NanoImpact 19 (2020) 100239

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Trabajo de investigación

Desentrañar la vía de absorción y la acumulación de plata a partir de nanopartículas de plata

fabricadas en el anfípodo de agua dulce Hyalella azteca usando microscopía correlativa

Sebastián Kuehr a , B , Jessica Klehm C , Claudia Stehr C , Matthias Menzel C ,

Christian Schlechtriem a , B , D , •
a Instituto Fraunhofer de Biología Molecular y Ecología Aplicada IME, Schmallenberg, Alemania
B Departamento de Química y Biología, " Ecotoxicología " Grupo de trabajo, Universidad de Siegen, Siegen, Alemania
C Instituto Fraunhofer de Microestructura de Materiales y Sistemas IMWS, Halle, Alemania
D Instituto de Investigación Ambiental, RWTH Aachen, Aquisgrán, Alemania

INFORMACIÓN DEL ARTÍCULO RESUMEN

Editor: Chunying Chen Se sabe que las nanopartículas de plata (AgNP) ingresan al medio acuático a través de los lixiviados de la tierra. fi lls o por la e ffl uentes o lodos de plantas de

Palabras clave:
tratamiento de aguas residuales.

Nanopartículas de plata Incluso si los AgNP son sul fi Se demostró que el Ag de estas partículas todavía está disponible para varias especies, como el anfípodo bentónico de agua
Biodisponibilidad dulce. Hyalella azteca. Sin embargo, todavía se desconoce si la captación primaria de Ag de estas partículas ocurre principalmente por iones Ag, o si la captación
Bioacumulación principal de Ag es por ingestión de AgNP y si se pueden encontrar en los tejidos animales o simplemente en el contenido intestinal sin cualquier transferencia de
Micrsocopia correlativa tejido.
Hyalella azteca
Para dilucidar la principal vía de captación y localización de los AgNP potencialmente absorbidos por H. azteca, nosotros
expuso los anfípodos a Ag utilizando AgNP que contiene lodos de depuradora o Ag disuelto de AgNO 3.
Además, separamos a los animales expuestos en dos grupos. Uno tuvo contacto directo con los AgNPs enriquecidos
lodo, lo que les permite alimentarse de él, el segundo grupo separado del lodo por un colador que permite sólo el contacto indirecto de los AgNP o
iones potencialmente liberados.
Los animales expuestos durante 7 días se examinaron para determinar su contenido de Ag total y nanopartículas usando espectrometría de masas de plasma
acoplado inductivamente (de una sola partícula) así como usando métodos de microscopía correlativa. De esta manera pudimos demostrar que cantidades bajas de
AgNP estaban presentes exclusivamente en animales con contacto directo con el lodo enriquecido con AgNP y solo en la región del intestino. No se observó
transferencia de AgNP desde el intestino al tejido de los animales mediante microscopía correlativa. Sin embargo, las cargas corporales medibles de Ag en animales
de todos los tratamientos y grupos indicaron que la captación iónica es la principal vía de captación para la (bio) acumulación de Ag de los AgNP.

1. Antecedentes
Existe una tendencia creciente para el uso de nanopartículas (NP) en diferentes sectores como
industrias electrónicas, dispositivos médicos, ropa y más ( Comisión Europea, 2013 ; Future Markets
Inc, 2017 ). El número de productos que contienen NP se multiplicó por 25 entre 2005 y 2010, lo que
provocó un mayor impacto en el medio ambiente ( Bundschuh et al., 2018 ; PEN, 2013 ). Una cantidad
baja ( ≤ 2%) de los NP fabricados que entran al medio ambiente se libera durante la producción o el
desperdicio ( Adam y Nowack, 2017 ). Una vez depositado en tierra fi Si los residuos sólidos liberan los
AgNP con el tiempo y pueden llegar al medio ambiente a través de lixiviados ( Bundschuh et al., 2018 ).
El otro 50% de los AgNP que llegan al medio ambiente proceden de plantas de tratamiento de aguas
residuales ( STP ) ( Adam y Nowack, 2017 ), incluso si la parte principal es adsorbida por los lodos de
depuradora ( Kaegi et al., 2011 ; Schlich y col., 2013 ).
Como se describe ampliamente, los AgNP se transforman principalmente en sulfuro de plata.

procesamiento posterior de los NP ( Gottschalk y Nowack, 2011 ). La mayor parte de las NP entra al
medio ambiente mediante procesos de gestión de residuos. En el caso de NP de plata ( AgNPs ) El
50% de los NP llegan al medio ambiente como residuos sólidos como textiles o embalajes.
phide (Ag 2 S) al pasar por la planta de tratamiento de aguas residuales ( Burkhardt y col., 2010 ; Impellitteri
et al., 2013 ; Kaegi et al., 2011 ;
Kaegi et al., 2013 ; Kampe y col., 2018 ; Kraas et al., 2017 ; Levard et al., 2012 ; Lombi et al., 2013 ). De
esta forma, el Ag es difícilmente soluble y debido a la liberación reducida de Ag + y la tendencia
decreciente a generar radicales reactivos de oxígeno en el sur fi AgNP modificados y, por tanto,
pasivados

• Autor para correspondencia en: Instituto Fraunhofer de Biología Molecular y Ecología Aplicada IME, Auf dem Aberg 1, 57392 Schmallenberg, Alemania.

Dirección de correo electrónico: christian.schlechtriem@ime.fraunhofer.de (C. Schlechtriem).

https://doi.org/10.1016/j.impact.2020.100239
Recibido el 24 de febrero de 2020; Recibido en forma revisada el 4 de julio de 2020; Aceptado el 6 de julio de 2020

