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118 SECCIÓN I Fundamentos de microbiología

Determinador independiente Rho

AUG AUG

Polimerasa
DNA
de RNA

Paso 1

AUG

Paso 2

AUG

Paso 3

Paso 4

Paso 4 alternativo

Paso 5 alternativo

FIGURA 711 Modelo de atenuación de replicación bacteriana. Paso 1. El acoplamiento de transcripción/traducción tiene lugar como para
cualquier gen bacteriano. Paso 2. La polimerasa de RNA hace pausa y se forma un asa 1:2. Paso 3. Los ribosomas interrumpen en el asa 1:2 y se
encuentran con dos codones trp. Paso 4. Si hay suficiente triptófano presente los RNA cargados con trp se encuentran presentes y los ribosomas
realizarán la traducción de trpL. Esto causa que la polimerasa de RNA se interrumpa en el determinador independiente Rho compuesto por un
asa 3:4. Paso 4 alternativo. Si hay limitación del triptófano (sin Trp-tRNA), los ribosomas se detienen en los dos codones trp, en tanto que la
polimerasa de RNA continúa. Se forma el asa 2:3. Paso 5 alternativo. El determinador 3:4 no puede formarse y la polimerasa de RNA continúa la
transcripción en genes estructurales trp. Esto expone el sitio de unión del ribosoma (RBS) antes de trpE, lo que permite la traducción. (Reproducida
con autorización de Trun N, Trempy J: Fundamental Bacterial Genetics. Copyright © 2004 por Blackwell Science Ltd. Con autorización de Wiley.)

