valor de etanol en sangre ya
determinado. Siendo de gran utilidad en los
casos en los que se sospeche de
contaminación de la sangre.
CONCLUSIONES
 La cromatográfica representa
una técnica con gran crecimiento
y aplicaciones en diferentes
áreas y a una gran variedad de
productos por los buenos
resultados que ofrece.
 A través de la cromatografía de
capa fina se puede obtener
análisis de separación y Cusco. Químico Farmacéutico
cuantificación de ingredientes
activos, que es importante, en la
industria farmacéutica, De la
misma forma para la
determinación de Cuantificación
de edulcorantes, preservantes y
vitaminas, en el caso de la
industria alimentaria, Ya que,
tanto medicamentos como
alimentos son productos de gran
importancia para las personas.
 En la investigación realizada
pudimos comprender la amplitud
de aplicaciones realizadas en
cuanto a la cromatografía de
gases
BIBLIOGRAFÍA
 Jähnke R. (2008). Una Guía
Concisa de Control de Calidad
de Fármacos Esenciales y otros
Medicamentos - Volumen II ·
Ensayos con Cromatografía en
Capa Fina. Global Pharma
Health Fund (GPHF) Merck,
Darmstadt · Alemania ,
disponible en:
https://www.gphf.org/images/d
ownloads/Demo2GPHFTLCTes
tProtocol_es.pdf
 Medina Bracamon M. Gallo
Gagliotta M.(2013). Identificación
de aminoácidos libres por
cromatografía de capa fina en
jugo fresco de naranja (Citrus
sinensis L. Osbeck) variedad
“Valencia”. Laboratorio de
Productos Vegetales, Instituto
de Ciencia y Tecnología de
Alimentos (ICTA),Facultad de
Ciencias, Universidad Central
de Venezuela (UCV).
http://oaji.net/articles/2017/492
4-1495512622.pdf
 Costilla Garcia E. Mejía Sutti A
(2014). Determinación por
cromatografía de gases, el valor
del cociente: etanol en humor
vitreo/sangre en cadáveres
necropsiados de la Morgue del
del Laboratorio de Toxicología
Forense División Médico Legal
II Cusco, Perú.
http://www.scielo.org.pe/pdf/h
m/v14n2/a07v14n2.pdf
 MOREIRA B. GUEVARA P.
Análisis de hidrocarburos de
petróleo en agua mediante
cromatografía de gases.
Departamento de Ciencias de
la tierra y la construcción.
Escuela Politécnica del
ejército, Ecuador.
https://repositorio.espe.edu.ec/
bitstream/21000/4655/2/T-
ESPE-032766-A.pdf