Documentos de Académico
Documentos de Profesional
Documentos de Cultura
CURSO:
BIOTECNOLOGIA
TEMA:
“REPLICA DE TRES ENZIMAS DE RESTRICCION CLIVANDO DEL
ADN”
DOCENTE:
Dr. SOTO GONZALES, HEBERT HERNAN
PRESENTADO POR:
LOPEZ CALACHUA, JENNIFER ANDREA
ILO
Noviembre, 2020
VII SEMESTRE
2
CONTENIDO
I. INTRODUCCION .............................................................................................................. 3
II. OBJETIVOS........................................................................................................................ 4
2.1. Objetivo general .......................................................................................................... 4
2.2. Objetivos específicos ................................................................................................... 4
III. MARCO TEORICO ........................................................................................................... 5
3.1. Enzimas de restricción ................................................................................................. 5
3.2. Ligadura y digestión de enzimas de restricción ........................................................... 6
3.3. El ADN ligasa .............................................................................................................. 7
3.4. Aplicaciones en el diagnóstico de enfermedades genéticas ........................................ 8
IV. MATERIALES Y EQUIPOS ............................................................................................. 9
V. METODOLOGIA .............................................................................................................. 9
VI. RESULTADOS ................................................................................................................ 10
6.1. Eco RI ........................................................................................................................ 12
6.2. BamHI ....................................................................................................................... 12
6.3. SmaI ........................................................................................................................... 13
VII. CONCLUSIONES .......................................................................................................... 14
VIII. RECOMENDACIONES ................................................................................................. 14
IX. REFERENCIAS.............................................................................................................. 15
3
I. INTRODUCCION
II. OBJETIVOS
2.1. Objetivo general
Elaborar una réplica a escala de 3 enzimas de restricción en base a materiales
reciclados o artesanales, a una dimensión 3D.
2.2.Objetivos específicos
Realizar una investigación de los fundamentos básicos de endonucleasas o enzimas de
restricción.
Identificar las enzimas de restricción más comunes, su fuente, secuencia de
reconocimiento y resumen de restricción.
5
Las enzimas de restricción presentan actividad endonucleasa, son de origen bacteriano y cortan
los enlaces fosfodiéster del ADN en una secuencia específica denominada secuencia diana. El
uso de estas enzimas como herramienta biotecnológica surgió de la necesidad de cortar las
largas cadenas de ADN genómico para manipularse y analizarse en fragmentos más pequeños.
El empleo de las enzimas de restricción y otras enzimas que modifican ácidos nucleicos, como
la ligasa, permitió desarrollar la metodología del ADN recombinante.
Como un ejemplo de cómo una enzima de restricción reconoce y corta en una secuencia de
ADN, veamos a EcoRI, una enzima de restricción de uso común en el laboratorio. EcoRI corta
en el siguiente sitio:
Figura 1:
EcoRI, una enzima de restricción
Cuando EcoRI reconoce y corta este sitio, siempre lo hace en un patrón muy específico que
produce extremos sobresalientes de ADN de cadena sencilla:
Figura 2:
Corte del sitio EcoRI
6
No todas las enzimas de restricción producen extremos cohesivos. Algunas producen "extremos
romos", cortes a la mitad de la secuencia blanco que no dejan extremos de cadena sencilla. La
enzima de restricción SmaI es un ejemplo de enzima que corta así:
Figura 3:
Enzima de restricción SmaI
El ADN ligasa puede unir fragmentos romos entre sí. Sin embargo, es más difícil ligar
fragmentos romos (la reacción de ligación es menos eficiente y es más probable que falle)
porque no hay secuencias sobresalientes de cadena sencilla que sostengan a las moléculas de
ADN en su posición.
Tabla 1:
Endonucleasas de restricción comunes
Secuencia de
Enzima Fuente Resumen de restricción
reconocimiento
5 '--- G ↓ AATTC --- 3'3'
EcoRI Escherichia coli 5'GAATTC3'CTTAAG
--- CTTAA ↑ G --- 5 '
5 '--- G ↓ GATCC --- 3'3'
BamHI Bacillus amyloliquefaciens 5'GGATCC3'CCTAGG
--- CCTAG ↑ G --- 5 '
5 '--- T ↓ CGA --- 3'3' --
TaqI Thermus aquaticus 5'TCGA3'AGCT
- AGC ↑ T --- 5 '
5 '--- G ↓ ANTC --- 3'3' -
HinfI Haemophilus influenzae 5'GANTCA3'CTNAGT
-- CTNA ↑ G --- 5 '
5 '--- ↓ GATC --- 3'3' ---
Sau3A Staphylococcus aureus 5'GATC3'CTAG
CTAG ↑ --- 5 '
5 '--- CAG ↓ CTG --- 3' *
PvuII Proteus vulgaris 5'CAGCTG3'GTCGAC
3 '--- GTC ↑ GAC --- 5'
5 '--- CCC ↓ GGG --- 3' *
SmaI Serratia marcescens 5'CCCGGG3'GGGCCC
3 '--- GGG ↑ CCC --- 5'
5 '--- GG ↓ CC --- 3' * 3
HaeIII Haemophilus aegyptius 5'GGCC3'CCGG
'--- CC ↑ GG --- 5'
Figura 4:
ADN Ligasa
¿Cómo logra esto el ADN ligasa? Mediante el uso de ATP como fuente de energía, la ligasa
cataliza una reacción en la que el grupo fosfato del extremo 5' de una cadena de ADN se une al
grupo hidroxilo del extremo 3' de la otra cadena. Esta reacción produce un esqueleto de azúcar-
fosfato intacto.
