 TRABAJO PRACTICO

Actividad 1: Estructura y función de aminoácidos y proteínas.

(A) OBJETIVOS GENERALES:

(A.1) Con el desarrollo de esta actividad se pretende que el alumno adquiera conocimientos
sobre la estructura molecular de péptidos y proteínas y pueda relacionarlos con la actividad
biológica que llevan a cabo.
(A.2) Asimismo, se tratará de establecer la importancia de los aminoácidos y de las proteínas
en el laboratorio clínico aplicado al diagnóstico y pronóstico de patologías humanas.

(B) OBJETIVOS ESPECÍFICOS:

(B.1) Sistematizar los conocimientos sobre estructura y propiedades fisicoquímicas de
aminoácidos y péptidos.
(B.2) Correlacionar la diversidad de funciones cumplidas por los aminoácidos y proteínas con
sus propiedades químicas y físicas (racionalizar la función a partir de las propiedades).
(B.3) Establecer criterios básicos que permitan explicar la enorme diversidad biológica a partir
de un conjunto limitado de monómeros.
(B.4) Poder predecir el rol biológico de una proteína basándose en su
estructura/conformación.
(B.5) Introducir fundamentos de técnicas bioquímicas empleadas para la cuantificación y
separación de péptidos y proteínas.

(C) CONOCIMIENTOS PREVIOS NECESARIOS:

(C.1) Concepto de pH y de pI. Constantes de ionización de ácidos y bases. Concepto de pK.
(C.2) Grupos funcionales de la química orgánica: principales propiedades químicas y físicas.
Concepto de óxido-reducción en química orgánica. Concepto de isomería espacial
(estereoisomería): series configuracionales D y L, compuestos dextro y levorrotatorios.
Diferentes tipos de enlaces químicos: covalentes, iónicos electrostáticos, puentes de
hidrógeno, fuerzas de van der Waals, etc.

(D) TEMARIO GENERAL:

(D.1) Base estructural de las proteínas: los α-L-aminoácidos. Estructura general de los
aminoácidos proteicos. Clasificación, según diferentes criterios. Propiedades ácido-base de
los aminoácidos, curva de titulación. Definición de pI: utilidad práctica en el diagnóstico de
laboratorio. Curva de titulación de aminoácidos monoamino-monocarboxílicos y aminoácidos
básicos y ácidos. Utilidad práctica de los conceptos de pK y pI para predecir la carga eléctrica
de los aminoácidos a diferentes pH.
(D.2) Enlace peptídico. Características del enlace peptídico, grupos involucrados. Estructura
primaria (secuencia) de péptidos y proteínas.
(D.3) Estructura tridimensional de las proteínas. Niveles de organización molecular.
Secuencia o estructura primaria de péptidos y proteínas. Nivel secundario de organización
estructural (descripción y características generales de los tipos de estructuras en relación a
proteínas globulares y fibrilares). Niveles terciario y cuaternario de organización estructural
(descripción y características generales en relación a las proteínas globulares). Fuerzas
comprometidas en el mantenimiento de los diferentes niveles de organización estructural.
Concepto de superestructuras moleculares.
(D.4) Relación entre estructura molecular y función biológica. Desnaturalización proteica,
diferencia con precipitación reversible. Tipos de agentes desnaturalizantes. Efectos de la
desnaturalización proteica. Mecanismos de acción de agentes desnaturalizantes físicos y
químicos. Relación entre estructura tridimensional y la actividad biológica. Discusión de la
función versus la estructura a través de ejemplos específicos (transportadores, hormonas,
enzimas, proteínas contráctiles, regulatorias, de defensa, y con propiedades osmóticas y
buffers).
(D.5) Análisis de aminoácidos y proteínas en el laboratorio. Electroforesis de proteínas
en humores biológicos: fundamentos de la metodología y aplicabilidad clínica de los
resultados. Distintos tipos de electroforesis.

(E) FUENTES DE INFORMACIÓN:

- Contenidos de los cursos de Biología y Ciencias Exactas.
- Seminarios de la Cátedra de Bioquímica.
- Nelson y Cox “Lehninger: Principios de Bioquímica”- 3ra o 4ta edición (2001-2006). Editorial
Omega.
- Devlin “Bioquímica (con aplicaciones clínicas)” 4ta edición (2004). Editorial Reverte.
- Berg, Tymoczko y Stryer “Bioquímica” 5ta edición (2003). Editorial Reverte.
- Voet y Voet. “Fundamentos de Bioquímica” (2006). Editorial Médica Panamericana.

PROBLEMAS DE RESOLUCIÓN PREVIA A LA CLASE

I) Aminoácidos
1) a) Indique cuáles de los aminoácidos proteicos son:
i) alifáticos
ii) aromáticos
iii) polares sin carga (marque el grupo polar)
iv) polares positivos
v) polares negativos
b) ¿Qué tipo de interacciones estabilizará cada uno de ellos durante el plegamiento de una
proteína?