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genética bacteriana ha transformado la biología. Es posible ais-
lar fragmentos específicos de DNA y amplificarse, y sus genes
pueden expresarse en concentraciones elevadas. La especi-
ficidad de los nucleótidos necesarios para el desdoblamiento
de las enzimas de restricción permite que los fragmentos que
contienen genes o partes de los mismos se unan (incorporen) a
los plásmidos (vectores) que pueden usarse a su vez para trans-
formar a las células bacterianas. Las colonias bacterianas o
clonas portan genes específicos que pueden identificarse por
hibridación de DNA o RNA con sondas marcadas (similares a
las que se muestran en la figura 3-4). De manera alternativa, los
productos proteínicos codificados por los genes pueden identi-
ficarse ya sea por actividad enzimática o por técnicas inmuno-
lógicas. Así, pueden utilizarse técnicas de ingeniería genética
para aislar prácticamente cualquier gen, por lo que dichos
genes pueden expresarse de forma tal que es posible estudiar o
explotar las propiedades bioquímicas identificables.
Los genes aislados pueden utilizarse para diversos pro-
pósitos. La mutagénesis de sitio dirigido puede identificar y
alterar la secuencia de DNA de un gen. Es posible determi-
nar y, si se desea, alterar los residuos de nucleótidos esenciales
para las funciones de los genes. Con las técnicas de hibrida-
ción, el DNA puede utilizarse como una sonda que reconozca
los ácidos nucléicos correspondientes a las secuencias comple-
mentarias de su propio DNA. Por ejemplo, un virus latente en
un tejido animal se detecta con una sonda de DNA incluso
en ausencia de infección viral evidente. Los productos proteí-
nicos de los genes virales aislados ofrecen una gran promesa
como vacunas porque se preparan sin genes que codifican la
replicación de ácido nucleico viral. Por ejemplo, las proteínas
de la cápside del virus del papiloma humano se clonaron y
expresaron; se les llama partículas similivíricas no infecciosas
(VLP, virus-like particles) y forman la base de una vacuna con-
tra cepas transformadoras de este virus. Además, proteínas
como la insulina que tienen funciones útiles pueden prepa-
rarse en grandes cantidades a partir de bacterias que expresan
los genes clonados.
Preparación de fragmentos de DNA
con enzimas de restricción
La diversidad genética de las bacterias se refleja por su amplia
gama de enzimas de restricción, las cuales poseen una selec-
tividad notable que les permite identificar regiones específi-
cas de DNA para su desdoblamiento. Las secuencias de DNA
reconocidas por enzimas de restricción son de manera predo-
minante palíndromos (secuencias de repeticiones invertidas).
Una secuencia típica en palíndromo, reconocida por EcoR1,
una enzima de restricción más utilizada, es GAATTC; la repe-
tición invertida, inherente en su complementariedad en los
pares de bases G-C y A-T, da origen a la secuencia 5′ TTC que
se refleja como AAG en la cadena 3′.
La longitud de los fragmentos de DNA producidos por
enzimas de restricción varía en gran medida por la individua-
lidad de secuencias de DNA. La longitud promedio de los frag-
mentos de DNA depende en gran parte del número de bases
específicas reconocidas por una enzima. La mayor parte de las
enzimas de restricción reconoce cuatro, seis u ocho secuencias
de bases; sin embargo, otras enzimas de restricción reconocen
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CAPÍTULO 7 Genética microbiana 119
10, 11, 12 o 15 secuencias de bases. El reconocimiento de cua-
tro bases da origen a fragmentos con una longitud promedio
de 250 pares de bases y por lo tanto suele ser útil para el análisis
o manipulación de fragmentos génicos. Con frecuencia genes
completos son abarcados por enzimas de restricción que reco-
nocen seis bases y producen fragmentos con un tamaño prome-
dio de 4 kbp. Las enzimas de restricción que reconocen ocho
bases producen fragmentos con un tamaño típico de 64 kbp
y son útiles para el análisis de regiones genéticas grandes. Las
enzimas de restricción que reconocen más de 10 bases son útiles
para la construcción de un mapa físico y de la tipificación mo-
lecular mediante electroforesis en gel en un campo de pulsos.
Separación física de fragmentos
de DNA de tamaño diferente
Gran parte de la simplicidad de las técnicas de ingeniería gené-
tica yace en el hecho de que la electroforesis en gel permite
la separación de fragmentos de DNA con base en el tamaño
(figura 7-12): mientras más pequeños los fragmentos, más
rápida será la tasa de migración. La tasa general de migración y
el intervalo óptimo de tamaño para la separación puede deter-
minarse con base en la naturaleza química del gel y el grado
de formación de enlaces cruzados. Los geles con alto grado de
enlaces cruzados optimizan la separación de fragmentos peque-
ños de DNA. El colorante bromuro de etidio forma un aducto
de color floreciente brillante que se une al DNA, de forma
que pequeñas cantidades de fragmentos separados de DNA
pueden visualizarse sobre los geles (figura 7-12A). Fragmentos
específicos de DNA pueden identificarse por sondas que con-
tienen secuencias complementarias (figuras 7-12B y C).
La electroforesis en gel en campo de pulsos permite la
separación de fragmentos de DNA que contienen hasta 100
kbp que se separan en geles de poliacrilamida de alta resolu-
ción. La identificación de fragmentos tan grandes ha permi-
tido la construcción de un mapa físico para los cromosomas de
varias especies bacterianas y han sido de gran utilidad para la
identificación de huellas genéticas de aislados bacterianos rela-
cionados con brotes epidémicos de enfermedades infecciosas.
Clonación de fragmentos
de restricción de DNA
Muchas enzimas de restricción producen desdoblamiento
asimétrico y fragmentos de DNA con extremos cohesivos
(adhesivos) que pueden hibridizarse con otros fragmentos.
Este DNA puede utilizarse como donador con un plásmido
receptor para formar un plásmido recombinante por medio de
ingeniería genética. Por ejemplo, el desdoblamiento de DNA
con EcoR1 produce DNA que contiene una secuencia AATT
en el extremo 5′ y la secuencia complementaria TTAA en el
extremo 3′ (figura 7-13). El desdoblamiento de un plásmido
con la misma enzima de restricción produce un fragmento
lineal con extremos adhesivos que son idénticos uno con otro.
La eliminación enzimática de los grupos de fosfato libres de
estos extremos asegura que no se unirán para formar el plás-
mido circular original. La ligadura en presencia de otros frag-
mentos de DNA que contienen grupos de fosfato libres genera
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120 SECCIÓN I Fundamentos de microbiología

Fragmentos de restricción Fragmentos de restricción para hibridación

Tamaño Enzimas Tamaño Enzimas
del fragmento del fragmento
(kbp) E E/H E/S E/H/S (kbp) E E/H E/S E/H/S
4 4

