MARCO TEÓRICO

Tinciones generales

Debido a la naturaleza química de la célula bacteriana, su afinidad por los colorantes, su

propiedad ha sido aprovechada para estudiar los diferentes tipos morfológicos y estructuras
(capsulas, esporas, flagelos, etc.) que ayudan a la identificación de una especie o grupo en
partículas. Los colorantes de mayor aplicación son: cristal violeta, violeta de genciana, fucsina
básica, safranina, azul de metileno y verde de malaquita. Actúan mejor mediante la adición de
mordientes, porque aumentan la permeabilidad de la pared celular y membrana citoplasmática.

TINCIONES.-El microscopio de campo claro es más útil para la observación de especímenes

teñidos. Los colorantes son compuestos químicos utilizados para aumentar el contraste existen
algunos llamados:

COLORANTES VITALES.-Que pueden añadirse directamente a una preparación en fresco; por

tanto colorean células vivas. No obstante la mayoría de colorantes son efectivos después de que
los microrganismos hayan sido fijado, es decir se encuentren murtos y adheridos al portaobjetos.
Para la fijación del calor se realiza una fina extensión de una gota d muestra líquida en el
portaobjetos y se deja secar al aire libre o sobre la llama del mechero, el calor de la llama mata las
células microbianas por des se utiliza la fijación química, ya que es menos lesiva que el calor. Para
ello se añade una gota de fijador, como acido osmótico, etc. naturalización de sus proteínas; las
proteínas coaguladas unen sus células al porta. Para las fijaciones de especímenes delicados

La fijación posee algunos inconvenientes, a menudo distorsiona la apariencia real de las células y
no permite la observación del movimiento de los microrganismos.

TIPOS DE COLORANTES
Casi todos los colorantes son sales, compuestos formados por iones cargados.

 LOS COLORANTES BÁSICOS.-son aquellos en los cuales el agente que tiñe es el ion cargado
positivamente ya que estos son los más utilizados, ya que la mayor parte de células
microbianas poseen cargas débilmente negativas en la superficie lo cual facilita su unión. Entré
los colorantes más comunes se encuentran la safranina, la fucsina básica, el cristal violeta y el
azul de metileno.

 LOS COLORANTES ACIDOS.-el colorante es el ion cargado negativamente, estos colorantes se

unen a las partes de las células cargados positivamente. Sé utilizan para teñir tejidos animales
infectados con microrganismos. Entré los más frecuentes tenemos a la eosina, la fucsina acida
y el rojo Congo.

TIPOS DE TINCIONES:
 TINCIONES SIMPLES.-Se usa un único colorante, de tipo básico usado solo para incrementar el
contraste, mejorando la observación de la célula completa.

 TINCIONES DIFERENCIALES.-Se utilizan para distinguir entre tipos de microrganismos, esta

técnica primero se hace con una tinción simple seguido de una de contraste en donde se usa
otro colorante. Estas tinciones son muy usados en microbiología por ej. La tinción gran y la
tinción de ácido-alcohol, ambas aplicadas a bacterias.

LA TECNICA DE TINCIONES GRAM.-

Desarrollado por el bacteriólogo Danés Cristian Gram en 1884, clasificando las bacterias en dos
grupos:

 GRAM POSITIVO.-La técnica incluye tinción primaria, decoloración y de contraste, se tiñe el

espécimen de cristal violeta añadiendo el mordiente, aplicando el agente decolorante
(acetona), en donde las bacterias retienen el colorante, añadiendo safranina proporcionándolo
un color violeta más intenso. Los bacilos y cocos gran positivos formadores de endóspora
consta de siete géneros entre ellos bacillus y Clostridium ampliamente distribuidos y son de
gran importancia clínica. Ambos son bacilos y algunas especies son móviles por flagelos
periticos. Todas las especies clostridium son anaerobios y de hábitat en el suelo. Todos los
basillus realizan una respiración aeróbica y algunas anaeróbicas facultativos capaces también
de fermentar. Debido a su bajo contenido de agua, las endosporas no teñidas son fácilmente
visibles al microscopio.

 GRAM NEGATIVO.-Con esta misma técnica pierden su tinción violeta durante la decoloración y
se han teñido de rosa con el colorante en contraste. En su variedad se encuentran helicoidales,
vibroides, aerobias, microaerofilas todos los miembros crecen en mejores concentraciones de
oxigeno inferiores a la del aire. Este grupo comprende varios organismos interesantes como el
compylobacter (agente causante de diarreas), azospillirium (importantes para el
mantenimiento de la fertilidad de los suelos tropicales) viven en estrecha asociación con las
raíces de las plantas. Este grupo incluye especies que afecta en gran medida a la salud humana
y a nuestro medio ambiente.

