LABORATORIO

ANALISIS DE FIJACION MICROBIOLOGICA DE NITROGENO

HUGUES DANIEL CASTILLA DURAN

UNIVERSIDAD FRANCISCO DE PAULA SANTADER

FACULTAD DE CIENCIAS AGRARIAS Y DEL AMBIENTE
PROGRAMA INGENIERIA BIOTECNOLOGICA
MICROBIOLOGIA AMBIENTAL
CUCUTA
2020
 PROCEDIMIENTO
Recuento de microorganismo
diazotróficos por el método
número más probable (NPM)
Partiendo de la muestra de suelo se
preparan diluciones hasta 10-6, a partir
de las diluciones 10-4, 10-5, 10-6 sembrar
por triplicado 0.1 ml de la dilución
correspondiente a cada vial que
contiene 15 ml aproximadamente del
medio NFB. Incubar los viales a 32°C
durante 5 a 7 días y observar la
formación de biopelicula y viraje del
medio de color verde claro a un azul
intenso por la alcalinización del
medio por la formación de amonio
por parte de los microorganismos
fijadores de nitrógeno, esto gracias a
la reacción del indicador de pH azul
de Bromotimol. Interprete luego los
resultados utilizando la tabla de Mc
Craddy.
Técnica de granulos.
Realizan siembras directas de (10 a
12) gránulos de suelo sobre el medio
de cultivo Ashby previamente
atemperado el cual es libre de
nitrógeno, favorable para el
crecimiento de Azotobacter sp y
otras bacterias diazotróficas. Incubar
a 32°C/5 a 7 días.
Realice observaciones de colonias
típicas de Azotobacter sp, las cuales
tienen un aspecto brillante, son
circulares convexas, de color verde,
negro o café, de ser necesario
purifique colonias sospechosas de
Azotobacter sp, que al realizar tinción
de Gram respondan como bacilos o
cocobacilos aislados o en pareja,
Gram negativos y formadores de
quistes, los cuales se relacionan con
la resistencia de la bacteria a las
condiciones ambientales.
La fijación biológica de nitrógeno molecular la lleva acabo diversos géneros de
bacterias de la vida libre, algunas de estas se encuentran en la rizosfera en vida
libre y otros géneros bacterianos forman asociaciones mutualistas con plantas.
Las bacterias fijadoras de nitrógeno presentan una amplían diversidad
taxonómica, con diferentes estilos de vida y asociaciones con los vegetales. Sin
embargo solo una pequeña porción de especies es capaz de hacerlo , 87 especies
en dos géneros de arqueobacterias, 38 bacterias y 20 géneros de cianobacterias
se han identificado como microorganismos diazotroficos.La fijación biológica de
nitrógeno esta catalizada por el complejo enzimático nitrogenasa. El complejo de
la enzima tiene dos coproteínas, la proteína I contiene hierro y molibdeno y la
proteína II contiene solamente hierro, aunque se han encontrado una enzima
alterna de Azotobacter vinelandii que contiene vanadio.
Las bacterias diazotróficos simbióticas son aquellas que son capaces de fijar
nitrógeno atmosférico en simbiosis con las raíces de plantas. Estas raíces poseen
pequeños engrosamientos llamados nódulos que contienen bacteroides o rizobios,
en esta alianza, la planta suministra nutrientes y protección, mientras que el
rizobio proporciona a la planta nitrógeno fijado de la atmósfera. Por ejemplo,
Rhizobium leguminosarum y cepas fotosintéticas de Bradyrhizobium se han
encontrado en raíces de arroz. Rhyzobium ettli en raíces de maíz. La familia
Azotobacteraceae pertenece a la subclase gamma de las proteobacterias, está
compuesta por bacterias fijadoras de nitrógeno de vida libre que comúnmente
habitan en suelo, agua y sedimentos.

Estudios de DNA ribosomal 16s han identificado dos géneros en esta familia,
Azotobacter y Azomonas El género Azotobacter se diferencia de Azomonas por la
presencia de quistes, pero no se puede diferenciar. Morfológicamente de muchos
otros géneros de bacterias diazotrófas como Azospirillum y Beijerinckia;
comprende siete especies: A. chroococcum, A. vinelandii, A. beijerinckii, A.
paspali, A. armeniacus, A. nigricans y A. salinestris. El género Azomonas
comprende tres especies: A. macrocytogenes, A. agilis, y A. insignis. Los
miembros de esta familia Azotobacteraceae tienen la capacidad de sintetizar
antibióticos y generar sustancias promotoras del crecimiento vegetal, además de
fijar nitrógeno no simbióticamente, especies como A. chroococcum y A. vinelandii
son utilizadas como bioinoculantes en suelos tropicales y alcalinos. Igualmente,
muchos miembros de la familia Azotobacteraceae son utilizados para producción
de compuestos de interés comercial como polisacáridos, vitaminas y pigmentos.