On-line el 15 de julio de 2020

2452-0748 / © 2020 El autor (es). Publicado por Elsevier BV Este es un artículo de acceso abierto bajo la licencia CC BY-NC-ND
(http://creativecommons.org/licenses/BY-NC-ND/4.0/).
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superficie, los AgNP son menos tóxicos que los AgNP prístinos o los iones Ag + disueltos (Ag +) ( Bianchini Se demostró que los AgNP eran metálicos, todavía de tamaño comparable al de los AgNP prístinos
y Wood, 2008 ; Bianchini et al., 2002 ; Choi y Hu, 2008 ; Kim et al., 2009 ; Liu y Hurt, 2010 ; Reinsch et
al., 2012 ;
Oeste, 1996 ). Sin embargo, di ff entes estudios han demostrado que sul fi Los AgNPs o Ag de estas
partículas transformadas todavía están biodisponibles para las plantas ( Kraas et al., 2017 ),
nematodos ( Starnes et al., 2016 ), isópodos terrestres ( Kampe y col., 2018 ) así como para anfípodos
de agua dulce como
Hyalella azteca ( Kühr et al., 2018 ). H. azteca es endémica de América del Norte y Central y se utiliza
regularmente para pruebas de ecotoxicidad y bioacumulación, principalmente en metales ( Alves et
al., 2009a ; Kühr et al., 2018 ;
Nuutinen y col., 2003 ; Othman y Pascoe, 2001 ; Raths et al., 2020 ;
Schlechtriem et al., 2019 ). Debido al hecho de que las plantas de tratamiento de aguas residuales
(STP) son la vía principal para que las NP ingresen al medio acuático, los estudios de exposición
crónica con H. azteca se llevaron a cabo sobre la acumulación de plata de AgNPs en planta de
tratamiento de aguas residuales e ffl uentes Kühr et al., 2018 ). Se demostró que la acumulación de
plata en el cuerpo de los animales de prueba depende claramente del pretratamiento de los AgNP.
Se supone que la acumulación de iones de plata (Ag +) liberados por los AgNP es la vía principal que
conduce a la carga corporal observada ( Kühr et al., 2018 ). Sin embargo, solo se puede especular si
los AgNP ingeridos también son biodisponibles y cómo y en qué medida contribuyen a la carga
corporal, en contraste con Ag +.
En este estudio, las pruebas de exposición con Hyalella azteca se llevaron a cabo para dilucidar
la principal vía de captación, así como la forma y localización del Ag presente en los animales. El
sistema de exposición utilizado en un estudio anterior ( Kühr et al., 2018 ) se ajustó para permitir
investigaciones sobre la absorción de Ag por H. azteca ya sea por contacto directo o indirecto con
lodos de depuradora de un modelo STP que contiene Ag / AgNPs. Además, un
de la suspensión madre NM 300 K, pero completamente
transformado en Ag 2 S según Kampe y col. (2018) .
Un lote de lodo de un ciclo de STP tratado con AgNP (S L), y
lodo puro de una ejecución STP de control (S 0) se suspendieron en agua UHQ para la preparación de
alimentos fi ltros para las pruebas de exposición (para más
información ver SI SA.). Todas las suspensiones de lodos se homogeneizaron utilizando un dispersor
(IKA ® T25 digital ULTRATURRAX ®) y se agita durante 3 h antes de ser fi filtrado a través de vidrio
micro fi ber fi ltros (Whatman ® GF 6, 50 mm) utilizando una bomba de vacío (Vacobox, KNF) como se
describe en ( Kühr et al., 2018 ) para lograr una carga de 50 a 80 mg (masa seca). El cargado
fi Los filtros se congelaron y almacenaron a - 20 ° C antes de su uso.
2.3. Hyalella azteca
El anfípodo de agua dulce H. azteca fue tomado del cultivo de stock de Fraunhofer IME,
Schmallenberg. La cepa se obtuvo originalmente de " Freds Haustierzoo "( Colonia, Alemania). El
procedimiento de cultivo se llevó a cabo de acuerdo con ( Kühr et al., 2018 ) utilizando agua
reconstituida que contiene bromuro ( Alves et al., 2009b ). El cultivo madre se mantuvo en 2 L fl pregunta
fi lleno de agua reconstituida que contiene bromuro ( Alves et al., 2009b ), cada uno con 30 animales
adultos. Tres veces por semana, 5 mg de tierra fi alimento para peces (tetramina ®, Se añadieron tetra)
a cada vaso de precipitados para mantener un crecimiento óptimo de los animales de prueba. Se
añadió un pequeño trozo de gasa (3 × 3 cm) para proporcionar un lugar de refugio. Los juveniles se
separaron de los animales parentales una vez a la semana para cultivarlos por separado hasta su
uso en las pruebas. En estos estudios solo se utilizaron anfípodos sanos libres de enfermedades y
anomalías observables.

parison entre animales expuestos a AgNO 3 Se llevó a cabo a concentraciones de Ag acuosas

comparables a las encontradas en los estudios con AgNP. los
2.4. Primer estudio de exposición (7d)
los animales expuestos se examinaron para determinar su carga corporal total de Ag y se calcularon
los factores de acumulación teniendo en cuenta las concentraciones de Ag en el agua. Se
los fi El primer estudio de exposición con NM 300 K se realizó con animales adultos (al menos 8
examinaron más animales para determinar la presencia de AgNP en el tejido animal. Se utilizaron
semanas de edad). En esta prueba se comparó un tratamiento con Ag y un tratamiento de control ( tabla 1 ).
métodos suaves para i) extracción de AgNP del tejido animal para permitir investigaciones mediante
Cada tratamiento consistió en 5 grupos de prueba con 20 adultos H. azteca cada uno guardado en vasos
espectroscopía de masas de plasma acoplado inductivamente de una sola partícula (spICPMS) y
de precipitados de vidrio de 600 mL fi lleno con 500 ml de agua del grifo reducida en cobre ( Figura 1 ). En
para ii) incrustación de los animales para exámenes por microscopía correlativa.
cada vaso de precipitados, un grupo adicional de 5 animales adultos se separó del grupo principal
mediante un colador de acero inoxidable. El grupo dentro del colador

fue alimentado con lodos de control (S 0), mientras que el grupo principal fuera del colador
2. Materiales y métodos
fue alimentado con lodos tratados con AgNP (S L). Los animales fueron expuestos durante 7 días sin
intercambio de agua. El lodo cubierto fi Se agregaron filtros a
2.1. Manipulación de AgNP y preparación de la suspensión madre de NP
los vasos de precipitados 24 h antes de que se añadieran los animales para permitir la liberación de
iones Ag + en el medio, incluso si el tiempo era demasiado corto para permitir que el sistema se
NM 300 K, un ensayo representativo y material de referencia del Centro Común de Investigación
equilibrara. Muestras de agua ( n = 3, cada 10 ml) para la medición de Ag se tomaron al inicio (antes
de la Comisión Europea y en el ámbito de la
de agregar los animales), el día 4 y al final de la prueba (día 7) del vaso de precipitados cerca del
OCDE Para los estudios se utilizó el grupo de trabajo sobre el programa de patrocinio de
colador. Las muestras de agua se analizaron directamente después de la ultracentrifugación (para
nanomateriales manufacturados. El material fue proporcionado por el Instituto Fraunhofer de Biología
más información, consulte SI SB). los fi se usó ltrado
Molecular y Ecología Aplicada IME. Se puede encontrar información resumida sobre la
caracterización y las propiedades físico-químicas en el Informe del CCI ( Klein et al., 2011 ). La
producción de la suspensión de trabajo de AgNP para ser aplicada al modelo STP y para controlar
tabla 1
los lodos se realizó como se describe en ( Kühr et al., 2018 ). La suspensión madre se diluyó con agua
Contenido de Ag en el lodo [mg Ag / kg] y concentraciones de TWA del medio de prueba [ μ g Ag / L]. Las muestras de
de muy alta calidad ( Agua UHQ ), agitar a mano durante 1 min y sonicar durante 15 min (640 W)
lodo se midieron una vez ( n = 5) para todos los tratamientos / pruebas. *
(Bandelin, Sonorex) para dispersar los AgNP y para
el lodo en el colador era S 0 lodos, ** AgNO 3 solución;

Estudio Tratamiento Matriz TWA en Concentración en lodos

medio [ μ gramo [mg Ag / kg]
homogeneizar la suspensión. AgNO 3 ( pureza> 99,9%) se compró como una sal de Carl Roth y se
Ag / L]
disolvió y diluyó usando
agua de calidad (agua UHQ) para preparar el AgNO 3 solución de reserva. Exposición S0 -
Medios de comunicación

estudio yo Lodo 1,17 ± 0,05

SL 5.11
Medios de comunicación
2.2. Exposición a lodos de depuradora y preparación de la alimentación. fi ltros
Lodo 7303 ± 873 *
Exposición S0 -
Medios de comunicación

