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Examen de la asignatura "PROTEÓMICA"

(4º Curso Biotecnología, ETSIA-UPV)

A) Propón razonadamente un protocolo para purificar mediante combinación de

técnicas cromatográficas la proteína C2 del resto de las proteínas de una mezcla
cuya separación por electroforésis bidimensional se muestra a continuación:

La mejor opción sería utilizar una combinación de cromatografías de intercambio

iónico, seguida de exclusión molecular y, finalmente, de fase reversa. Dado que el pI de
C2 es ~ 4.5, podremos utilizar un intercambiador aniónico (si utilizamos tampones a pH
superior al pI de la proteína, es decir, > 5.5) o catiónico (si quisieramos utilizar
tampones de pH inferior a 3.5. El pH y la fuerza iónica del tampón denen ser
compatibles con la estabilidad de la proteína. Utilizariamos ese orden de cromatografías
porque el intercambio iónico concentrará la muestra, mientras que la exclusión
molecular la diluiría. Así, podremos aplicar una muestra diluída y de gran volúmen
como la fracción solúble de un lisado celular y, una vez unidas las proteínas a la matríz
cromatográfica, equilibrar la columna en aquellas condiciones que más nos interesen
para el segundo paso cromatográfico. La elución de la columna de intercambio iónico se
realizará aumentando la fuerza iónica del tampón de equilibrio. La HPLC de fase
reversa, dada su alta capacidad resolutiva, servirá para acabar de purificar la proteína
(si no quedara suficientemente pura de las etapas anteriores) al tiempo que contribuye a
concentrar la muestra y eliminar sales, dejando a la proteína resultante en condiciones
adecuadas para su caracterización posterior mediante secuenciación N-terminal y
espectrometría de masas...
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B) El análisis por espectrometría de masas mediante ionización por electrospray de la

proteína C2 nativa produjo el siguiente espectro:

B1.- Deduce el estado de carga de los iones y calcula la masa molecular de la

proteína.

Asignando arbitrariamente carga "n" al ión de m/z 1315.4, plantearemos las siguientes
ecuaciones;
M= 1315.4n-n = 1388.5(n-1)-(n-1) = 1469.9(n-2)-(n-2) = 1249.7(n+1)-(n+1)....
Igualando dos ecuaciones despejaremos calcularemos que n = 19, y por tanto la masa
molecular de la proteína será:
1315.4 x 19 -19 = 24973.6; 1388.5 x 18 -18 = 24975.0; 1469.9 x 17 -17 = 24971.3;
1249.7 x 20 -20 = 24974.0; 1190.2 x 21 -21 = 24973.2, etc.., duduciendose un valor
medio de 24973.4 ± 1.6 Da. La diferencia entre este valos (proteína nativa) y la masa
molecular aparente de la proteína reducida y carbamidometilada observada en la
electroforésis bidimensional (A) (~15 kDa) indica que C2 nativa debe ser dimérica.

B2.- ¿Como definirías la masa molecular determinada? Monoisotópica?

Promediada? Razonalo.

La masa molecular determinada en B1 es promediada ("isotope-averaged") ya que

corresponde al valor de m/z más abundante de la distribución isotópica. El ión
monoisotópico de proteínas no puede ser nunca el ión más abundante. Además, para
poder observar la distribución isotópica de los iones multicargados del espectro,
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necesitariamos una resolución R = M/∆M = 1315.4/(1/19) 24992. Este valor es superior

al esperado para los espectrómetros usuales (~ 10000). Sólo espectrómetros tipo
Orbitrap y de transformada de Fourier logran resoluciones > 25000.

C) Con objeto de identificarla, la proteína C2 se sometió a degradación triptica y los

iones cuyo espectro de resolución isotópica se muestran a continuación se secuenciaron
mediante espectrometría de masas en tándem:
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C1.- Deduce las masas moleculares (M+H+) y las secuencias de aminoácidos de los
iones peptídicos.

Las masas moleculares de los iones peptídicos secuenciados son:

- 569.4 x 2 -2 = 1136.8 Da
- 643.2 x 2 -2 = 1284.4 Da (La carga 2+ de este ión se deduce a partir de la distribución
isotópica del ión precursor: z = 1/(643.7-643.2) = 2).

La secuencia de aminoácidos deducida de la secuenciación del ión 569.4 (2+) es:

y1 =175.3 (R)
y2 = 289.4 (NR)
y3 = 403.5 (NNR)
y4 = 474.5 (ANNR)
y5 = 621.6 (FANNR)
y6 = 781.6 (CFANNR)
y7 = 894.8 (XCFANNR, X= I/L)
y8 = 966.1 (AXCFANNR)
y9 = 1037.4 (AAXCFNNR)
bn +H = (569.4 x 2)- 1037.4 = 101.4 (~V)
SECUENCIA: VAAXCFANNR