El aislamiento de microorganismos en medios libres en nitrógeno, como Ashby,

Nfb y JMV, constituye un primer paso hacia la identificación de bacterias con
capacidad para fijar nitrógeno. Las características claves de los microorganismos
o de bacterias relacionados con el suelo y su importancia. Encontramos algunas
bacterias que habitan en suelo que son:
Bradyrhizobium sp
Bradyrhizobium es un género de bacterias del suelo, Gram negativas, muchas de
las cuales fijan nitrógeno del aire.
El género Bradyrhizobium forma simbiosis con leguminosas de origen tropical,
presenta un crecimiento lento en vida libre y los genes relacionados con la fijación
son cromosómicos.

Azospirillum sp
Azospirillum es un género de bacterias gran negativas de vida libre capaz de fijar
el nitrógeno. Ha sido conocida por muchos años como promotor del crecimiento de
las plantas, ya que es un organismo beneficioso para los cultivos. Por ello,
pertenecen al grupo de las rizobacterias promotoras del crecimiento vegetal y han
sido aisladas de la rizosfera de gramíneas y cereales. Desde el punto de vista de
la agricultura, Azospirillum es un género muy estudiado por sus propiedades. Esta
bacteria es capaz de usar los nutrientes excretados por la planta y se encarga de
la fijación del nitrógeno atmosférico. Gracias a todas estas características
favorables, es incluida en la formulación de biofertilizantes para ser aplicados en
los sistemas de agricultura alternativos.

Rhizobium sp
Rhizobium es un género de bacterias gran-negativas del suelo que fijan nitrógeno
atmosférico. Pertenece a un grupo de bacterias fijadoras de nitrógeno que se
denominan colectivamente rizobio. Viven en simbiosis con determinadas plantas
como por ejemplo frijol o leguminosas en su raíz, después de un proceso de
infección inducido por la propia planta mediante la secreción de lectina, a las que
aportan el nitrógeno necesario para que la planta viva y está a cambio le da cobijo.
Más específicamente, la condición de simbiosis viene dada por la formación de
una molécula de transporte de oxígeno, equivalente a la hemoglobina, llamada
Leghemoglobina. Solo se puede sintetizar cuando los dos organismos se
encuentran en simbiosis; por parte de la bacteria se sintetiza el grupo Hemo de
dicha molécula, y por parte de la planta se sintetiza la apoproteína. Así, mediante
la nueva molécula formada, se puede llevar a cabo el transporte de oxígeno
necesario para el metabolismo de la bacteria y así poder fijar el nitrógeno
requerido por la planta.
Importancia en el Suelo
La simbiosis entre Rhizobium y las leguminosas tiene una gran importancia tanto
en la agricultura, como en el medio ambiente. En cuanto a la agricultura, se dice
que se ve beneficiada ya que causa un aumento significativo de nitrógeno
combinado en suelos desnudo y que carecen de este. Además, las leguminosas,
parte esencial de la agricultura, se ven favorecidas al poder crecer en zonas
donde otras plantas no podrían. Por otro lado, ya que el nitrógeno es uno de los
nutrientes esenciales limitados para el crecimiento de las plantas, esta simbiosis
aumenta el nivel de fijación del nitrógeno atmosférico, aumentando así la
producción agrícola. También beneficiaria a la agricultura económicamente, pues
debido a que muchas industrias agrícolas dependen de la cosecha de
leguminosas, el hecho de que estas puedan crecer sin abonos nitrogenados pues
la bacteria los remplazaría. Hace que sea posible el ahorrarse millones en abonos.
En cuanto a la parte ambiental, los fertilizantes son uno de los principales
causantes del deterioro ambiental, pues causan la eutrofización de masas de
aguas, la erosión de suelos y generación de lluvias ácidas. Estas bacterias
fijadoras de nitrógeno pueden ser utilizadas en remplazo de los fertilizantes
nitrogenados para incrementar el crecimiento de las leguminosas, acabando con
los problemas ambientales que se han venido causando.

Las plantas tienen una relación muy estrecha con las bacterias, debido que las
plantas no pueden adquirir ciertos elementos que se encuentran en el medio
ambiente, como el nitrógeno que sería imposible para las plantas aprovecharlo por
ellas mismas, es donde nace un término nódulos que es la asociación entre las
raíces de las plantas y las bacterias.Encontramos especies de bacterias del
género Azotobacter sp y su importancia en los suelos agrícolas. Como se
identifican, explique las técnicas o procedimientos.

AZOTOBACTER CHROOCOCCUM:

Sobre medios libres de nitrógeno esta bacteria forma colonias

mucilaginosas pardas las cuales aparecen a las 48 horas a 30 °C. A.
chroococcum presenta colonias mucosas opacas, inicialmente el color del
pigmento es claro y brillante, pero a medida que la colonia se desarrolla se
torna de color café oscuro, la fuente principal de carbono es el manitol A.
chroococcum puede llegar a crecer en un pH alrededor de 5,5.
Esta bacteria puede utilizar diferentes fuentes de nitrógeno inorgánico como
amonio, nitrato, nitrito o dinitrógeno, este microorganismo realiza la
asimilación de nitrógeno en tres pasos: transporte del nitrato dentro de la
célula, reducción del nitrato a nitrito y la reducción de nitrito a amonio, sin
embargo, estos pasos requieren de dos condiciones nutricionales, la
ausencia de amonio y la presencia de nitrato o nitrito. Además de la fijación
de nitrógeno y excreción de amonio al medio, esta especie tiene la
propiedad y la capacidad de biodegradar compuestos tóxicos y
contaminantes; tener efecto antagónico con patógenos Hongos y
Nematodos, en cultivos agrícolas, solubilizar fosfato tricálcico y producir
fitohormonas.