Para nuestro estudio utilizamos el mismo lodo de depuradora que utilizó Kampe y col. (2018) de estudio II Lodo 1,17 ± 0,05
SL 16,74
Medios de comunicación
una simulación STP a escala de laboratorio según OECD TG 303A ( Organización para la
Lodo 7303 ± 873 *
Cooperación y el Desarrollo Económicos (OCDE), 2001 ). El lodo se examinó mediante microscopía
AgNO 3 5.41 **
Medios de comunicación
electrónica de transmisión ( TEM ) utilizando espectroscopia de rayos X de dispersión de energía ( EDX Lodo 1,17 ± 0,05
). Eso

2
S. Kuehr y col.
Figura 1. Resumen esquemático del escenario de exposición que incluye dos grupos de H. azteca, separados por
un colador para proporcionar contacto directo (inferior) o solo indirecto (superior) a los AgNP presentes en los lodos
de depuradora cargados en vidrio fi ber fi ltro. El grupo dentro del filtro se alimentó con lodo de control.
para medir la concentración de Ag +, mientras que fi El residuo del filtro se analizó para determinar su
contenido de Ag como indicación de AgNP en la fase acuosa. Los animales se recogieron al final de
la fase de exposición, se congelaron con nitrógeno líquido y se almacenaron a - 80 ° C hasta la
preparación histológica para microscopía correlativa y mediciones mediante espectrometría de
masas de plasma acoplado inductivamente ( ICP-MS ) como se describe abajo. La medición del
contenido total de Ag de las muestras de agua se realizó antes y después de ultra fi filtración. Solo las
muestras de agua para la medición del contenido total de Ag fueron ácidas fi ed agregando 200 μ L de
ácido nítrico (69%, grado suprapure, Roth).
2.5. Segundo estudio de exposición (7d)
Se llevó a cabo una segunda prueba de exposición en condiciones similares a las descritas
anteriormente, pero que incluyó un tratamiento adicional con control
sólo lodo. En este tratamiento AgNO 3 La solución se aplicó como medio de prueba acuoso reflejando
la concentración promedio ponderada en el tiempo de
Ag en el agua medida durante el fi primera prueba de exposición con lodos
que contienen AgNPs (S L) ( concentración nominal de Ag: 5.11 μ g / L). Los animales y las muestras de
agua recolectadas durante el estudio se manejaron como
anotado antes. Más vasos de precipitados replicados ( n = 3) se utilizaron para el examen con
ICP-MS de partícula única (spICP-MS). Los animales se congelaron con nitrógeno líquido y se
almacenaron a - 80 ° C. Se tomaron muestras de agua (10 ml, n = 3 para cada tratamiento y punto de
muestreo) para la medición de Ag total al inicio (antes de agregar los animales), al día 4 y al final de
la prueba (día 7) desde el interior del colador. y desde fuera cerca del fondo del vaso. Las muestras
de agua se prepararon y midieron como se describe anteriormente directamente y después de ultra fi filtración.
Muestras de agua para análisis usando spICP-MS ( n = 3 para cada tratamiento y punto de muestreo)
se tomaron al inicio de la prueba del medio fresco y al final del ensayo del medio envejecido, y se
midieron directamente después del muestreo.
2.6. Determinación de las concentraciones de plata total en los medios de prueba acuosos, lodos de depuradora y
muestras de Hyalella azteca
Se prepararon muestras recolectadas de medios de prueba acuosos y se
3
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analizados según lo descrito por Kühr et al. (2018), para más información ver SI SB. Para medir el
contenido total de Ag de los lodos de depuradora cargados en vidrio fi ber fi ltros, bisturíes desechables
(Braun, Cut fi X ®) se utilizaron para eliminar muestras de lodo de la fi superficie del ltro n = 5 por cada
tratamiento; uno solo fi ltro = una réplica). El análisis de las concentraciones totales de Ag en lodos de
depuradora y Hyalella azteca ( n = 5 para cada tratamiento; cada réplica contenía de 15 a 18 animales
agrupados) recolectados durante los estudios se llevaron a cabo de acuerdo con Kühr y col. (2018) y ( Wasmuth
et al., 2016 ) (para obtener más información, consulte SI SC). El análisis de las concentraciones
totales de Ag en el lodo sólo se realizó antes de la exposición.
2.7. Examen de tejido de Hyalella y medios de prueba acuosos mediante ICP-MS de partícula única
Para el examen de Hyalella tejido mediante ICP-MS de partícula única (spICP-MS) se aplicó un
método de preparación de muestras suave que no disuelve las partículas y que ff afecta las
propiedades de las partículas lo menos posible. Para ello, las muestras de tejido ( n = 3 para cada
tratamiento) se digirieron utilizando la enzima proteinasa K según el método descrito por ( Loeschner
et al., 2013 ) y ( Schmidt y col., 2011 ). Los animales secos (10 animales agrupados por réplica) se
transfirieron a un vaso de precipitados de vidrio de 50 ml y se presionaron suavemente con una
varilla de vidrio para destruir el carapax y permitir que la enzima ingresara al cuerpo y digerir las
proteínas. La varilla de vidrio se enjuagó con 10 mL de la solución de digestión (45 mg de
Teinase K en 1 L bu ff solución er + 0,5% SDS + 50 mM NH 4 HCO 3, pH ajustado a 8.0 - 8.2) que se
obtuvo del vaso de precipitados
Mantener las muestras de tejido trituradas para minimizar la pérdida potencial de plata a través de la
varilla de vidrio. Las muestras se incubaron en la solución de digestión de 10 mL durante 3 ha 50 ° C
y 100 rpm. Este proceso tiene un impacto nulo o insignificante en la disolución y distribución del
tamaño de las NP NM 300 K ( Kuehr et al., 2020 ). La solución de digestión incubada fue
fi filtrado usando 0.45 μ m jeringa fi ltros (Minisart ® NML, 0,45 μ m) antes del análisis. El análisis de
sp-ICP-MS utilizando un ICP-QQQ-MS (Agilent 8900, Agilent Technologies, Waldbronn, Alemania) se
llevó a cabo como describe ( Kuehr et al., 2020 ) (para más información, consulte SI SD). Debido a los
controles de calidad analítica deficientes y a la digestión incompleta de los tejidos animales, los
valores cuantitativos de los números de partículas solo pueden verse como una evaluación
aproximada, para dilucidar la di ff erences en partícula
concentraciones en el di ff diferentes tratamientos (por ejemplo, AgNO 3 vs S L- medio o tejido). Después de
la medición de las concentraciones de partículas en el digerido
fracción utilizando sp-ICP-MS, la fi La solución filtrada se digirió adicionalmente con agua regia para
permitir el análisis del contenido total de Ag. Para la digestión, se agregaron 2 mL de agua regia a 5
mL del fi solución filtrada antes de la digestión en un microondas como se describe anteriormente
(turboWave ® Inerte, MLS; temperatura máxima 220 ° C, presión máxima 40 bar). Solo la mitad de los
animales recolectados se procesaron y analizaron como se describe anteriormente. La parte de las
muestras no digerida enzimáticamente ( n = 3, cada uno de los cuales consta de 10 animales
agrupados) también se digirió utilizando agua regia (8 ml) utilizando el mismo método de microondas.
Ambas soluciones obtenidas se midieron por su contenido total de Ag. Esto permitió comparar el
contenido de Ag en la fracción de proteína de los animales con la cantidad total de Ag de las
muestras completas (incluidos los AgNP adheridos al caparazón, etc.). Las muestras de medios
acuosos recolectadas durante los estudios se midieron siguiendo el mismo procedimiento pero sin
digestión enzimática.
2.8. Imágenes de AgNP en Hyalella azteca por microscopía correlativa
Microscopía correlativa, combinando el poder y las ventajas de di ff Los diferentes sistemas de
imágenes, por ejemplo, microscopía óptica, microscopía electrónica, rayos X, etc., se han convertido en
una herramienta importante para las ciencias de la vida y los materiales durante los últimos años.
Usando microscopía correlativa, se puede obtener información adicional en el mismo sitio de muestra
porque di ff Se puede asignar y diferenciar espacialmente información complementaria diferente. ff diferentes
órdenes de magnitud relacionados con la resolución y la imagen fi El campo se puede grabar ( Caplan et
al., 2011 ; Loussert Fonta y Humbel, 2015 ). La microscopía electrónica proporciona alta resolución pero
tiene una limitación central
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con un restringido fi campo de visión. La microscopía óptica tiene la ventaja de tener una gran fi campo
de visión que permite identificar fi catión y localización de estructuras a baja magni fi catión Loussert
Fonta y Humbel, 2015 ). La combinación de estas dos técnicas de imágenes es un enfoque valioso
para investigar estructuras a un nivel submicrométrico en la investigación biológica ( Bradley y
Withers, 2016 ; Guérin et al., 2019 ; Verkade y Collinson, 2019 ).
Tecnai G2 F20). El identi fi Las áreas ed se disecaron con un ultramicrotomo [equipo RMC
PowerTome PT-PC con criocámara CRX (RMC, Tucson)] con un cuchillo de diamante (ángulo
DIATOME 35 °) para generar secciones ultrafinas de 50 nm. Posteriormente, se realizaron
investigaciones TEM en combinación con análisis EDX para la detección de nanopartículas de plata
(EDX Nanospot). Para cada muestra se examinaron al menos 3 imágenes y cada región de interés
(ver más abajo) se examinó al menos 3 veces.