COLORACIÓN GRAM: La tinción de Gram o coloración de Gram es un tipo de tinción diferencial

empleado en microbiología para la visualización de bacterias, sobre todo en muestras clínicas. Se
utiliza tanto para poder referirse a la morfología celular bacteriana como para poder realizar una
primera aproximación a la diferenciación bacteriana, considerándose Bacteria Gram positiva a las
bacterias que se visualizan de color moradas y Bacteria Gram negativa a las que se visualizan de
color rosa o rojo o grosella.

CORPÚSCULOS METACROMATICOS: Estas inclusiones se tiñen de rojo con algunos colorantes

azules, como el azul de metileno y se conocen también como gránulos de volutina. Se trata de una
forma de reserva de fosfato inorgánico (poli fosfato) que puede utilizarse en la síntesis de ATP. La
volutina se forma generalmente en células que crecen en ambientes ricos en fosfatos. Los
corpúsculos metas cromáticas se encuentran en algas, hongos y protozoos, así como en bacterias.
Estos gránulos son bastante grandes y característicos en Corynebacierium diphtheriae, el agente
etiológico de la difteria, por lo que tienen valor diagnóstico.

MATERIALES Y REACTIVOS

MATERIALES:

Son un tipo de sujeción

ajustable, generalmente de
madera, que forma parte del
PINZA
equipamiento de laboratorio,

Es un utensilio metálico que

permite calentar sustancias,
proporciona una llama caliente de
MECHERO DE
hasta 1500 grados centígrados.
BUNSEN

Los alcoholes pueden ser

primarios, secundarios o
terciarios, en función del número
ALCOHOL de átomos de hidrógeno.

Nos sirve para hacer las torundas,

es decir, para cubrir y proteger las
ALGODÓN
muestras que hagamos en el
laboratorio.

Pieza o lámina rectangular de

cristal en que se coloca el objeto o
PORTA OBJETOS preparación que va a ser
observado en el microscopio.

Se aplica a la muestra para poder

observar la dicha muestra,
ACEITE DE
reflecta a la luz y se logra enfocar
INMERSIÓN
a una gran ampliación.
 Es un instrumento que permite
observar objetos que son
MICROSCOPIO demasiados pequeños para ser
vistos a simple vista.

Es un material que nos ayuda para

poder realizar las siembras
adecuadamente, tiene una punta
de alambre que cuando lo
ASA DE SIEMBRA
calentamos estamos
descontaminando.

REACTIVOS:

 Solución de toluidina 0.1% en etanol 10%

 Etanol de 40% y de 10%
 KOH
 YODO
 cultivo de bacillus
 liquido de bouin
 éter
 lugol

EXPERIMENTOS DE COLORACIONES DE TINCIONES GENERALES:

1. coloración gram
PROCEDIMIENTO:

1. Desinfectamos el área de trabajo (alcohol)

2. Esterilizamos los materiales (aza de siembra) con

ayuda del mechero.

3. Sacamos una pequeña porción de muestra

de los tubos con cultivo gram - positiva y gram - negativas.

4. Obtenida la muestra en el aza de siembra la colocamos en el

portaobjetos y realizamos el frotis y la fijación de los
5. Obtenida la muestra en el aza de siembra la colocamos en el portaobjetos y realizamos el frotis
y la fijación de los diferentes cultivos de bacterias. Cada colorante que se utilizara será de una
cantidad de 2 ó 3 gotas.

6. Luego de ello cubrimos con colorante (cristal violeta) la preparación,

dejándola actuar en un periodo de un minuto.

7. Lavamos cuidadosamente con agua destilada (eliminación del exceso

de colorante).

8. Se cubre la preparación con colorante (lugol) por

un minuto, con el objetivo de aumentar la afinidad entre el colorante y las
células.

9. Utilizamos el agente decolorante (alcohol – acetona) lavando con

sumo cuidado dicha preparación dejando actuar por un minuto

10. seguida echamos colorante de

contraste (safarina). Las bacterias gam - positivas se teñirán de color azul
y las gran negativas color rosa debido a este colorante.

11. Finalmente secamos la muestra al aire

libre, le añadimos 2 gotas aceite de inmersión y observamos en el
microscopio con el objetivo de inmersión (100X).