3 3

2 2

1 1

0.5 0.5
A C

Sitios de restricción
Longitud (kbp) 1 2 3 4

Sitio
enzimático E H S E
Sonda
B

FIGURA 712 A: separación de los fragmentos de DNA con base en el tamaño por electroforesis en gel. Los fragmentos pequeños migran
con mayor rapidez que los fragmentos grandes y en un intervalo determinado por las propiedades del gen, la distancia de migración proporciona
en términos generales el logaritmo del tamaño del fragmento. Los fragmentos de DNA pueden visualizarse con base en su florescencia después
de la tinción con colorante. B: el tamaño de los fragmentos de restricción depende de su ubicación en los sitios de restricción en el DNA. En
este ejemplo, un fragmento de 4 pares de kilobases (kbp) formado por enzimas de restricción EcoR1 (E) contiene los sitios respectivos para las
enzimas de restricción HindIII (H) y SalI (S) en las posiciones correspondientes a 1 y 3.5 kbp. El patrón de electroforesis en A revela que la enzima
de restricción E no corta el fragmento de 4 kbp (primer trayecto); el desdoblamiento con enzima de restricción H produce fragmentos de 3 y 1
kbp (segundo trayecto); el desdoblamiento con enzima de restricción S da origen a fragmentos de 3.5 y 0.5 kbp (tercer trayecto) en tanto que el
desdoblamiento de los fragmentos H y S forma fragmentos de 2.5, 1 y 0.5 kbp (cuarto trayecto). Los fragmentos de 0.5 kbp se encuentran entre
los sitios S y E, que se eligieron como sonda para determinar el DNA con secuencias de hibridación, como se muestra en C. C: Identificación
de fragmentos de hibridación. Los fragmentos de restricción se separaron como se observa en A. El procedimiento de hibridación revela
los fragmentos que se sometieron a hibridación con una sonda de 0.5 kbp. Estos son fragmentos de 4 kbp formados por enzimas de restricción E,
el fragmento de 3 kbp que se encuentra entre los sitios E y H, y el fragmento de 0.5 kbp que se encuentra entre los sitios S y H.

plásmidos recombinantes, que poseen fragmentos de DNA en
la forma de insertos dentro del DNA circular cerrado covalen-
temente. Los plásmidos deben tener forma circular para mos-
trar réplica dentro de la bacteria hospedadora.
Los plásmidos recombinantes pueden introducirse en
el hospedador bacteriano, con frecuencia E. coli, por medio
de transformación forzada. La electroporación es un pro-
cedimiento que introduce DNA en la bacteria utilizando un
gradiente eléctrico. Las células transformadas pueden seleccio-
narse con base en uno o más factores de resistencia a fármacos
codificados por los genes de los plásmidos. La población bacte-
riana resultante contiene una biblioteca de plásmidos recom-
binantes que portan varias clonas de fragmentos de restricción
insertados, derivados del DNA del donador. Las técnicas de
hibridación pueden utilizarse para identificar colonias bac-
terianas portadoras de fragmentos de DNA específico (figura
7-14) o, si el plásmido expresa el gen insertado, las colonias
pueden tamizarse para el producto génico por un anticuerpo
específico para la proteína producida.
IDENTIFICACIÓN DEL DNA CLONADO
Mapa de restricción
La manipulación del DNA clonado requiere la comprensión de
su secuencia de ácidos nucleicos. La preparación de un mapa
de restricción es la primera etapa en la obtención de dicho
conocimiento. Un mapa de restricción se construye en forma
muy similar a un rompecabezas a partir de fragmentos produ-
cidos por digestión simple, los cuales se preparan con enzimas
de restricción individuales. Los mapas de restricción también
son el paso inicial hacia la secuenciación de DNA porque iden-
tifican fragmentos que proporcionarán subclonas (fragmentos
relativamente pequeños de DNA) que se someten a un análi-
sis más riguroso, que puede incluir la secuenciación del DNA.
Además, los mapas de restricción proporcionan información
muy específica respecto a las bases, que permite que los fragmen-
tos de DNA, que se identifican con base en el tamaño, se asocien
con funciones génicas específicas.

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CAPÍTULO 7 Genética microbiana 121

Vector receptor
ampR

DNA donador Sitio de restricción

Sitio de restricción Sitio de restricción EcoR1
EcoR1 EcoR1
GAATTC
5′ GAATTC GAATTC 3′ CTTAAG
3′ CTTAAG CTTAAG 5′ H2O
RESTRICCIÓN
H2O
RESTRICCIÓN
ampR