En este estudio, se utilizó microscopía correlativa para obtener imágenes morfológicas de

nanopartículas de plata en H. azteca. Después de la preparación adecuada de la muestra, se
llevaron a cabo investigaciones a nivel de macrómetro a nanómetro combinando técnicas
2.9. Análisis de los datos
microscópicas y radiografías ff Análisis de acción (micro tomografía computarizada). Esto permitió la
evaluación del estado de las estructuras tisulares después de la preparación por di ff diferentes
El software de análisis de datos Origin (OriginLab Corporation; OriginPro 2017G) se utilizó para
técnicas, así como la obtención de imágenes de la morfología de las nanopartículas y la detección de
el análisis de varianza ( ANOVA ) para los datos obtenidos en el di ff erent estudios. Todos los datos se
su localización. Adicionalmente, se aplicó EDX para el análisis elemental o caracterización química
sometieron a una prueba de valores atípicos (SQS 2013 Versión 1.00 de J. Kleiner y G. Wachter).
de las muestras. Para una descripción esquemática de la micrcoscopia correlativa, ver SI Fig. S1.
Replica identi fi ed como un valor atípico se excluyeron del análisis de datos adicional.
Concentraciones medias ponderadas en el tiempo ( TWA ) de Ag en la fase acuosa del di ff Se
calcularon tratamientos para los ex-
Para tener una idea de la morfología de las nanopartículas utilizadas en este estudio, SEM Se
llevaron a cabo investigaciones sobre la materia prima (Fig. S2). Para ello se diluyeron las
periodos experimentales. Factores de acumulación (AF METRO) se obtuvieron dividiendo las
nanopartículas de Ag (100 μ g / L), dispersado mediante ultrasonido y aplicado a un portaobjetos de
concentraciones totales de Ag en los anfípodos por el valor TWA
vidrio para investigaciones SEM. Se determinó que el diámetro de las nanopartículas de Ag estaba
centraciones del medio de prueba AF METRO . Debido a la falta de evidencia para obtener condiciones
entre 18 y 20 nm.
de estado estacionario durante los estudios de exposición, la
FA culada METRO los valores no son necesariamente fl ect condiciones de equilibrio.
Se desarrolló un protocolo de preparación de muestras adaptado para permitir investigaciones
mediante microscopía correlativa ( Mulisch y Sauer, 2015 ). Los animales experimentales fueron
3. Resultados
embebidos en polimetilmetacrilato ( PMMA ). Durante el proceso de inclusión, se aplicó una técnica de
tinción. Se probaron dos protocolos de tinción basados en tetróxido de osmio o yodo.
3.1. Primeras pruebas de exposición

En el fi Primera prueba de exposición (7d) con S L lodo (7303 ± 873 mg Ag / kg) una
Las muestras incrustadas ( n = 10 para cada tratamiento, animales individuales) se examinaron
concentración TWA de 5.11 μ se midieron g Ag / L en el agua
posteriormente mediante micro tomografía computarizada (equipo nanome | x 180NF) para evaluar la
( tabla 1 , Tabla S1). En comparación, ninguna concentración de Ag medible
calidad de la incrustación y la macro y microestructura determinada. Se encontró que la tinción con
estuvo presente en los medios de la S 0 tratamiento.
tetróxido de osmio puede causar daños localizados, como cambios estructurales a nivel micrométrico
Animales recogidos al final de la fi primera prueba de exposición (7d) del
( Figura 2 , izquierda). Sin embargo, las muestras teñidas con yodo no mostraron daño y, por lo tanto,
S 0 El tratamiento mostró un contenido de Ag total insignificante ( Figura 8 ) independientemente de si
la tinción con yodo fue el procedimiento preferido utilizado en este estudio ( Figura 2 , derecho).
se mantuvieron en el colador (0,03 ± 0,03 mg Ag / kg) o en
el fondo del vaso de precipitados (0,04 ± 0,03 mg Ag / kg). Los animales que
se mantuvieron en el colador del S L El tratamiento, sin contacto directo con el lodo que contenía Ag /
Para la obtención de imágenes por microscopía óptica y electrónica, se llevó a cabo una
AgNP, mostró una baja carga corporal de Ag de
preparación adicional de la muestra. Secciones delgadas de las muestras incrustadas con un
1,92 ± 0,82 mg Ag / kg. Sin embargo, para los animales con contacto directo
espesor de aproximadamente 80 μ m fueron preparados de acuerdo con la técnica de corte y
a la S L lodos, se midió una alta carga corporal de 201,36 ± 33,25 mg Ag / kg ( Figura 8 ).
molienda de Karl Donath ( Donath, 1995 ). Los cortes fueron analizados por microscopía óptica
(Olympus BX 51) y electrónica de barrido (SEM, equipo Quanta 3D FEG, FEI) para identificar áreas
Los factores de acumulación se calcularon como la proporción de tejido concentrado.
en la estructura morfológica de los animales donde podrían ubicarse las nanopartículas. Estas áreas
centraciones a medio (AF METRO) concentraciones para el fi primera prueba de exposición Tabla 2 ).
fueron posteriormente analizadas por SEM combinado con EDX para detectar y localizar plata. Las
Debido a concentraciones de Ag no medibles en los medios del
imágenes se produjeron utilizando un contraste de material de electrones retrodispersados (BSE)
grupo de control sin FA METRO podría calcularse. Por el contrario, AF METRO Se calcularon valores de 376
en el modo de bajo vacío a un voltaje de aceleración de 10 kV después de un recubrimiento
y 39,404 para el grupo de coladores alimentados con control
conductor con carbono. Se realizó una preparación de muestra adicional para permitir más
lodos y el grupo inferior del S L tratamiento, respectivamente ( Tabla 2 ).
investigaciones mediante microscopía electrónica de transmisión (TEM, equipo FEI

3.1.1. Investigaciones histológicas mediante microscopía correlativa

Dos protocolos de tinción basados en teróxido de osmio o yodo fueron

Figura 2. Comparación de OsO 4 ( izquierda) y técnicas de tinción con yodo (derecha) mediante investigaciones de TC.