AZOTOBACTER VINELANDII:

Esta bacteria ha sido y es objeto de estudio en biofertilización y

biotecnología incluyen la fijación de nitrógeno en presencia de oxígeno por
tres sistemas diferentes de nitrogenasa; presencia de mecanismos de
protección de la nitrogenasa A. vinelandii fija nitrógeno en aerobiosis
gracias a que posee un sistema bien integrado de protección de su
nitrogenasa que comprende: protección conformacional, protección
respiratoria, autoprotección y otros cambios morfológicos y fisiológicos que
le permiten crecer diazotróficamente en condiciones totalmente aeróbicas;
posee tres tipos de nitrogenadas diferentes para la fijación de nitrógeno; la
nitrogenasa 1 codificada por el gen nifHDK, la nitrogenasa 2 es dependiente
de vanadio y los genes que codifican para las dos proteínas están
designados con el nombre de vnf y se encuentran en los operones
vnfHorfFd y vnfDGK y la nitrogenasa 3 la cual es fabricada en condiciones
deficientes de molibdeno y vanadio esta codificada por el gen anfHDK.

Las pruebas empleadas se basaron en la utilización de cuatro azúcares,

benzoato y fenol como fuente de carbono, prueba de la catalasa, prueba de
Nessler, hidrólisis de almidón y producción de ácido 3- indolacético. Estas
pruebas bioquímicas se utilizaron ya que permiten diferenciar el género
Azotobacter de otras bacterias fijadoras de nitrógeno a simbióticas. Cabe
destacar que el Nitrógeno, además de ser un componente importante de
aminoácidos, proteínas, ácidos nucleicos, enzimas y clorofila, contribuye al
crecimiento y vigor de las plantas, razón por lo cual, la presencia de
bacterias diazotróficas (fijadoras de nitrógeno) en un suelo, determina una
buena calidad del suelo con interés agrícola.

Caso: en una finca de un cultivo de yuca se este presentando la siguiente

anomalía, después de sembrar la yuca el campesino nota que la yuca en
sus raíces no produce los tubérculos o yuca por decirlo vulgarmente y las
plantas no estan creciendo rápidamente. ni esta o teniendo los nutrientes
necesarios para formar la yuca, el campesino se asesora con un ingeniero
biotecnológico, el le comenta que sus suelos pueden tener poca vida
microbiana útil para el desarrollo de sus plantas, le recomienda hacerle un
análisis del suelo del cultivo y hacer un muestreo de su suelo. El ingeniero
procede a tomar la muestra y a llevarla al laboratorio.
El ingeniero le explica al cultivador o dueño del cultivo que él análisis de
muestran que el suelo donde está el cultivo no presenta algunas bacterias
necesarias, que su asociación con la planta le ayudan a su desarrollo y a utilizar
algunos elementos que serían imposibles para la planta obtenerlos por sí sola, Él
le pregunta al ingeniero cuales bacterias pueden ser útiles para su cultivo y que
la yuca se forme y crezca rápido el ingeniero le nombra y le anota en un papel,
bacillus sp, Rhizobium sp, Bradyrhizobium sp ,Pseudomonas, Azotobacter,
Azospirillum, Clostridium, Thiobacillus y Rhyzobium que habitan en el suelo
y forman una asociación con las raíces de las plantas, actinomicetos para la
aplicación de compost debido que son utilizados en el compostaje para el
proceso de humificación, el ingeniero le propone hacerle al campesino un cultivo
puro de estas bacterias, el cual el rociara en su cultivo de cuya.

BIBLIOGRAFIA:
Himedialabs.com (agar Ashby)
Revista de biología tropical (2009). Volumen 57. José Dec
Philippot, L y J.C. Germon. 2005. Contribution of bacterial to initial input and
cycling of nitrogen in soils
Ríos S. 2014. Número más probable (NMP) extraído de:
http://microbiologia3bequipo5.blogspot.com/2014/10/numero-mas-probable-
nmp.html

Dobereiner et al. 1995. Como isolar e identificar bacterias diazotróficas de plantas

não-leguminosas. Brasília: Embrapa-SPI, 1995. 60 p.   

Flores, Carolina & Rodríguez, Raúl. (2014). Azotobacter: una bacteria con
potencial como biofertilizante eco-amigable. Extraído de:
https://www.researchgate.net/publication/274638111_Azotobacter_una_bacteria_c
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[José de J. López-Alcocer, 2017]

https://www.revistafitotecniamexicana.org/documentos/40-1/8a.pdf

[Mariana Gelambi, 2011] https://www.lifeder.com/rhizobium/