2. tinción simple

PROCEDIMIENTO:

1. Desinfectar nuestra área de trabajo.

2. Encender el mechero y esterilizar el asa de siembra.
3. Dejar enfriar el asa de siembra para tomar la muestra de microorganismos,
después acercar el tubo hacia la muestra quitarle el tapón y flamear rápidamente
la boca del tubo, introducir el asa en el tubo y tomar cuidadosamente la muestra.
4. Hacer el frotis y secarlo y fijarlo.
5. Cubrir con colorante /azul de metileno/ la preparación y dejarlo actuar durante 1
minuto.
 6. Lavar suavemente con agua destilada para eliminar el exceso de colorante.
7. Secar al aire y echar 2 gotas de aceite de inmersión.
8. Observar en el microscopio con el objetivo de 100X.

3. coloración de corpúsculos metacromaticos: método de loeffler.

En esta parte de la coloración de corpúsculos metacromaticos realizamos la práctica donde se

pueden encontrar en muestras de saliva de humanos.

Para realizar la Seguidamente

practica de continuando con el
metacromatico con Luego de poner la procedimiento a la
la saliva primero muestra en el cubre muestra le pusimos
pusimos la muestra objeto durante 1 azul de metileno
de la saliva en el minuto. durante un minuto.
cubre objeto .

Luego de observar en el
Luego de eso le Seguidamente a la microscopio pues
enjuagamos con agua muestra le pusimos vemos estos resultados
destilada y le aceite de cedro para con puntos de color
pasamos a secar por 1 luego ser observado azul claro y
minuto. en el microscopio. granulaciones.
 4. tinción de núcleo en levaduras

PROCEDIMIENTO:

1.Prepara un frotis con células de levadura

con agua de llave

2. seque al aire, fije la lama muy suavemente.

3. Bañe la porta durante un minuto con

solución etanol al 40%.

4.Bañe en agua de caño

5. Bañe la solución con KOH y dejarlo

reaccionar por una hora. Si se empieza a
deshidratar agregue KOH

6.Lave bien en la llave

7. Aplicar azul de toluidina por dos minutos.

8.Lave con etanol al 10% sacuda el exceso de

alcohol y seque al aire

9.Prepara otra porta objeto y procede solo

ahsta el segundo paso

10. En vez de KOH colocar azul de toluidina

por 2 minutos y continué con el frotis.
 5. coloración de membrana celular: método de knaysi
La membrana citoplasmática es de naturaleza lipoproteica y da una reacción acida uniéndose
intensamente con colorantes básicos y neutros. No obstante esta propiedad, el doble contorno de la
membrana se aprecia mejor cuando se retrae el protoplasma o cuando se trata con algún solvente
orgánico que pueda diluir las grasas y deje expuesto el contorno a la acción de los colorantes.

PROCEDIMIENTO

Preparación para la Coloración de la Membrana Celular (BACTERIA DE BACILLUS Y E. COLI):

Preparamos el repectivo frotis extrayendo las

PRIMER muestras de bacterias(Bacillus y E.Coli)
PASO

hecho ya la frotis pasamos las dos laminas con las

bacterias por el ETER durante 5 minutos; realizamos
SEGUNDO
esto para que las bacterias esten bien adheridas a las
PASO laminas.

pasado los 5 minutos vertimos unas cuantas gotas de

liquido de bouin sobre ambas muestras y la dejamos
TERCER reposar 10 minutos
PASO

CUARTO
Y QUINTO Pasados los minutos
PASO escurrimos ambas Hecho esto ambas
muestras con agua muestras seguimos el
destilada de manera Hecho todos estos pasos
mismo procedimieto procedemos a observar
vertical y hechando el vertimos una gota de
agua a la parte superior al microscopio con el
lugol y colocamos el objetivo de 100x.
de la lamina para que respectivo cubreobjeto
este no caiga un chorro de ambas muestras de
de agua muy fuerte y la bacterias.
muestra se salga.
RECOMENDACIÓN:

o No colocar mucho el fijador de bouin ni lugol en las láminas, porque no se podrá

observar muy bien las bacterias.

o No echar directamente a la muestra un chorro de agua con la pizeta, porque la

muestra se podría salir, para eso se debe de inclinar las láminas donde se
encuentran las muestras y echar agua desde la parte superior, para que no caiga
directamente en la muestra.