2) a) ¿Qué es el punto isoeléctrico (pI)? Escriba la fórmula para calcular el pI de un

aminoácido neutro.
b) Mediante una curva de titulación explique dónde se encuentra la zona de capacidad
buffer (rango útil de amortiguación).
c) ¿Cuál (es) de los aminoácidos formadores de proteínas podría tener importancia como
amortiguador de pH dentro del rango fisiológico (7,40)?

II) Estructura proteica

3) a) ¿Que grupos funcionales están involucrados en un enlace peptídico? ¿Químicamente

de qué tipo de unión se trata?
b) Enuncie las principales características del enlace peptídico
c) Explique por qué la estructura primaria determina la estructura secundaria de una
proteína
4) a) Defina los niveles de estructura primario, secundario, terciario y cuaternario de una
proteína e indique que fuerzas estabilizan cada nivel de estructura y los grupos químicos
entre las que se establecen.
b) Marque en la siguiente representación de la estructura de una proteína los distintos
niveles de estructura proteica que pueda observar:

5) a) Cuál es la diferencia entre desnaturalizar e hidrolizar una proteína? ¿Qué uniones se

rompen al hidrolizar una proteína?
b) ¿Podría diferenciar a los péptidos glicil-valina y valinil-glicina mediante el análisis de sus
productos de hidrólisis? Justifique.

III) Relación estructura-función biológica

6) a) Describa las características de las proteínas globulares y fibrosas. Mencione ejemplos

de cada una de ellas.
b) Discuta la sensibilidad de cada una de ellas a los agentes desnaturalizantes.

IV) Técnicas de cuantificación, separación y purificación de proteínas

7) Con respecto a la espectrofotometría UV-visible

a) ¿Cuál es la utilidad de la técnica? ¿Cuál es su fundamento?
b) ¿Cómo se relacionan el color de una solución (absorbancia) con la concentración del
analito a cuantificar?
c) ¿Cuál es el fundamento de la medida de Absorbancia a 280 nm como técnica para la
cuantificación de proteínas? Justifique.

8) Explique el fundamento de la técnica de electroforesis.

PROBLEMAS DE RESOLUCIÓN EN CLASE

A Problemas del temario general.
I) Aminoácidos

1) a) Escriba (con fórmulas) el dipétido Glu-Val

b) Marque la unión peptídica. Dibuje las estructuras resonantes del enlace y mencione qué
propiedades le otorga.
2) ¿Qué tipos de residuos aminoacídicos se encontrarán con más frecuencia en los
segmentos transmembrana de una proteína intrínseca de membrana y en la capa exterior de
una proteína globular? Identifique los tipos de uniones que se establecen entre estos
aminoácidos y su entorno en ambos casos.
3) Para que una enzima se encuentre activa es necesario que un resto de ácido glutámico
del sitio activo se encuentre cargado negativamente. ¿A cuál de los siguientes valores de pH
mostrará la enzima mayor actividad, a pH: 4,3 o a pH: 5,5? Justifique.

II) Estructura proteica

4) a) Tanto la acetona, los pHs extremos y el calor pueden actuar como agentes
desnaturalizantes.
Explique el fundamento del modo de acción de cada uno de ellos.
b) ¿Qué pasaría si una proteína globular se tratara con ácido clorhídrico 6 M a 100°C durante
20 horas? ¿Y si la concentración de ácido es 0,1 mM y la temperatura es de 4°C?
c) ¿Por qué es imprescindible mantener la cadena de frío cuando se manipulan vacunas o
sueros con actividad biológica?

III) Técnicas de cuantificación, separación y purificación de proteínas

5) A continuación se muestra el perfil electroforético para las proteínas del suero humano de
un paciente sano en una electroforesis en papel a pH: 8,6:

En relación a esto:
a) Explique cuáles son las propiedades de las proteínas que hacen posible este método
separativo.
b) ¿Podría aplicarse esta metodología al análisis de péptidos y/o aminoácidos?
c) En el electroforegrama que está viendo, ¿cada banda está constituida por una proteína
pura? Justifique la respuesta.

6) Indique como se vería afectado el proteinograma de un paciente con:

a- mieloma multiple
b- infección bacteriana
Justifique su respuesta

7) a) ¿Qué diferencias existen entre una electroforesis nativa y otra en condiciones

desnaturalizantes?
b) Esquematice cómo serían los patrones de bandas de una enzima tetramérica de
conformación A2B2, en la cual la subunidad A pesa 34 kDa y la subunidad B pesa 60 kDa, si
se analiza por electroforesis en gel de poliacrilamida, tanto en condiciones nativas como
desnaturalizantes.
c) En el caso de analizar una muestra de suero humano en un gel de poliacrilamida y en
condiciones desnaturalizantes ¿espera observar más o menos bandas? ¿Por qué?

8) Se tiene una muestra compuesta por dos proteínas A y B, cuyos pI son 4.5 y 8,
respectivamente. ¿A qué pH debo trabajar si quiero precipitar a la proteína A y no a la B?
Justifique su elección.