Alicates
Plastilina de colores
Cable viejo (aproximadamente 2m)
Cámara fotográfica
Computador
V. METODOLOGIA
1. De las tiras de cable usadas que ya se encontraban en desuso por su limitado tiempo de
vida de algunos cables, le retiré el plástico protector con ayuda de un cuchillo, obteniendo
los alambres para el soporte de mi maqueta del ADN. Cortando 2 trozos de ella para simular
el esqueleto azúcar-fosfato del ADN y 18 piezas más pequeñas simulando las bases del
ADN. Obteniendo lo siguiente:
↓
5 GAATTC 3′
′
3′ CTTAAG 5′
↑
↓
5 GGATCC 3′
′
3′ CCTAGG 5′
↑
↓
5 CCCGGG 3′
′
3′ GGGCCC 5′
↑
12
6.1. Eco RI
Producida por el microorganismo Escherichia coli que posee una diana de restricción en el
ADN de cadena doble dependiente de una secuencia metilada (al estar la hebra metilada, no
hay corte), palindrómica y asimétrica, sobre la cual su actividad catalítica hidrolasa genera
extremos cohesivos. Es sin duda la enzima más conocida dentro del mundo académico.
Figura 5:
Resultado de corte de la enzima EcoRI
6.2. BamHI
Es una enzima de restricción de tipo II producida por el microorganismo Bacillus
amyloliquefaciens que posee una diana de restricción en el ADN de cadena doble dependiente
de una secuencia no metilada, palindrómica y asimétrica, sobre la cual su actividad catalítica
hidrolasa genera extremos cohesivos.
Figura 6:
Resultado de corte de la enzima BamHI
13
6.3. SmaI
Es una enzima de restricción de tipo II producida por el microorganismo Serratia marcescens
que posee una diana de restricción en el ADN de cadena doble dependiente de una secuencia
no metilada, palindrómica y no escalonada, sobre la cual su actividad catalítica hidrolasa genera
extremos romos.
Figura 7:
Resultado de corte de la enzima SmaI
14
VII. CONCLUSIONES
La entrada de la enzima ligas la cual forma enlaces covalentes entre los extremos 5’ de
cada cadena polinucleotidica y el extremo 3’ en cada cadena polinucleotidica, también
se denomina enzima de unión de polinucloetidicos.
Se da por concluido que las enzimas de restricción cortan el ADN tiene dos tipos de
corte y una de ellos es lejos del sitio de reconocimiento por medio de formación de asas.
Reconoce el ADN, metila a la secuencia de reconocimiento y corta el ADN a distancia
del sitio de reconocimiento.
Las enzimas de restricción necesitan condiciones especiales para poder llevar acabo su
función correctamente, como por ejemplo una temperatura optima y un Ph adecuado,
de igual forma contaminantes como proteína, sales, etanol, inhiben las endonucleasas.
VIII. RECOMENDACIONES
Para la elaboración de esta maqueta conseguir un material rígido y resistencia que
soporte un peso considerable para el tamaño.
Dependiendo de su magnitud se podría utilizar mayor cantidad de cables, así como
mayor cantidad de plastilina o algún material parecido
Recomendemos utilizar objetos que ya no usen en casa, evitando el consumo de nuevos
materiales si en caso no contamos con un plan de manejo de residuos como depósitos
de reciclaje.
15
IX. REFERENCIAS
Aguirre García, A. (2019). Enzimas Biotecnológicas y su aplicación a la industria
alimentaria. Madrid. Obtenido de
http://147.96.70.122/Web/TFG/TFG/Memoria/ALMUDENA%20AGUIRRE%20GA
RCIA.pdf
BIOTED. (s.f.). Introducción a las Enzimas de Restricción. Obtenido de
https://www.bioted.es/protocolos/INTRODUCCION-ENZ-RESTRICCION.pdf
Douglas Wilkin, P. (s.f.). Gene Cloning - Advanced. Obtenido de ck-12 Foundation Home:
https://www.ck12.org/book/CK-12-Biology-Advanced-Concepts/section/9.2/
Khan Academy. (2018). Las enzimas de restricción y la ADN ligasa. Obtenido de Khan
Academy Web Site: https://es.khanacademy.org/science/biology/biotech-dna-
technology/dna-cloning-tutorial/a/restriction-enzymes-dna-ligase