5′ G P AATTC 3′

3′ CTTAA P G 5′
G P AATTC
+ CTTAA
P
G
P AATTC G

G CTTAA P Fosfatasa H2O

Pi
ampR

HIBRIDACIÓN
DE LOS
EXTREMOS
ADHESIVOS
G AATTC
ampR CTTAA G

G C
P AAT
C T C G AATT G
TTAA TTAA
P
G C

ATP
LIGADURA

ampR

G C
C P AATT C G AATT G
TTAAG P
CTTAA
Plásmido recombinante (o quimérico)

FIGURA 713 Formación de un plásmido recombinante o quimérico a partir de DNA detonador y un vector del receptor. El vector es un
plásmido que porta el sitio de restricción EcoR1, que sufre desdoblamiento por enzimas y se prepara para ligadura mediante la eliminación de los
grupos fosfato terminales. Este paso evita que los extremos adhesivos del plásmido se unan en ausencia de material insertado. El DNA donador
se trata con las mismas enzimas de restricción y un enlace covalente cierra la molécula mediante una ligadura. Un marcador de resistencia
farmacológica, mostrado como ampR en el plásmido puede utilizarse para seleccionar los plásmidos recombinantes después de su transformación
en la Escherichia coli. Las enzimas de la bacteria hospedadora completan el enlace covalente del DNA circular y media su replicación.

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122 SECCIÓN I Fundamentos de microbiología

Transferencia al filtro

Fijación
del DNA

Se añade una sonda

con DNA marcado

Lavado de los
marcadores
no unidos
Autorradiografía

FIGURA 714 Uso de sondas para identificar clonas que contienen fragmentos específicos de DNA. Las colonias pueden transferirse a un
filtro y calentarse de forma tal que las células se destruyan y el DNA se adhiera al filtro. Más tarde, el filtro puede ser tratado con una solución que
contenga una sonda de DNA marcada en forma apropiada, lo que produce hibridación específica con las clonas deseadas. La autorradiografía
subsiguiente del filtro identifica estas clonas (círculos oscuros). Las clonas también pueden ser expuestas a sondas con anticuerpos para saber si
sintetizan un producto proteínico específico.

Secuenciación terminación de la cadena, lo que hace posible determinar la

La secuenciación de DNA muestra la estructura génica y per- secuencia de DNA por el método de Sanger (figura 7-15). La
mite a los investigadores deducir la secuencia de aminoácidos relativa simplicidad del método de Sanger ha conducido a su
de los productos génicos. A su vez, esta información hace posi- uso más generalizado, pero la técnica de Maxam-Gilbert se
ble manipular los genes en orden para comprender o alterar emplea de manera amplia porque puede exponer regiones de
su función. Además, el análisis de secuencias de DNA revela DNA que están protegidas por proteínas específicas contra
regiones reguladoras que controlan la expresión génica y “pun- modificaciones químicas.
tos calientes” genéticos que son en particular susceptibles a la La secuenciación de DNA se facilita en gran medida por la
mutación. La comparación de secuencias de DNA revela rela- manipulación genética del bacteriófago M13 de E. coli, el cual
ciones evolutivas que proporcionan un marco de referencia
para la clasificación sin ambigüedades de especies bacterianas.
Tales comparaciones pueden facilitar la identificación de regio- Terminación en
nes conservadas que pueden ser en especial útiles como sondas
específicas de hibridación para detectar organismos o virus en A C G T
una muestra clínica.
El método original para conocer la secuencia de DNA uti-
lizó la técnica de Maxam-Gilbert que depende de la suscepti-
bilidad química relativa de diferentes enlaces de nucleótidos.
Las técnicas utilizadas cambiaron enormemente para el uso del
método de Sanger (terminación dideoxi) que interrumpe la
elongación de las secuencias de DNA al incorporar didesoxinu-
cleótidos al interior de las secuencias. Ambas técnicas produ-
cen un grupo de oligonucleótidos que inician de un solo origen
e implica la separación de cadenas de secuencias de DNA en Secuencia: CACGTG
gel que difieren por el incremento de un solo nucleótido. La
secuenciación en gel de poliacrilamida separa cadenas que FIGURA 715 Determinación de la secuencia de DNA por el
método de Sanger (terminación didesoxi). La elongación enzimática
difieren en longitud desde uno hasta varios cientos de nucleó-
del DNA se interrumpe por la inclusión de análogos didesoxi de
tidos y revela secuencias de DNA de longitudes variables.
trinucleótidos correspondientes con A, C, G y T por separado en
Cuatro trayectos paralelos sobre el mismo gel revelan mezclas de reacciones paralelas. El grupo resultante de cadenas elongas
la longitud relativa de las cadenas sometidas a terminación interrumpidas se separa por secuenciación en gel y puede deducirse
didesoxi en adenina, citidina, guanina y timidina. La com- la secuencia al notar la base que corresponde a cada incremento en la
paración de los cuatro trayectos que contienen la reacción se longitud de la cadena. La secuenciación en gel se lee de abajo hacia
mezcla de forma tal que difieren únicamente en el método de arriba, y cada línea corresponde con un incremento en una base.