4
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Tabla 2 investigado. La inspección de las imágenes SEM mostró que las nanopartículas estaban presentes
AF calculado METRO valores para los grupos de anfípodos en los dos estudios de exposición. en el intestino de los animales con contacto directo
a lodos enriquecidos con AgNP (S L). Por lo tanto, esta región (intestino y contenido intestinal) ( ROI :
Estudio Tratamiento Grupo AF METRO

región de interés) se señaló para futuras investigaciones

Estudio de exposición I S0 Colador - ( Figura 4 ; A).
Fondo -
El análisis con EDX en SEM mostró un pico de Ag en el ROI ( Figura 4 ; C). Esto fue una estafa fi rmed
SL Colador 376
por las investigaciones de TEM a una resolución más alta después de cortar la misma región con un
Fondo 39,404
Estudio de exposición II S0 Colador - ultramicrotomo. Este análisis de nanopuntos indicó una enorme Ag de fl durante el análisis EDX a
Fondo - nivel nanométrico, lo que fi rmed los resultados obtenidos a nivel micrométrico en el SEM ( Figura 5 ).
SL Colador 504
Fondo 21,730
AgNO 3 Colador 363
Fondo 396 Imágenes SEM de H. azteca ( S L tratamiento) con contacto indirecto con Ag durante el fi La primera
prueba de exposición mostró partículas que son similares a las
materia prima de las nanopartículas aplicadas en el intestino de los animales. Sin embargo, esto no
probado para preparar los animales experimentales incrustados para microscopía correlativa. La fue una estafa. fi confirmado por los análisis EDX donde no se detectó plata pero se encontraron
investigación de las muestras teñidas por TC mostró que la tinción con yodo es obviamente más trazas de P y Ca ( Figura 6 ). Esto fue una estafa fi rmed por los análisis de nanopuntos en el TEM ( Figura
adecuada para el mantenimiento del tejido como se describe anteriormente ( Figura 2 ). Debido al 7 ). Solo se observó un pico claro de Cu, que se origina potencialmente en la rejilla de Cu utilizada en
tamaño de los AgNP aplicados, la formación de imágenes de las nanopartículas de Ag en el yodo el trabajo del ultramicrotomo.
teñido H. azteca por CT solo habría sido posible después de la formación de aglomerados. Sin
embargo, esto no se puede fi rmed por las imágenes de CT que indicaron una buena dispersión de los
AgNP potencialmente ingeridos incluso después de la exposición directa a notario público lodos de 3.2. Segunda prueba de exposición
depuradora enriquecidos Fig. 3 , material de video Video S1 y Video S2).

Considerando la concentración de TWA Ag medida en los medios de

la S L tratamiento durante el fi primera prueba de exposición (5.11 μ g Ag / L; Tabla S1)
Usando microscopía correlativa, la morfología de H. azteca desde el nivel macro al nanómetro Se estableció una concentración de medio Ag similar para el AgNO. 3
de las secciones delgadas y ultradelgadas fue tratamiento con 5.41 μ g Ag / L (Tabla S2). Sin embargo, TWA Ag

Fig. 3. Imágenes en 3D después de las investigaciones por TC de teñido con yodo H. azteca. Aglomerados o agregados de NP> 400 μ m habría sido visible como puntos de colores. A:
Hyalella del colador de S L tratamiento; B: Hyalella desde la parte inferior de la S 0 tratamiento; C: Hyalella desde la parte inferior de la S L tratamiento; D: Hyalella del colador del S 0 tratamiento. Comparable con
Video S1.

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Figura 4. Imagen SEM de la región intestinal de H. azteca desde S L tratamiento ( fi primera prueba de exposición) con contacto directo con los lodos enriquecidos con AgNP. ROI marcado (cuadrado rojo) en A: contenido
intestinal 150 x magni fi catión y B: 25000 x magni fi catión de la región del cuadrado rojo de la parte A y espectro EDX (C) con pico de Ag (rojo
flecha, abajo). (Para la interpretación de las referencias al color en este fi leyenda de la figura, se remite al lector a la versión web de este artículo).

concentración de la S L El tratamiento medido en el medio durante la segunda prueba de exposición
fue de 16,74 μ g Ag / L (Tabla S3) y por lo tanto alrededor
tres veces mayor en comparación con el fi primera prueba de exposición. Solo el
muestras del día 7 de la S L el tratamiento mostró un significado fi no puedo di ff erencia en las
concentraciones de los medios entre el fondo y la región del filtro (Tabla S4).
No hubo signi fi no puedo di ff erences en AgNO 3 concentraciones de medios medidas en el fondo o en
el colador (Tabla S5). En ambos tratamientos
En la mayoría de los casos, se suponía que la mayoría de las partículas Ag o Ag + en el medio (alrededor del
99%) estaban unidas a coloides orgánicos o precipitaban como se muestra por las concentraciones de los
medios medidas después de la ultracentrifugación (Tabla S2 y S3). De acuerdo con el fi Primera prueba de
exposición, sin Ag medible
concentración estuvo presente en los medios de la S 0 control del tratamiento de lodos Figura 8 ).
Los animales de control de la segunda prueba de exposición (7d) mostraron concentraciones
2,14 ± 0,27 mg Ag / kg y 1,96 ± 0,46 mg Ag / kg para los animales en el fondo del vaso de
precipitados y en el colador, respectivamente. El Ag
concentraciones en el tejido animal de la S L tratamiento fueron superiores a los de la fi primer estudio
de exposición con 357,91 ± 77,09 mg Ag /
kg y 8,31 ± 2,72 mg Ag / kg medidos en animales con directa y
contacto indirecto (grupo de filtros) al S L- lodos, respectivamente ( Figura 8 ). También durante la segunda
prueba de exposición no hay AF METRO podría calcularse para
los animales de control (alimentados con S 0 solo lodos) debido a las concentraciones de Ag no medibles
en el medio de prueba.
AF METRO Se calcularon valores de 504 y 21,730 para los animales recolectados del S L tratamiento
(colador y fondo, respectivamente).
AF inferior METRO Se determinaron los valores para los dos grupos en el AgNO. 3
tratamiento, con valores similares de 363 y 396 para el colador y
grupos inferiores, respectivamente.

tisulares de Ag muy bajas de 0.03 ± 0.02 mg Ag / kg y

0,18 ± 0,00 mg Ag / kg para los animales en el colador y en el fondo del vaso de precipitados,
respectivamente ( Figura 8 ). Para los animales en el 3.2.1. Medición de Ag total en extractos de proteínas de Hyalella después de la digestión enzimática de

AgNO 3 tratamiento se determinaron concentraciones bajas de Ag en tejido con proteínas.