La secuencia del ión 643.2 (2+) es:

y1 =147.1 (K)
y2 = 307.1 (CK)
y3 = 467.3 (CCK)
y4 = 582.3 (DCCK)
y5 = 719.6 (HDCCK)
y6 = 818.3 (VHDCCK)
y7 = 965.6 (FVHDCCK)
b2 = (643.3 x 2)- 965.6 = 321 (321.3 en el espectro). Los siguientes iones de la serie b,
468.3-567.4-704.6-819.2-979.4-1139.5 confirman la lectura FVHDCC; la lisina
terminal también se deduce de (643.2 x 2) - 1139.5 = 146.6. Dado que este valor no
puede corresponde a ningún ión b1, b2, etc. sólo puede corresponder a y1 = K.
SECUENCIA: (321.3)FVHDCCK
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D) Un análisis BLAST utilizando las secuencia de los péptidos cuyos espectros de

MS/MS se muestran en el apartado C encontró similitud con las siguientes proteínas:

DEFINITION RecName: Full=Phospholipase A2;

ACCESSION P00620
1 DLTQFGNMIN KMGQSVFDYI YYGTYIGWGG KGKPIDATDR CCFVHDCCKG KMGTYDTKWT
61 SYNYEIQNGG IDMDEDPQKK ELVEPDRVAA ICFANNRNTY NSNYFGHVH

DEFINITION RecName: Full=Phospholipase A2 isozyme CM-II

ACCESSION P00621
1 DLTQFGNMIN KMGQSVFDYI YYGCYCGWGG QGKPRDATDR CCFVHDCCKP KMGTYDTKWT
61 SYKYEFQDGD IICGDKDPQK KELCECDRVA AICFANLRNT YNSKYFGYSS SKCTETEQC

DEFINITION RecName: Full=Phospholipase A2 isozyme 3

ACCESSION P14615

1 NLFQFKNMIQ CAGTRSWTDY VSYGCYCGKG GSGTPVDQLD RCCKVHDDCY GDAEKIPKCK

61 PYYKTYSYDC SEGKLTCKAD NDECAAFICN CDRVAAICFA NNKPNDNNFM IDSKTRCNDI

D1.- Deduce la identidad más probable de la proteína C2.

La única proteína que contiene los iones secuenciados es P00620.

D2.- Teniendo en cuenta todos los datos anteriores, y los espectros de huella
peptídica (tríptica) de la proteína nativa mostrada a continuación ¿qué puede
deducirse de la estructura de C2? El espectro A se tomó en condiciones nativas; el
espectro B se tomó tras reducir los puentes disulfuro y carbamidometilar los
grupos sulfidrilo resultantes:
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En los espectros, todos los iones salvo 1053.34 y 2155.08 en A y 1135.56 y 1285.45 en
B corresponden a péptidos tríptidos esperados de la digestión de P00620 con tripsina.
Por otra parte, los iones teóricos no observados son 1057.37 (CCFVHDCCK) y 1078.54
(VAAICFANNR). Estos iones corresponden precisamente a las secuencias deducidas
en el apartado C, salvo que los espectros de fragmentación correspondían a iones de
péptidos trípticos carbamidometilados (MH+ = 1135.8 y 1285.4). Utilizando los datos
experimentales anteriores, la única correlación posible entre los iones no asignados y los
no encontrados es: 1053.34 = 1057.37 - 4, y 2155.08 = 1078.54 x 2 -2. Ello indica que
en la proteína nativa las cisteínas del péptido 41CCFVHDCCK49 forman 2 enlaces
disulfuro intracatenarios, y que la cisteína 92 forma un enlace disulfuro
intercatenario con la cisteína homóloga (92`) de la otra subunidad del dímero.
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Además, el hecho de que todos los iones observados en los espectros de huella peptíca
puedan asignarse a la misma proteína, P00620, indica que la proteína C2 nativa debe ser
un homodímero. La masa molecular promedio calculada para P00620 (con todas las
cisteínas formando enlaces disulfuro) es 12485.9 Da. Por tanto el homodímero de
P00620 tendría una masa molecular promedio de 12485.9 x 2 = 24971.8 Da, que está
dentro del rango experimental medido en el apartado B. También se deduce que las
únicas modificaciones posttraducciones de la proteína P00620 son sus enlaces disulfuro.
Podría proponerse la siguiente estructura esquemática:
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Notas

1. La tripsina corta el enlace peptídico C-terminal de lisinas (K) y

argininas (R) siempre que el siguiente resíduo no sea una prolina.

2. Las masas moleculares (en Da) de los aminoácidos internos son: G,

57.08; A, 71.03; S, 87.02; P, 97.04; V, 99.06; T, 101.04; C, 103.03; I,
113.08; L, 113.08; N, 114.05; D, 115.03; Q, 128.06; K, 128.08; E,
129.1; M, 131.04; H, 137.04; F, 147.1; R, 156.1; Y, 163.09; W, 186.08;
C (carbamidometilada), 160.06.

3. Las masas moleculares de la lisina y de la arginina en el C-terminal de

un péptido son, respectivamente, 147.08 y 175.1 Da.

4. Las secuencias del apartado D producen los siguientes péptidos trípticos

teóricos (las masas corresponden a iones monoisotópicos sin ningún tipo
de modificación de las cisteínas):
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