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CAPÍTULO 7 Genética microbiana 123

contiene DNA monocatenario. La forma retrospectiva del DNA
del fago es un DNA bicatenario circular cerrado por un enlace
covalente, producido por ingeniería genética de forma tal que
contenga un sitio de clonación múltiple que permita la integra-
ción de fragmentos específicos de DNA que se han identificado
previamente por mapeo de restricción. Las bacterias infectadas
con la forma replicativa secretan fagos modificados que con-
tienen, en el interior de su envoltura proteínica, ssDNA que
incluye la secuencia insertada. Este DNA actúa como planti-
lla para reacciones de elongación. El origen para la elongación
depende de un cebador de DNA que puede sintetizarse por
máquinas automatizadas para la síntesis química de oligonu-
cleótidos. Tales máquinas pueden producir cadenas de DNA
que contienen 75 o más oligonucleótidos en una secuencia
predeterminada y son esenciales para la secuenciación y para la
modificación del DNA por mutagénesis dirigida al sitio.
Los oligonucleótidos sintetizados por medios químicos
pueden servir como cebadores para la reacción en cadena de
polimerasa (PCR, polymerase chain reaction), un procedi-
miento que permite la amplificación y secuenciación del DNA
que se encuentra entre los cebadores. Así, en muchos casos, el
DNA no necesita ser clonado a fin de secuenciarse o para que
esté disponible para procedimientos de ingeniería genética.
El estudio de la biología se ha revolucionado con el desa-
rrollo de tecnología que permite la secuenciación y análisis de la
totalidad de los genomas, que varía desde virus, microorganis-
mos unicelulares procariotas y eucariotas hasta seres humanos.
Esto se ha facilitado con el uso de un procedimiento conocido
como escopetazo (shotgunning). En este procedimiento, el
DNA se rompe en fragmentos más pequeños para crear una
biblioteca de fragmentos. Tales fragmentos desordenados son
secuenciados por secuenciadores de DNA automáticos y se
reensamblan utilizando programas de cómputo poderosos.
Un número suficiente de fragmentos son secuenciados para
asegurar que se abarque la totalidad del genoma de forma que
cuando se ensamblen, la mayor parte del genoma se represente
sin dejar demasiadas brechas. (Para lograr esto, la totalidad del
genoma por lo común se revisa cinco a ocho veces, con lo que se
deja casi 0.1% del total de DNA sin secuenciar.) Después que los
fragmentos aleatorios se han ensamblado por medio de áreas
con superposición de secuencias, todos los espacios rema-
nentes deben identificarse y cerrarse. Los datos avanzados
de procesamiento permiten la anotación de los datos de la
secuencia en la cual se identifican regiones putativas de codi-
ficación, operones y secuencias reguladoras. Los genomas de
varios microorganismos importantes han sido secuenciados.
El análisis continuo de los datos de secuenciación de patóge-
nos humanos importantes combinados con los estudios de
patogenia molecular facilitará la comprensión de la forma en
que estos organismos causan enfermedad y por último, lleva-
rán a la producción de mejores vacunas y mejores estrategias
terapéuticas.
MUTAGÉNESIS DIRIGIDA AL SITIO
La síntesis química de oligonucleótidos permite a los investi-
gadores realizar una introducción controlada de sustituciones
de bases en la secuencia de DNA. La sustitución especificada
puede utilizarse para explorar los efectos de una mutación pre-
diseñada sobre la expresión génica, con el fin de examinar la
contribución de un aminoácido sustituido para una función
proteínica o (con base en la información previa respecto a los
residuos esenciales para su función) a fin de inactivar un gen.