Al final de la segunda prueba de exposición, un pequeño grupo de animales fue

6
S. Kuehr y col.
Figura 5. A: imagen TEM de ROI después de cortar con ultramicrotom y B: espectro EDX de análisis de nanospot con alto Ag de fl acltion.
recolectados de cada tratamiento (los mismos vasos de precipitados replicados) para ser digeridos
enzimáticamente como se describe para las muestras de sp-ICP-MS. La cantidad total de Ag que se
extrajo con las proteínas de los anfípodos.
cuerpo fue digerido con ácido y determinado usando ICP-OES . Para el AgNO 3
tratamiento, el 57% de la cantidad total de Ag medida en la am-
phipods resultó ser extraíble de la fracción de proteína. La cantidad total de plata (100%) fue
equivalente a la concentración medida después de la digestión ácida de los animales completos. Sin
embargo, de los animales de
la S L tratamiento sólo el 17% de la cantidad total de plata medida en los animales completos fue
extraíble después de la digestión enzimática de proteínas.
3.2.2. Examen de medios de prueba acuosos y tejido de Hyalella utilizando ICP-MS de partícula única
Al usar sp-ICP-MS, el número y el tamaño medio de las partículas de Ag en el medio y las
muestras de animales recolectadas durante el segundo estudio fueron
determinado. Las concentraciones de partículas se determinaron en el medio de S L
y AgNO 3 tratamiento. En ambos tratamientos, la concentración de partículas aumentó durante el
período de exposición. En el tejido animal de todos
tratamientos incluyendo el S 0 Las concentraciones de partículas de lodo se redujeron
terminó al final de la prueba (día 7) con el valor más alto en el S L
tratamiento. Los tamaños de partícula medios calculados se determinaron para
muestras de medio y tejido y se presentan en Tabla 3 .
4. Discusión
Los AgNP llegan al medio acuático en su mayoría apenas transformados
sulfuro de plata soluble (Ag 2 S) después de pasar por el STP. Recientemente se informó que Ag de
los AgNP, que se transforman y se
Se desea pasivar, todavía está disponible para ser absorbido por invertebrados expuestos a STP e ffl uentespequeño tamaño del NM 300 K AgNP que está cerca
o lodos Kampe y col., 2018 ; Kühr et al., 2018 ). Esto fue una estafa fi rmed en este estudio que tenía
como objetivo dilucidar las vías que conducen a la acumulación de plata de lodo STP que contiene
AgNPs en H. azteca. Se observó la absorción dietética de AgNP del lodo, así como la
bioconcentración tras la disolución de los iones Ag + de los AgNP. Sin embargo, no se demostró
penetración en el tejido ni acumulación de partículas ingeridas. Esto está de acuerdo con Zeumer y
col. (2020) donde la absorción dietética de aguas residuales
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NanoImpact 19 (2020) 100239
Los AgNP soportados obviamente no condujeron a signi fi acumulacion de Ag.
El lodo de depuradora que contiene AgNP utilizado se obtuvo a partir de una unidad de simulación
STP a escala de laboratorio que se ejecutaba con NM 300 K. fi cial en
fl uente según OECD TG 303A ( Organización para la Cooperación y el Desarrollo Económicos
(OCDE), 2001 ). El lodo fue examinado por TEM y EDX revelando que los AgNP que todavía estaban
presentes eran sul fi clasificado según los autores ( Kampe y col., 2018 ). los
lodos utilizados para los grupos de control (S 0) fue tomado de una unidad STP a escala de laboratorio de
control que se ejecuta en arti sin picos fi cial en fl uent. El medido
contenido total de Ag de alrededor de 1,2 mg / kg en el S 0 el lodo debe resultar del lodo activo inicial
utilizado para inocular las unidades STP obtenidas
de un STP municipal ( Kampe y col., 2018 ).
En todas las pruebas con lodos STP que contienen AgNPs Ag total medible
Se encontraron concentraciones en los medios de prueba. Con el AgNO 3 tratamiento se pudo
establecer un escenario de exposición que fuera comparable al
concentraciones de medios medidas en el tratamiento de lodos STP (S L) de El
fi primera prueba de exposición. El examen de los medios de prueba recogidos en el
El inicio de las pruebas de segunda exposición usando spICP-MS reveló que Ag
Se detectaron partículas en el S L y en el AgNO 3 tratos. El tamaño medio calculado de las partículas
detectadas en ambos medios (acuoso
fase) fue casi la misma. Sin embargo, una menor concentración de partículas
se determinó para el S L tratamiento que incluye lodos STP que contienen
AgNPs. Kuehr y col. 2020 también observó partículas de Ag en un AgNO 3 medio de exposición con
tamaños de partículas comparables. La observación fue
explicado por la medición de pseudo (presumibles) partículas ( Kuehr et al., 2020 ) que es el resultado
de dos limitaciones del método spICP-MS. Primero, el método no puede distinguir entre los AgNP
fabricados y los productos de procesos de precipitación de Ag + como, por ejemplo,
AgCl o Ag 2 S, o mayor número de Ag + unido a coloides o proteínas. En segundo lugar, debido al
el límite de detección de tamaño instrumental (alrededor de 10 nm para Ag, dado por el software
Agilent MassHunter) o el límite de detección de partículas de 16 - 20 nm según lo informado por ( Lee
et al., 2014 ). Además, las partículas detectadas en los medios recogidos al inicio de la segunda
prueba de exposición fueron
se supone que son pseudopartículas. En el AgNO 3 tratamiento, que se llevó a cabo con lodos de
control que no contenían AgNPs, el
Las partículas podrían ser Ag + que se complejó o se asoció con orgánicos
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Figura 6. Imagen SEM de incrustado H. azteca desde S L tratamiento ( fi primera prueba de exposición) sin contacto directo con el lodo enriquecido con AgNP (grupo de filtro) con ROI marcados (cuadrados rojos, intestino y
región cercana) a 120 × (A), 1000 × (B) y 5000 × magni fi catión (C) con espectro EDX que muestra picos para P y Ca pero no para Ag
(D). (Para la interpretación de las referencias al color en este fi leyenda de la figura, se remite al lector a la versión web de este artículo).

o coloides inorgánicos o especies de Ag precipitadas como Ag 2 S o AgCl ( Degenkolb et al., 2018 ). Sul fi comienzo. Por el contrario, la concentración de partículas medida en el acuoso
Los AgNP modificados todavía son capaces de liberar medios de la S L El tratamiento fue tres magnitudes mayor en los medios envejecidos recolectados al
Ag + como lo describe Kampe y col. (2018) y Kühr y col. (2018) . Par- final de la prueba en comparación con la concentración en el
tículos detectados en el S L medio al inicio de la prueba podría explicarse por la liberación de AgNP medio fresco (después de 24 h de envejecimiento) desde el inicio de la prueba. Además, el tamaño de partícula medio

del lodo STP o por la lixiviación de iones Ag + de fue mayor en comparación con el inicio de la prueba y en comparación con

los AgNP y siguiendo la misma vía de complejación descrita anteriormente. En el medio envejecido
recogido al final de la segunda prueba de exposición, se midió casi la misma concentración de
partículas de Ag para el
AgNO 3 medio. Estas pseudopartículas mostraron un diámetro calculado ligeramente mayor,
probablemente causado por una mayor cantidad de Ag + asociado
ciado con los coloides presentes en comparación con los medidos en la prueba
las partículas detectadas en el AgNO 3 mediano, pero casi idéntico al tamaño de las partículas
prístinas (NM 300 K) y al sul fi partículas dized
medido en el S L lodo por Kampe y col. (2018) . Por lo tanto, se asumió que las partículas que se
midieron al inicio de la prueba eran un artefacto
similar a las partículas que se encuentran en el AgNO 3 medio.
Medición de las concentraciones totales de plata en animales expuestos.

