Metodología

Materiales
Cubeta con cables de corriente.
Soporte para la polimerización.
Soporte para el desarrollo de los geles en la
cubeta.
Soporte para los cristales.
Cristales de 2 tamaños diferentes.
Separadores, peine.
Puntas de micropipeta para cargar las muestras en
los geles
Muestras y patrón de peso molecular.
2 Tubos de plástico cónico de 50 ml.
9 Tucos de plástico cónico de 20 a 40 μl.
Micropipetas de 20 μl, 200 μl y 1000 μl.
Equipo de Electroforesis 80-120v (90 min.
aproximadamente).
Reactivos
Gel Separador al 12%.
H20 Agua Destilada 2.1 ml.
Buffer de Tris 1.5 ml al 8.8 pH.
Acrilamida 2.4 ml al 30%.
SDS (Sodio Dodecil Sulfato) 187.5 µl al 10%.
PSA (Persulfato de Amonio) 50 µl al 10%.
TEMED 10 µl.
Gel Separador al 0.9%.
H20 Agua Destilada 1.750 ml.
Buffer de Tris 750 µl al 6.8 pH.
Bisacrilamina 1.4 ml al 4%.
SDS (Sodio Dodecil Sulfato) 75 µl al 10%.
PSA (Persulfato de Amonio) 37.5 µl al 10%.
TEMED 7 µl.

Con la realización de esta práctica de laboratorio se lleva a cabo el procedimiento para

utilizar Bright Protein Ladder electroforesis en un soporte de gel de Poliacrilamida SDS‐
PAGE, a fin de cuantificar, comparar y caracterizar proteínas, mediante la Técnica
analítica semipreparativa se separan y se identifican biomoléculas según su tamaño
molecular bajo la acción de un campo eléctrico (Laemmli 1970).
En un tubo de Plástico cónico se añade 1 gel separador al 12%, 2.1 ml de H20 agua
destilada, 1.5 ml Buffer Tris al 8.8 pH, 2.4 ml de Acrilamida al 30% y 187.5 µl al 10% de
SDS, se mezcló bien para evitar la formación de burbujas ya que, el oxígeno inhibe la
polimerización, después se añadió 50 µl de persulfato de amonio (APS) al 10% y 10 µl
de TEMED, agregando estos dos reactivos inicia el proceso de la polimerización, por
consiguiente se depositó la solución del gel separador entre los dos cristales con ayuda
de una pipeta Pasteur, inmediatamente se añadió la agua a la superficie del gel que
sirve para anivelar, se visualiza una línea delgada y se deja polimerizar el gel por un
tiempo predeterminado de 5 min cambiando su textura a la de una gelatina.
En otro tubo de Plástico se añade 1 gel separador al 0.9%, 1.750 ml de H20 agua
destilada, 750 µl Buffer al 6.8 pH, 1.4 ml de Bisacrilamina al 4% y 75 µl al 10% de SDS,
se mezcló bien para evitar la formación de burbujas ya que, el oxígeno inhibe la
polimerización, después se añadió 37.5 que sirve para anivelar, se visualiza una línea
delgada de persulfato de amonio (APS) y 7 µl de TEMED, agregando estos dos
reactivos inicia el proceso de la polimerización por consiguiente se depositó la solución
del gel separador entre los dos cristales con ayuda de una pipeta Pasteur, después se
introdujo el peine para formar las calles y se dejó polimerizar 5 min.
 Para la preparación de la muestra se lleva a cabo mediante la precipitación con
acetona de proteínas, para ello se coloca el gel en el soporte que pose los electrodos,
se llena a 7/8 al separador y 1/8 al gel concentrador, se probó una solución de buffer
( 50 M de pH 8) se disuelve en 1M EDTA y 1% de SDS. Se toma 2 ml y se coloca en un
tubo eppendorf, 1 ml de Acetona que se desea precipitar posteriormente se lleva un
congelador de -20°C aproximadamente en un reposo de 15 min, para después añadirlo
a la solución y así formar 3 ml de Acetona en total que se deja reposar en un lapso de
24 horas.
Colocar el gel en el soporte que posee los electrodos. Llenar el depósito interior con
tampón de electroforesis con running buffer. . Se Pone el resto del tampón en el
depósito inferior. Tampón de electroforesis siendo Tris el amortiguador, glicina la
conductividad y SDS el desnaturalizador.
En 9 tubos de plástico cónico de 20 a 40 μl se cargan las muestras con ayuda de una
micropipeta depositando cada muestra en su pocillo correspondiente y se introduce el
peine a 1 milímetro de distancia para formar las calles. se lleva a cabo a voltaje
constante de 80-120v (90 min. Aproximadamente).

Call Calle Calle Calle Calle Calle Calle 7 Calle 8 Calle 9 Calle 10
e1 2 3 4 5 6
Lader Inicio Medio Final Todo BSA Ovoalbúmin Ovoalbúmina Ovoalbúmina Ovoalbúmina
15 μl+ 15 μl+ 15 μl + 15 μl + a 15 ml + 20 μl + 25 μl +
sample sample sample sample 10 μl + sample sample sample
buffer buffer buffer buffer sample buffer buffer buffer
buffer

Se polimerizo el de 4%. Se retira el peine y agregamos 20 μl de Ladder en las calles

del 1-10 y se coloca la tapa en la corriente (+,+) (-,-). La electroforesis se llevará a cabo
a voltaje constante de 80-120V (90 min. aproximadamente). La electroforesis acaba
cuando la línea azul de bromofenol ha llegado a la parte inferior del gel. Cuando la
electroforesis se ha completado, desconectar la fuente de alimentación. Quitar la tapa
superior. Se saco el soporte de desarrollo y se descarta el tampón. Se saco los
soportes de los geles y aflojar los tornillos. Se retiro cuidadosamente los vidrios con el
gel. Se separa lateralmente uno de los espaciadores sin sacarlo del todo. Se forzó con
cuidado para separar los cristales y se deja libre el gel.