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Trabajo Final
Para optar al Título de
Especialista en Reproducción Bovina
CÓRDOBA, 2010
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Resumen
El objetivo de esta revisión es brindar información sobre las diferentes técnicas de
criopreservación de embriones bovinos, analizando las ventajas y desventajas de cada una
de ellas en lo que respecta a su realización, costos, instalaciones y porcentajes de preñez.
La criopreservación es el proceso por el cual células o tejidos son congelados a muy
bajas temperaturas, generalmente a la temperatura de ebullición del nitrógeno líquido
(-196°C), para disminuir las funciones vitales de una célula u organismo y poder
mantenerlo en condiciones de vida suspendida por mucho tiempo. Esta técnica presenta
ventajas biológicas y comerciales, permitiendo transportar embriones a cualquier lugar del
planeta donde se encuentren las vacas receptoras; logrando muy buenos porcentajes de
preñez que varían según la calidad del embrión y la técnica aplicada.
El proceso de criopreservación se clasifica en equilibrado y no equilibrado, según
se utilicen técnicas que logren o no un equilibrio osmótico entre el medio y el agua
intracelular antes de la congelación del embrión.
Dentro de la criopreservación en equilibrio se encuentra la técnica tradicional con
tres variantes: estándar, de un paso y transferencia directa. En la primera el tiempo de
exposición al crioprotector es de diez a treinta minutos; siendo una técnica relativamente
lenta al igual que las otras dos variantes, su mayor desventaja es el tiempo requerido para
la descongelación ya que se necesitan hacer pasajes por soluciones con distintas
concentraciones de glicerol y sucrosa, haciendo esto también elevar su costo. En la
variante de un paso el tiempo requerido para la descongelación es menor, la desventaja es
que muchas veces no se logran homogeneizar correctamente las soluciones contenidas en
la pajuela, haciendo esto variables los porcentajes de preñez. En la transferencia directa se
requiere menor tiempo de exposición al crioprotector que en la estándar; la descongelación
es más rápida no requiriendo el pasaje por las distintas soluciones, haciendo también esto
disminuir los costos de dicha técnica. Los porcentajes de preñez son similares a los de la
estándar.
En la criopreservación no equilibrada hay mayor deshidratación y penetración del
crioprotector previo al enfriamiento, lo que las hace más rápidas que las equilibradas.
Dentro de esta hay dos variantes: rápida y vitrificación. En la primera los porcentajes de
preñez son bajos comparados con las demás técnicas. En la vitrificación los porcentajes de
preñez son aun variables, por estar todavía en desarrollo, pero en algunos casos similares a
la técnica estándar.
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BENEFICIOS DE LA CRIOPRESERVACIÓN DE EMBRIONES
Gracias a los avances desarrollados a nivel mundial en el campo de la reproducción
asistida, es factible obtener un incremento en el número de embriones obtenidos de una
hembra donante. Con la ayuda de tratamientos hormonales superovulatorios, se logra la
preñez y el nacimiento de las crías al transferirlos a receptoras sincronizadas. De esta
manera, se alcanza un mayor número de descendencias a partir de un animal con
excelentes cualidades, tanto productivas como genéticas. (2) Considerando que, en general,
el promedio de una vaca donante de embriones es de aproximadamente 8 a 10 ovocitos
recolectados, que de ellos se obtiene 6 a 7 embriones transferibles, dando 3 a 4 gestaciones
exitosas y que la tasa de preñez es del orden de 60% utilizando embriones frescos y 30 a
40% con embriones criopreservados (4), la potencialidad exponencial que tiene este
método de reproducción asistida logra maximizar la explotación de la especie bovina.
El uso de la criopreservación de embriones dentro del proceso de transferencia de
embriones, brinda una herramienta de suma utilidad, ya que a través de esta técnica
podemos conservar durante un prolongado período de tiempo un embrión de excelente
calidad, que permite utilizarlo cuando y donde se produzcan las condiciones favorables
para lograr la preñez de las receptoras, o ser usada en algún lugar lejano de donde fue
colectado. Desde la primera criopreservación de embriones de mamíferos lograda con éxito
en los años 70, este campo ha alcanzado grandes avances, todos dirigidos a estandarizar
técnicas simples y rápidas en su ejecución, económicas, aplicables a campo y lo más
importante, que ocasionan el menor daño posible al embrión (2).
En la actualidad la criopreservación ya cuenta con equipos que realizan parte del
proceso automáticamente utilizando diferentes programas y productos. La posibilidad de
congelar abre las perspectivas para el intercambio comercial entre países respetando las
regulaciones sanitarias, facilitando y abaratando el transporte de estos, brindando de esta
forma los beneficios de un material genético altamente valioso (9).