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Figura 7. Imagen TEM de conspicua (Figura 6) de un animal de la S L tratamiento ( fi primera prueba de exposición) sin contacto directo con el lodo enriquecido con AgNP (grupo de filtro) que muestra un Cu alto pero ningún pico de
Ag en el espectro EDX (B).

mostró que las concentraciones tisulares más altas se observaron en animales que estuvieron en
contacto directo con el lodo contaminado. Los animales obviamente ingirieron AgNP como parte de
su dieta. Esto fue una estafa fi rmed por ICP-MS de partícula única que se llevó a cabo para dilucidar
la presencia de partículas ingeridas en los animales previamente expuestos. Las concentraciones
más altas de partículas se midieron en los animales que tenían acceso a lodos contaminados. Sin
embargo, las partículas también podrían detectarse en

imals del AgNO 3 tratamiento e incluso en animales control. El método spICPMS aplicado en este
estudio solo es adecuado para probar la presencia
de AgNP con un tamaño de partícula> 20 nm. Además, un di ff No es posible diferenciar entre los
AgNP reales y los artefactos de medición por el spICP-MS causados por grandes cantidades de
iones en el fondo de la muestra. Por lo tanto, no se puede excluir que las partículas medidas fueran
solo el resultado de un artefacto debido a las limitaciones del proceso de medición y cálculo del
spICP-MS. Debido a la muestra fi tración usando 0.45 μ m jeringa fi ltros, no podemos excluir que las
partículas o aglomeraciones de partículas con un tamaño superior a 450 nm no estuvieran
disponibles para las mediciones de spICP-MS. Sin embargo, tales partículas grandes habrían sido
visibles al menos por la observación TEM durante la microscopía correlativa.

La microscopía correlativa permite la combinación de di ff Diferentes métodos microscópicos para

unir el análisis macroestructural como la microscopía óptica (orientación e información morfológica)
con el análisis nanoestructural como TEM para caracterizaciones claras de puntos especiales con
resolución ultra alta dentro de ROI. Además, el trabajo correlativo fl El flujo permite el examen de la
misma muestra para todos los métodos de cada paso del trabajo. fl Ay.

En este estudio se aplicó microscopía correlativa para con fi rm la captación de AgNP por H.
azteca y para dilucidar aún más la posible penetración tisular y acumulación de las partículas
ingeridas. Observaciones TEM, que se llevan a cabo como parte del trabajo de microscopía
correlativa fl ujo, permita la detección de partículas de Ag sin una falsa detección de Ag complejado o
asociado con materia orgánica ( Kampe y col., 2018 ). Por tanto, el riesgo de detectar artefactos, como
la medición de pseudopartículas, no es posible. Si bien la microscopía correlativa proporciona
Figura 8. Prueba de exposición I-II. Concentración total medida de Ag en el lodo [mg / kg], medio [ μ g / L] y
resultados que no son cuantitativos, los métodos aplicados permiten una
tejidos de animales de experimentación recolectados de grupos expuestos afuera (fondos) o dentro del
colador (arriba) ( Figura 1 ).