CONCLUSION:

 Esta tecnica de knaysi que utilizamos es muy escencial para este tipo de muestra ya que
nos sirvio para identificar la coloracion de membrana plasmatica de color pardo oscuro
como el citplasma de color amarillo.

VI. DISCUSIÓN DE RESULTADOS

COLORACION GRAM

TINCION SIMPLE
COLORACION DE CORPUSCULOS METACROMATICOS: METODO DE LOEFFLER.
 Pues una vez realizado la practica en el laboratorio sobre el corpúsculos metacromasticos pues
observamos que se presentaba con granulaciones de color oscuro y algunos puntos claros de color
azul claro pues eso es debido a la alcalinidad que se presenta pero si un caso no presentaría las
granulaciones seria a la baja alcalinidad en la saliva pues eso es viendo desde otro punto de los
resultados.

VII. CONCLUSIONES

COLORACION GRAM
Concluimos que en la práctica de laboratorio pudimos identificar que la morfología de las bacterias
(escherichia coli, saccharomyces, bacillus, estafilococos) y el tipo de tinción que presenta. Las gram
positivas poseen una gruesa capa de peptidoglucano la cual impide que escape el complejo cristal
violeta – lugol. Es por ello que tiñen un color azul (escherichia coli, saccharomyces), mientras que
la capa peptidoglucano de las bacterias gram negativas es delgada y se encuentra a una membrana
externa lipidica susceptible a la decoloración con alcohol acetona; estas bacterias teñirán de color
rosa debido a la safarina (colorante de contraste)( bacillus, estafilococos).
 TINCION SIMPLE
 Con esta práctica aprendimos a realizar adecuadamente la preparación correcta de un
frotis para poder realizar posteriormente las tensiones más utilizadas para el laboratorio
de microbiología que son indispensables para el correcto estudio de los
microorganismos.

 Así mismo mediante la realización de las tinciones logramos observar la forma y

agrupación y características de las bacterias.

 La tinción simple es una herramienta muy útil en el laboratorio de microbiología así como
análisis clínicos siendo ineludible conocer su fundamento y procedimiento, para poder
tener una correcta interpretación de los datos que nos otorga la diferenciación de Gram
positiva y negativas concluimos que debido a la estructura de sus paredes celulares
tendrán o no propiedades patológicas diferentes .

COLORACION DE CORPUSCULOS METACROMATICOS: METODO DE LOEFFLER.

 En conclusión diríamos que la practica en el laboratorio sobre el corpúsculos metacromaticos nos

ayudarían a ver sobre la alcalinidad de nuestra saliva y así tendríamos que saber sobre cada uno
de nosotros pienso que es muy interesante realizarnos ese tipo de prácticas en el laboratorio.

TINCION DE NUCLEO EN LEVADURAS

Para realizar las coloraciones especiales se puede emplear diferentes métodos e instrumentos, lo
importante es que logremos el objetivo que se tiene en cada práctica, en este caso es ver las
diferentes estructuras microbianas a través de las coloraciones especiales que se puede emplear
en cada método.

Además se quiere identificar si cada muestra pertenece al grupo del Gram positivos o negativos.

BIBLIOGRAFÍA:

https://independent.academia.edu/AnthonyHuaman?swp=tc-au-15685252
 PRESCOTT MICROBIOLOGÍA QUINTA EDICIÓN PÁG. 70
 http://docencia.izt.uam.mx/gra/bioquimica1pdfs/1-1_celulas_procariontes.pdf
 Beishir, L. “Microbiology in practice. A self-instructional laboratory course”.5ª Ed. Harper
Collins Pub. Inc., 1991.
 Case, C.L. y T.R. Johnson. “Laboratory experiments in Microbiology”. The
Benjamin/Cummings Publishing Company, Inc. 1984.
 Claus, GW. “Understanding microbes: A laboratory textbook for microbiology”. 1ª Ed.
W.H. Freeman and Co. New York, 1989.
 Collins, C.H. y P.M. Lyne. “Microbiological methods”. Butterworth & Co. (Pub) Ltd., 1985.
 https://www.google.com/url?sa=i&url=https%3A%2F%2Fes.123rf.com
%2Fphoto_12845359_cient%25C3%25ADfico-mirando-por-un-microscopio-en-un
laboratorio.html&psig=AOvVaw1zmJ7-
KPdHrLhjIzC62o_D&ust=1597210708807000&source=images&cd=vfe&ved=0CA0QjhxqFw
oTCNCM59i3kusCFQAAAAAdAAAAABAD