La transmisión potencial de enfermedades a través de los embriones es
considerablemente menor que a través del semen o de animales vivos, gracias a la
presencia de la zona pelúcida integra del ovocito, aunado a un adecuado procedimiento de
lavado del embrión, previo a la congelación (2). Esto conlleva a que la exportación de
embriones sea mucho más segura y económica que la compra de ganado en pie, sin
embargo es necesario adoptar medidas estrictas de cuarentena para prevenir la
contaminación de los embriones y reducir el riesgo de la trasmisión de enfermedades. (8)
ETAPAS DE LA CRIOPRESERVACIÓN
Básicamente, la criopreservación embrionaria contempla cuatro etapas:
a) suspensión de los embriones en soluciones a la que se les ha adicionado crioprotectores,
b) enfriamiento en condiciones tales que eviten la formación de cristales intracelulares
cuando se sumergen en nitrógeno liquido (-196 ºC),
c) entibiamiento de los embriones a temperaturas fisiológicas para reasumir las funciones
y, d) remoción de los crioprotectores (dependiendo del criopreservante del que se trate (4).
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Figura 1. Termo y tanque con nitrógeno liquido para almacenamiento de embriones
bovinos.
CRIOPROTECTORES
Un crioprotector es un compuesto químico que permite la mantención de un tejido
o de células por mucho tiempo cuando se las mantiene a baja temperatura. Los
crioprotectores difieren en la velocidad para penetrar los tejidos, el grado de protección al
cristal de agua que confieren y por la toxicidad química que pueden tener sobre las células.
El grado de protección a las células está directamente vinculado al grado de asociación que
tengan con el agua molecular. A mayor afinidad, menor el agua disponible para la
cristalización dañina. Además, estos productos se utilizan en conjunto con los medios
nutritivos líquidos que conforman las mezclas congelantes. (3)
4
que posee mejor resultado, lo que lo hace muy riesgoso por lo que no se recomienda
usarlo. Dado su bajo peso molecular, el EG tendría una mayor velocidad de penetración y,
por ende, necesitaría menor tiempo de exposición, disminuyendo su efecto tóxico.
CONSERVACIÓN DE EMBRIONES
Un paso indispensable en la transferencia de embriones es la conservación
temporal de los embriones recolectados de una donante antes de ser transferidos o
congelados, ésta se realiza en un medio de Solución Buffer Fosfato (PBS), suplementado
con 10% de suero fetal bovino que representa una fuente de proteínas que reduce la
tensión superficial, favorece la sedimentación, evita que los embriones se adhieran a algún
elemento utilizado para su manipulación, incorpora sustancias promotoras del crecimiento
que favorecen su desarrollo, absorbe e inhibe metales pesados tóxicos que puedan estar
presentes en el medio. La viabilidad embrionaria declina después de 12 horas.
Los embriones de bovinos mantenidos en un medio no nutritivo por un largo
tiempo y a temperatura ambiente decrecen ampliamente su capacidad de desarrollo, este
desarrollo puede ser preservado si los embriones se refrigeran de 0 a 4 ºC por no más de 24
horas técnica denominada refrigeración la cual se efectúa vehiculizando los embriones en
PBS envasados en pajuelas de 0.25 ml y colocadas en un refrigerador. Se utiliza hielo y
agua para regular el descenso de la temperatura. La refrigeración de embriones puede ser
considerada como una alternativa interesante cuando no sea posible recurrir a la
criopreservación.
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Figura 2. Esquema de correlación de las diferentes técnicas de criopreservación de
embriones bovinos
Criopreservación en equilibrio
Como su nombre lo indica, las técnicas de criopreservación en equilibrio deben
lograr un "equilibrio" entre la tasa a la cual el agua sale de la célula (deshidratación) y la
tasa a la cual ese agua es incorporada a los cristales de hielo extracelular.
La técnica Tradicional perteneciente a este tipo de criopreservación incluye las
técnicas Estándar, de un paso y de Transferencia Directa de los cuales se hará una corta
descripción.
Tradicional
Los crioprotectores (CP) utilizados en esta técnica son normalmente permeables.
Los más frecuentemente utilizados son: glicerol y etilenglicol.
Durante la fase inicial de preenfriamiento, los embriones se exponen a la presencia
del crioprotector en una fase que denominamos de equilibración. La respuesta inmediata
del embrión ante la presencia de un CP permeable es una rápida disminución de volumen
por pérdida del agua intracelular, hasta que se alcanza el equilibrio. Este fenómeno se debe
a la hiperosmolaridad inicial de la solución extracelular y a que los embriones son mucho
más permeables al agua que a los crioprotectores; la contracción se detiene cuando se
alcanza el equilibrio entre la salida de agua y la entrada del CP. A medida que el CP
penetra en el embrión, éste se expande gradualmente a causa de una reentrada de agua para
el mantenimiento del equilibrio osmótico.