preciso localización y caracterización (indicación de

9
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Tabla 3
Las concentraciones de partículas (partículas / L) en las muestras de medios desde el día 4 y 7, y el tejido de los animales desde el día 7. El diámetro de las partículas en las muestras se calcularon como diámetros medios en nm.
Tratamiento Matriz Concentración [partículas / L]
Día 0
S0 Medios de comunicación - -
Animales - 2,2 × 10 8 ± 1,5 × 10 7
SL Medios de comunicación 3,7 × 10 8 ± 3,0 × 10 7
Animales - 2,5 × 10 12 ± 3,4 × 10 11
AgNO 3 Medios de comunicación 5,0 × 10 9 ± 2,0 × 10 9
Animales - 8,2 × 10 9 ± 4,6 × 10 9
transformación) de los NP. De esta forma se demostró que existían
solo cantidades muy bajas de AgNP en el intestino de los anfípodos (S L
tratamiento) y sin AgNP en el tejido de los animales. Además, no hay AgNP
se encontraron en los animales sin contacto directo con lodos enriquecidos con AgNP. De esto se
puede concluir que los AgNP solo se tomaron del lodo, pero no se incorporaron a los tejidos o células
del organismo. Además, la microscopía correlativa reveló que el quanti fi cación de la carga corporal
de Ag por ICP-OES y spICP-MS no estaba en fl uenced por NPs adjunto al caparazón. Por lo tanto, la
carga corporal de Ag medida solo representa los AgNP en el contenido intestinal y potencialmente
otras especies de Ag como Ag + en forma no particulada que se absorbieron mediante procesos de
bioconcentración.
Al utilizar el método de spICP-MS, se encontraron altas concentraciones de partículas medidas
(<20 nm) en los animales recogidos del control y en todos los tratamientos al final del segundo
estudio. Sin embargo, no se pudieron identificar partículas de Ag. fi ed por microscopía correlativa en
animales de control a pesar de que se detectó un bajo nivel de Ag en el tejido. Esto fue
potencialmente causado por la ingestión del lodo de control que contiene una cantidad baja
de plata como contaminación de fondo. Animales recogidos de la S L
grupo colador, sin contacto directo con el lodo STP con alto contenido
Las concentraciones de Ag, mostraron acumulación de plata. Sin embargo, no se pudieron observar
partículas de Ag en los animales usando microscopía correlativa, lo que proporciona una clara
evidencia de que se suponía que Ag se acumulaba después de la absorción de los iones Ag +
liberados del lodo.
Como se describe para varios invertebrados y especies acuáticas, la bioacumulación de Ag,
especialmente después de la exposición de iones Ag, ocurre rápidamente y a menudo conduce a
cargas corporales elevadas, debido a e ff Mecanismos de captación activos y activos y unión de Ag a
proteínas como un desintoxicante fi estrategia de cationes Croteau et al., 2011 ; Hogstrand y col., 1996 ;
Kuehr et al., 2020 ; Waalewijn-Kool et al., 2014 ). También en este estudio, el Ag + acumulado por
procesos de bioconcentración o incorporado después de la liberación del contenido intestinal parece
estar asociado a proteínas como las metalotioneínas ( Ahearn, 2010 ). Esto podría explicar por qué
alrededor del 57% de la cantidad total de carga corporal de Ag se encuentra en los animales
recolectados del
AgNO 3 El tratamiento se detectó en la solución de proteína preparada a partir del mismo material de
muestra. En comparación, solo el 17% del monto total
de Ag encontrado en animales de la S L tratamiento, con contacto directo con los lodos contaminados,
se detectó en la fracción proteica de los animales
lo que puede explicarse por la menor concentración de Ag + debido a la liberación limitada y
retardada de Ag + del sul fi superficie AgNP dized.
Sin embargo, la acumulación medida de Ag en los grupos separados en filtros fue muy limitada.
Esto puede explicarse por la observación de que el Ag + liberado del lodo aparentemente no fue
disuelto libremente como con fi rmed por el AgNO 3 tratamiento. Los resultados de Ag
medidas siguiendo ultra fi ltración de la S L medios de la fi Las pruebas de primera y segunda
exposición han demostrado que alrededor del 99% de los
la plata total medida en el medio estaba presente en forma de partículas o coloidal que no podía
atravesar 3 kD fi membrana del filtro. Esto podría explicarse por precipitados, AgNP suspendidos o Ag
+ unido a ácidos húmicos, proteínas u otros coloides orgánicos ( Degenkolb et al., 2018 ;
Kaegi et al., 2011 ; Kampe y col., 2018 ). La suposición de que Ag + es
10
NanoImpact 19 (2020) 100239
Diámetro [nm]
Día 7 Día 0 Día 7
- -
- 17,2 ± 0,2
1,5 × 10 11 ± 2,2 × 10 9 11,5 ± 0,2 15,0 ± 0,0
- 18,5 ± 0,4
6.0 × 10 9 ± 4,6 × 10 9 11,2 ± 0,5 13,5 ± 0,8
- 17,6 ± 1,2
asociado con coloides orgánicos o inorgánicos está de acuerdo con la observación de que alrededor
del 99% de la Ag total medida en el medio de
el AgNO 3 El tratamiento también estaba presente en forma de partículas o asociado con coloides
mayores de 3 kD como lo muestra ultra fi filtración.
El diseño de prueba utilizado para este estudio permitió la investigación de las principales vías
involucradas en la acumulación de Ag de AgNP en lodos STP. El cálculo de los factores de
acumulación como la relación de las concentraciones totales de Ag en el medio acuoso ayudó a
evaluar el impacto de los procesos de absorción dietética y bioconcentración que conducen a la
acumulación de Ag en H. azteca observado en este estudio.
No signi fi no puedo di ff diferencia entre el AF METRO valores de la parte superior y
grupo inferior del AgNO 3 se observó tratamiento (363 vs 396). Ambos grupos se mantuvieron en
contacto con lodos de control y se expusieron a
mismo medio de prueba. Por el contrario, AF METRO valores calculados para el S L tratamiento (segundo
estudio) revelan que hubo una significativa fi no puedo di ff erence re
considerando la acumulación de Ag en el grupo superior e inferior (376 vs.
39,404). Grupos de ambos tratamientos (S L y AgNO 3) fueron expuestos a la misma concentración
media, pero alimentados con di ff diferentes tipos de lodos en el
grupo inferior subrayando la principal contribución de la absorción dietética a la carga corporal de Ag
medida y la acumulación aparente de Ag en este escenario de exposición.
AF METRO valores observados en el S L tratamiento desde la segunda exposición
estudiar con fi rm el signi fi no puedo di ff erencia en el AF calculado METRO valores con respecto a la
acumulación de Ag en el grupo superior e inferior (504 y
21.730). Sin embargo, AF METRO Los valores calculados para los animales en el colador (arriba) fueron más
altos en comparación con los fi primer estudio. Durante el fi primero y
En el segundo estudio se aplicó lodo con la misma concentración en el S L
tratamiento pero que conduce a di ff concentraciones de medios actuales. Esto podría ser
explicado por el di ff cantidad de lodo que se proporcionó a los viales para garantizar la alimentación ad
libitum de los animales de prueba. Los animales más grandes fueron expuestos durante el segundo
estudio. En consecuencia, la aplicación de la mayor cantidad de lodo durante el segundo estudio condujo
a concentraciones de Ag total más altas en el medio de prueba en comparación con el fi primera prueba
como
fl ected en el AF METRO valores.
Ag + es bien conocido por inducir efectos toxicológicos letales y subletales.
efectos, especialmente en especies acuáticas ( Leblanc y col., 1984 ; Sakamoto et al., 2015 ; Wang et al.,
2012 ; Zhao y Wang, 2011 ). Sin embargo, ninguna mortalidad o signi fi no puedo ff Se observaron efectos
en ambos estudios de exposición. El pre
tez sumable de Ag + del AgNO 3 tratamiento y el Ag + potencialmente liberado de los AgNP de los
lodos enriquecidos pueden explicar la falta
de signi fi no puedo ff efectos o mortalidad en comparación con el S 0 grupo de control en ambos
estudios, incluso si H. azteca se considera el más sensible
especies bentónicas para exposición a Ag + ( Blaser y col., 2008 ). La falta de observado e ff ects está
de acuerdo con los resultados de Kühr et al. 2018, donde los AgNP transmitidos por las aguas
residuales no causaron ninguna e ff efectos en contraste con los AgNP prístinos transmitidos por el
agua. Hartmann et al. (2019) cuando los prístinos AgNP de NM 300 K causaron un significativo fi reducción
de la reproducción en Daphnia magna, mientras que las aguas residuales contienen NM 300 K
AgNP, que se probaron
para ser transformado en Ag 2 S, no causó ningún signi fi no puedo di ff erences en el número de o ff primavera
( Hartmann et al., 2019 ).
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5. Conclusiones Agradecimientos

Los AgNP como NM 300K pueden ser ingeridos por el anfípodo bentónico
Hyalella azteca por absorción dietética de lodos STP como se muestra en este estudio. Sin embargo,
aunque se demostró que los NP eran ingeridos, no fi encontrar cualquier evidencia de una
incorporación de los NP o transferencia desde el intestino al tejido o células de los animales. Sin
embargo, la bioacumulación de Ag + liberada del sul fi AgNPs, fue con fi rmed. La acumulación de Ag
de los AgNP puede conducir a una mayor carga corporal de Ag en los animales y, por lo tanto, los
anfípodos pueden acelerar la transferencia de metales pesados de los NP acumulados en el
sedimento a la cadena alimentaria acuática ( Vogt et al., 2019 ).
Este trabajo fue fi financiado financieramente por el Instituto Fraunhofer de Biología Molecular y
Ecología Aplicada IME y el Instituto Fraunhofer de Microestructura de Materiales y Sistemas IMWS.
Agradecemos a Nicola Schröder por apoyar las mediciones de sp-ICP-MS y a Virginia Schraps, Lara
Hermsen y Richard Zeumer por su ayuda durante las mediciones de las concentraciones totales de
Ag. Agradecemos a cuatro revisores desconocidos por sus valiosos comentarios sobre el manuscrito.
Apéndice A. Datos complementarios

Se demostró que las investigaciones sobre la biodisponibilidad y bioacumulación de NP en
organismos acuáticos deben complementarse con los métodos de microscopía correlativa. La razón
de esto es que el método establecido de spICP-MS a menudo detecta artefactos, como presumibles
y / o pseudopartículas, pero no puede confundirse. fi rm (o concluir) que de hecho son artefactos. Se
requieren más investigaciones que utilicen métodos de imágenes con mayor resolución, como
imágenes de rayos X de radiación sincrotrón, para obtener más información sobre la distribución del
metal dentro del organismo y permitir una conclusión más precisa sobre la biodisponibilidad y
bioacumulación de AgNP.
Fondos
Esta investigación no recibió ninguna especificación fi c subvención de agencias de financiación en
el público, comercial o sin fines de lucro fi t sectores.
Abreviaturas
Se pueden encontrar datos complementarios a este artículo en línea en https: //
doi.org/10.1016/j.impact.2020.100239 .
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