Seminario 1: Métodos experimentales para el estudio de proteínas

Curso 2020-21

SEMINARIO 1
Métodos experimentales para el estudio de proteínas

Metodología
 La actividad será de elaboración grupal
 Entregables:
- Un informe individual
- Un informe grupal con la resolución de los problemas al menos con un día de
antelación a la realización del seminario: Fecha límite de entrega: miércoles 10 de
marzo (subir un archivo a la plataforma UBUVirtual- No incluir enunciados).
- Cuestionario de valoración del Grupo (ver archivo EXCEL en UBUvirtual)
 Fecha de realización del seminario:
Grupo 2 y 3: jueves 11 de marzo de 11:30-13:30
Grupo 1 y 4: lunes 15 de marzo de 10:30-12:30
 Durante la sesión presencial se realizará:
- Una discusión y resolución de los problemas planteados con participación de todos
los alumnos.
- Un test sobre los conceptos teóricos tratados en el seminario.
Evaluación
 Esta actividad está dentro del procedimiento de evaluación denominado “Seminarios”
(20% de la nota final). El peso de este seminario en este bloque es del 40%.
 Calificación de esta actividad:
- 30% informe individual
- 50% informe grupal
- 10% valoración del grupo
- 10% participación durante el seminario (test)
 La calificación obtenida en la participación (test) y la calificación del grupo no será
objeto de recuperación en la segunda convocatoria.
Materiales de consulta
 Presentación en Power-Point del Tema 7.

Problemas y cuestiones que han de resolverse en grupo

1. Contesta las siguientes cuestiones relacionadas la electroforesis:

a. ¿En qué se basa la electroforesis para la separación de proteínas?
b. Indicar las diferencias entre electroforesis en geles de poliacrilamida en condiciones
nativas y desnaturalizantes. ¿Con cuál de las dos técnicas podremos calcular la masa
molecular de una proteína? Explica tu respuesta
c. En la electroforesis SDS-PAGE (SDS-polyacrylamide gel electrophoresis) qué papel
desempeña el SDS, el 2-mercaptoetanol y la urea.

2. Del músculo esquelético de conejo se ha aislado la enzima aldolasa. Mediante cromatografía

de exclusión con Sephadex G-200 se determinó que su masa molecular era de 164.000 Da.
La misma aldolasa, tratada con SDS, fue sometida a electroforesis en gel de poliacrilamida
junto con tres patrones proteicos conocidos. Los resultados del gel se detallan en la tabla
siguiente.

1º Bioquímica – Grado de Ciencia y Tecnología de los Alimentos-Facultad de Ciencias- UBU

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Curso 2020-21

Proteína Movilidad relativa (Rf) PM (Da)

Seroalbúmina 0,20 68.500
Quimotripsinógeno 0,58 25.000
Mioglobina 0,74 16.900
Aldolasa 0,43 ¿?

Calcular la masa molecular de cada monómero de la aldolasa y el nº de monómero de la

proteína.

3. Una mezcla de cuatro péptidos (a, b, c y d) se depositó en una columna de resina de

intercambio aniónico. Predece en qué orden van a salir los péptidos de la columna, si ésta se
eluye con un sistema tampón cuyo pH va cambiando de forma continua desde pH 10 hasta
pH 2. Justifica tu respuesta. (Nota: explica con claridad el fundamento de esta técnica
cromatográfica).
a. His-Gly-Ala-Glu
b. Ser-Gly-Leu-Trp
c. Gly-Lys-Val-Ser
d. Val-Glu-Asp-Ala

4. Escribir el orden de elución, razonando tu respuesta, de las siguientes proteínas al aumentar

el gradiente salino al realizarse una cromatografía de intercambio iónico en cada uno de
estos casos:
a. Columna de intercambio aniónico: Citocromo c (pI = 10,5), lisozima (pI = 11,0),
albúmina de huevo (pI = 4,6), mioglobina (pI = 7,0)
b. Columna de intercambio catiónico: Citocromo c (pI = 10,5), pepsina (pI = 1,0), ureasa
(pI = 5,0) y hemoglobina (pI = 6,8)

5. En la tabla se presenta el proceso de purificación de la enzima alcohol deshidrogenasa de

Escherichia coli.
a. Define: actividad específica, rendimiento y grado de purificación.
b. Completa la tabla de purificación explicando cómo has realizado los cálculos.

Proteína Actividad Actividad Rendimiento Grado de

Etapa de
total a total b específica c (%) purificación
purificación
Extracto celular 693 384 0.55 100 1
Ultracentrifugación 0.53 60
Cromatografía
14.8 222
DEAE
Isoelectroenfoque 5.9 34
Exclusión molecular 2.3 173 75 45 138
a En mg
b En unidades de actividad (U)
c En U mg-1

6. Se ha preparado una columna de Sephadex G-200 para determinar masas moleculares de

proteínas. Se ha calibrado con proteínas de masa molecular conocida y se han obtenido los
volúmenes de elución (Ve) que figuran en la tabla adjunta. Se llama volumen de exclusión
(Vo) al correspondiente a la elución de moléculas que no penetran en el gel por su excesivo
tamaño (en esta caso, aproximadamente, Vo = 85 ml).
a. Determinar la masa molecular de una proteína X si su volumen de elución relativo
resultó ser Ve/Vo = 1,25.
b. ¿Cuál será su volumen de elución?

1º Bioquímica – Grado de Ciencia y Tecnología de los Alimentos-Facultad de Ciencias- UBU

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Proteína M (kDa) Ve (ml)

Ribonucleasa 12,64 232
Mioglobina 16,9 220
Hemoglobina 64,5 170
Inmunoglobulina 150 136
Fibrinógneo 339 104
Tiroglobulina 670 85

7. Qué fragmentos resultan cuando se trata el siguiente péptido con (a) pepsina, (b) tripsina y
(c) bromuro de cianógeno. Razona tu respuesta indicando los tipos de enlaces que
hidrolizan.
Ala-Leu-Lys-Met-Pro-Glu-Tyr-Ile-Ser-Thr-Asp-Gln-Ser-Asn-Trp-His-His-Arg

8. Determinar la secuencia de un péptido de 9 aminoácidos en base a los siguientes datos.

Explica con detalle tu respuesta. Nota: cuando no se conoce la secuencia, los aminoácidos se
separan con una coma. (1.5 puntos)
 Composición de aminoácidos: 2Ala, Arg, 2Lys,Met, Phe,2Ser
 Digestión con carboxipeptidasa A: Ala
 Digestión con tripsina: aparecen 4 péptidos.
o Ala,Arg
o Lys,Phe,Ser
o Lys
o Ala,Met,Ser
 Tratamiento con bromuro de cianógeno: 2 péptidos.
o Ala, Arg, Lys, Met, Phe, Ser
o Ala,Ser
 Digestión con termolisina: aparecen 4 péptidos (la termolisina en las condiciones de
reacción empleadas en este caso también corta por alanina).
o Ala
o Ala, Arg, Ser
o 2Lys, Phe,
o Met, Ser

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