La mayoría de los embriones mamíferos se congelan con la técnica tradicional
utilizando crioprotectores permeables y con tasas de congelación lentas y de
descongelación relativamente rápidas. Los procedimientos convencionales de congelación
lenta incluyen los siguientes pasos:
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Figura 3. Búsqueda e identificación de los embriones recolectados. Embriones bovinos
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Figura 5. Esquema representando los cambios de volumen celular en embriones
congelados/descongelados en glicerol 1,5 y colocados en solución de sacarosa 1,0 M
antes de colocarlos en medios de mantenimiento, o directamente colocados en medio de
mantenimiento. Las flechas esquematizan la dirección del flujo de agua y glicerol y el
grosor de las mismas esquematizan la diferencia de velocidad del flujo, debido a
diferencias en la permeabilidad. TE = transferencia. (11)
8
Con respecto a los periodos de desarrollo embrionario se han obtenido mejores
resultados con mórulas tempranas que con blastocitos y blastocitos expandidos (Dochi y
col., 1998). Según estos autores los estadios más avanzados serian más sensibles a sufrir
daño durante la congelación por tener un mayor grado de diferenciación celular y presencia
de líquido en el blastocele. En oposición a esto Prather y col (1987) sostienen que los
estadios mas avanzados son los que presentan mejor viabilidad post-descongelación y
postulan que el avance en el desarrollo implicaría un grado inherente de viabilidad lo que
les concedería a estos embriones menor posibilidad de sufrir degeneración celular. Por su
parte, Arreseigor y col. (1998) obtuvieron porcentajes de preñez de 57,1% en los
embriones de calidad pre-congelación excelente, 52,9% de los de buena y 31,2% en los de
calidad regular.
La congelación Tradicional incluye las técnicas Estándar, de un paso y de
Transferencia Directa de los cuales se hará una corta descripción.
Estándar
La técnica de congelación estándar posibilitó a Wilmut y Rowson (1973) obtener el
primer ternero nacido de la transferencia de un embrión congelado. A la técnica estándar se
le han efectuado desde entonces distintas modificaciones tendientes a su simplificación.
En la técnica de congelación estándar la exposición de los embriones al medio de
congelación (PBS + G) debe realizarse a temperatura ambiente (20 - 22 °C), en un solo
paso, de 10 a 30 minutos de duración. Este período incluye el envasado de los embriones
en pajuelas plásticas de 0.25cc. Lo que permite realizar rápidamente y con mayor precisión
la inducción de la cristalización o "seeding". Las pajuelas deben ser colocadas en un
equipo de congelación a -7 °C durante 5 minutos para equilibrar la temperatura de las
pajuelas con la del equipo; el seeding se realiza poniendo en contacto la superficie de la
pajuela con una placa metálica o hisopo enfriado con nitrógeno líquido (NL 2); el agente
refrigerante del equipo puede ser nitrógeno líquido, alcohol, etanol o metanol enfriado por
medio de un compresor.
De un paso
Desde el momento en que se demostró que la sacarosa podía ser utilizada para
retirar el crioprotector de los embriones, surgió la posibilidad de diseñar una técnica de
9
extracción que se adaptara al trabajo en condiciones de campo. Para evitar que durante la
extracción del crioprotector el embrión esté en contacto con el medio externo, Leibo
(1982) y Renard y col. (1982), implementaron el denominado método de congelación de
embriones en un paso o "one-step".
La tasa de preñez lograda con este método se aproxima a la que se alcanza con las
técnicas tradicionales, pero los resultados son variables. Pareciera ser, que la causa
principal de esta variabilidad se debe a la dificultad de mezclar ambas soluciones
crioprotectoras dentro de la pajuela.
Cuando el glicerol es extraído, la viabilidad embrionaria puede ser afectada al no lograr
una mezcla homogénea de las distintas soluciones unidas a una pérdida ocasional del
embrión, porque éste se puede adherir al algodón que la pajuela tiene en uno de sus
extremos. Además, se ha demostrado que las altas concentraciones de sucrosa causan daño
al embrión cuando existen elevadas temperaturas. (2)
De Transferencia Directa
Criopreservación no equilibrada
El término no equilibrada, se usa para describir la criopreservación por
procedimientos en los cuales las células y los tejidos no están en equilibrio con las altas
concentraciones de crioprotectores permeables y no permeables, antes de un enfriamiento
rápido.