B) Caso clínico Número 1.

Motivo de consulta: un varón de 17 años llega a la guardia del hospital con dolor intenso en
la parte baja de la espalda, el abdomen y las piernas luego de 2 días de náuseas y vómitos
causados por gastroenteritis.

Historia clínica: el paciente padece anemia falciforme, la cual le fue diagnosticada a los 3
años de edad. En su historia clínica se registran varios ingresos al hospital a lo largo de los
años por crisis vaso-oclusivas de células falciformes.
La anemia falciforme es una de las hemoglobinopatías más frecuentes. Es una enfermedad
de origen genético que afecta a la molécula de hemoglobina, y está causada por una mutación
puntual (GAG → GTG) que produce un cambio de ácido glutámico por valina en la sexta
posición de la cadena de beta-globina. A esta forma mutada de la hemoglobina se la
denomina HbS, para diferenciarla de la hemoglobina normal o HbA. Esta enfermedad
presenta una herencia autosómica recesiva, e incluye además del estado homocigota que
expresa 2 copias de HbS, un estado heterocigota (denominado portador de anemia
falciforme) que expresa una copia de HbS y otra de HbA.

Al momento de la admisión se realiza un análisis de sangre venosa periférica obteniéndose

los siguientes resultados:
● Hemoglobina: 7,8 g/dl (VR: 12 a 16 g/dl)
● Hematocrito: 23,4% (VR: 41 a 53%)
● Bilirrubina total: 2,3 mg/dl (VR: 0,2 a 1 mg/dl)
● VR: valor de referencia (valor normal)
Se realiza una radiografía abdominal que muestra la presencia de cálculos radiopacos en la
vesícula biliar.

1) Definiciones e interpretación de datos.

a) Busque en un diccionario médico, o en un libro de fisiología las definiciones de
hemoglobinopatías, anemia, hematocrito y bilirrubina total.
b) Indique si los resultados de laboratorio son coherentes con su patología. Justifique.

2) Estructura de las moléculas de hemoglobina. Relación con su función.

a) Teniendo en cuenta el cambio de aminoácidos que ocurre, ¿se trata de una mutación
conservadora o no conservadora? Justifique.
b) Dibuje la curva de titulación para ambos aminoácidos y los equilibrios químicos
involucrados. A pH fisiológico ¿qué carga presentará cada uno de ellos?
c) Indique el estado de ionización predominante para cada uno de ellos a valores de pH=1,
pH=3, pH=pI, pH=7, pH=11.
d) Calcule el pI para cada uno de estos aminoácidos utilizando las tablas de pKa
correspondientes.

e) ¿Qué diferencias espera encontrar en las interacciones químicas que son capaces de
establecer estos dos aminoácidos durante el plegamiento de la proteína?
f) ¿Qué consecuencias trae esta mutación a nivel estructural para la molécula de
hemoglobina?
g) ¿Qué son las células falciformes? ¿En qué condiciones se forman?
h) ¿Qué consecuencias trae esta mutación, a nivel funcional, para los glóbulos rojos?

3) Prueba diagnóstica-Electroforesis
La HbS (α2β2S) está formada por 2 cadenas α normales y dos cadenas β mutadas. Este
cambio de aminoácido en la cadena β permite diferenciar a la HbS de la HbA normal (α2β2A)
realizando una electroforesis sobre acetato de celulosa en un buffer de pH: 8,6.
(https://www.youtube.com/watch?v=ALPi5GUyR1E)
a) Identifique en el siguiente esquema del resultado de la electroforesis la muestra
correspondiente a:
● una persona normal,
● al paciente y
● una persona portadora de anemia falciforme (heterocigota).

b) ¿Qué muestra se utiliza para realizar la electroforesis? ¿Cuál es el soporte utilizado? ¿Qué
otros soportes conoce? Marque sobre el esquema los polos positivo y negativo si las muestras
que se sembraron fueron disueltas en un buffer de pH=8,6.
c) ¿La electroforesis fue realizada en condiciones nativas o desnaturalizantes? Justifique.

4) En los pacientes adultos con anemia falciforme es común encontrar niveles elevados de
hemoglobina fetal (HbF α2γ2). La presencia de niveles elevados de HbF se asocia a un curso
clínico menos severo de la enfermedad debido a que la HbF es un potente inhibidor de la
polimerización de la desoxi-HbS. La HbF forma más de 90 % de la hemoglobina circulante en
el recién nacido, y su síntesis comienza a decrecer a partir del nacimiento y a ser reemplazada
gradualmente por la HbA del adulto, hasta constituir menos de 1 % de la hemoglobina total.

a) Los niveles de expresión de HbF varían considerablemente entre pacientes con anemia
falciforme.
En la siguiente electroforesis puede observarse la muestra de un paciente con niveles
detectables de HbF. Describa cada una de las calles de la corrida indicando a que proteínas
corresponde cada banda e identifique la muestra correspondiente al paciente con anemia
falciforme.
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