Las altas concentraciones de crioprotectores causan una rápida deshidratación de las
células y el enfriamiento ocurre antes del equilibrio osmótico entre el medio y el embrión.
Los procedimientos de criopreservación no equilibrada, difieren de los procedimientos
equilibrados en el logro de una mayor deshidratación y penetración de los crioprotectores
previo al inicio del enfriamiento, logrando este enfriamiento en un solo paso.
Los procedimientos no equilibrados de criopreservación poseen dos variantes: la
criopreservación rápida y la vitrificación, dependiendo si forma o no hielo en la solución
durante la criopreservación. (2)
Rápida
Esta técnica es usada para describir la criopreservación de células que han sido
parcialmente deshidratadas antes de ser sometidas a una tasa de enfriamiento rápido de
1250 ºC/min. Un prerrequisito fundamental para criopreservar embriones exitosamente por
este método, es usar una solución compuesta de una mezcla de 2 a 4,5 M de crioprotectores
permeables, tales como el glicerol, el propanediol, el dimetilsulfóxido o el etilenglicol, y
0,25 a 0,5 M de crioprotectores no permeables tales como la sacarosa, la trehalosa, la
lactosa o la galactosa (Gordon, 1994).
Vitrificación
La vitrificación es un proceso físico de solidificación utilizado para conservar
órganos, tejidos y embriones. La solución vitrificante (SV) lleva incorporado
crioprotectores en alta concentración. Al ser enfriada no cristaliza, sino que se torna
viscosa y pasa del estado líquido a un estado sólido no estructurado similar al vidrio,
tomando de ahí su nombre. Todo el procedimiento desde el equilibrio hasta la inmersión en
NL no requiere más de 10 minutos. En condiciones practicas, la vitrificación se logra
mediante la inmersión directa en NL. Esto representa una velocidad de enfriamiento de
aproximadamente 2500ºC/min, resultando necesario el empleo de soluciones altamente
concentradas de uno o mas CP permeables que pueden ser toxicas para las células. (1)
12
Figura 7. Pasos en la vitrificación de un embrión bovino. La pajilla Francesa (0,25 ml) se
carga por succión solución de sacarosa aire solución de vitrificación +
embrión aire-sellado térmico. La pajuela se sumerge en nitrógeno liquido para
vitrificación. (8)
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Dochi y col. en 1990 y Kasai en 1996 equilibraron mórulas y blastocistos bovinos
(SE) (10% G + 20% 1–2 Propanodiol) durante 10 minutos, luego los expusieron a SV
(25% G + 25% 1-2 Propanodiol + sucrosa 1M en PBS), inmediatamente después de
cerrada la pajuela se introdujo lenta y progresivamente en el nitrógeno para que se
produzca simultáneamente la vitrificación de los compartimentos extra e intracelulares, lo
que posibilitó también transferir los embriones a campo. Utilizando estas soluciones se
obtuvo porcentajes de preñez del 50%, demostrando que son soluciones estables con poca
tendencia a cristalizar durante el enfriamiento. (3)
Los crioprotectores pueden ser removidos de los embriones en tres y seis pasos en
forma escalonada, hasta lograr una concentración final de PBS sin crioprotector. Saito en
1994 utilizó dos pasos sacarosa 0.5M. y 0.25M, manteniendo al embrión durante cinco
minutos en cada una. El embrión también puede transferirse en forma directa.
Kong y col. en 2000 vitrificaron en una ultra mini pajilla (1.0 – 0.8 mm de
diámetro) para reducir el daño por el alto volumen de la SV, obteniendo tasas de preñez a
la descongelación y cultivo del 72%. (3)
1) A la solución que contiene 6.6% glicerol +0.3 M sucrosa en la que se deja durante 5
minutos.
4) Luego tres pasajes por Holding y se carga el embrión en la pajuela que se va a usar
para TE.
Por lo que además de tener que usar la serie de soluciones mencionadas anteriormente
se requiere disponer de una fuente de energía eléctrica, un microscopio cuyo valor ronda
los U$S 4000, una heladera para los medios y soluciones, micropipetas para manipular los
embriones, placas de Petris, sellador de pajuelas, disponer de un ayudante capacitado que
realice el proceso de descongelamiento y cargado de pajuelas y/o una planificación
detallada por el tiempo que esto requiere, etc. Comprado con el uso de EG con el cual al
usarlo como CP solo se requiere descongelar la pajuela y directamente transfiere.
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Figura 11. MicropipetaVolumen Fijo para manipulación de embriones.
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