Cebador mutado
G

GTGC CGTG

C G T G CA C G
CA
Secuencia GC CGTG
natural GT GTG
Replica A C CA
c C C
Plantilla de la pla ión
ntilla

Transformación en la
bacteria hospedadora
Heterodúplex de replicación

G CG GCA CGTG
GC T GT
G T CG C GC G A CGTGCAC
A A C
C
C

Forma mutante de replicación Forma natural de replicación

FIGURA 716 Mutagénesis dirigida al sitio. Un cebador sintetizado por medios químicos que contiene la mutación G (en el recuadro) se
hibridiza con una secuencia natural insertada en el DNA a partir de un fago monocatenario. Se utilizan reacciones de polimerización para formar
heterodúplex bicatenario que porta la mutación en una cadena. La introducción del heterodúplex en la bacteria hospedadora seguida de
segregación produce cepas que portan la forma de replicación con el DNA natural insertado o un fragmento insertado que adquiere la mutación
química diseñada.

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124 SECCIÓN I Fundamentos de microbiología
Los oligonucleótidos monocatenarios que contienen la muta-
ción específica se sintetizan por medios químicos y se some-
ten a hibridación con un fago con DNA monocatenario, el
cual lleva insertada la secuencia natural (figura 7-16). El DNA
bicatenario parcialmente resultante se convierte por medios
enzimáticos a una forma bicatenaria replicativa. Este DNA,
que contiene la secuencia natural en una cadena y la secuen-
cia mutante en otra se utiliza para infectar a la bacteria que
actuará como hospedador mediante transformación. La repli-
cación da origen a la segregación de DNA mutante y natural, y
el gen mutante bicatenario puede ser aislado y más tarde clo-
nado a partir de la forma replicativa del fago.
ANÁLISIS CON DNA CLONADO:
SONDAS DE HIBRIDACIÓN
Las sondas de hibridación (transferencia de Southern, figura
3-4) se utilizan de manera habitual para la clonación de DNA.
La secuencia de aminoácidos de una proteína puede utilizarse
para deducir la secuencia de DNA por medio de la cual puede
construirse una sonda y emplearse para detectar colonias bac-
terianas que contengan el gen clonado. El DNA complementa-
rio (cDNA, complementary DNA) codificado por mRNA puede
utilizarse para detectar el gen que codifica dicho mRNA. La
hibridación de DNA a RNA por el método de membrana de
Northern puede proporcionar información cuantitativa res-
pecto a la síntesis de RNA. Las secuencias específicas de DNA
en fragmentos de restricción separados en gel pueden reve-
larse por medio del método de transferencia de Southern, un
método que utiliza la hibridación de DNA a DNA. Estos méto-
dos pueden utilizarse para detectar superposición de frag-
mentos de restricción. La clonación de estos fragmentos hace
posible aislar las regiones que rodean al DNA por una técnica
conocida como deslizamiento cromosómico. Otra técnica de
detección empleada con frecuencia es la transferencia de tipo
Western, donde se utilizan anticuerpos para detectar genes
clonados mediante la unión con sus productos proteínicos.
Pueden utilizarse sondas en una amplia gama de pro-
cedimientos analíticos. Algunas regiones de DNA humano
muestran variación sustancial en la distribución de sitios de res-
tricción. Esta variabilidad se denomina polimorfismo de lon-
gitud de fragmentos de restricción (RFLP, restriction fragment
length polymorphism). Las sondas de oligonucleótidos que pro-
ducen hibridación con fragmentos de DNA de RFLP pueden
utilizarse para rastrear DNA a partir de muestras pequeñas
de su donador humano. Así, la técnica es útil para la ciencia
forense. Las aplicaciones de RFLP para la medicina incluyen la
identificación de regiones genéticas que tienen relación estre-
cha con genes humanos con disfunción que están relacionados
con enfermedades genéticas. Esta información ha sido de gran
utilidad y continua siéndolo en el consejo genético.
Las sondas de DNA ofrecen la promesa de técnicas para
la identificación rápida de microorganismos de crecimiento
lento en muestras clínicas que son difíciles de cultivar en un
laboratorio de microbiología. Además, extensiones de la téc-
nica ofrecen oportunidades para identificar agentes patógenos
en forma rápida y directa en tejidos infectados. Se encuentran
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disponibles en el mercado equipos para la identificación de
muchos patógenos bacterianos y virales.
La aplicación de sondas diagnósticas de DNA requiere
apreciar: 1) a las sondas mismas; 2) a los sistemas utilizados
para detectar las sondas; 3) los objetivos (el DNA con el cual
ocurrirá hibridación con las sondas) y 4) las condiciones de la
hibridación. Las sondas pueden ser fragmentos de restricción
relativamente grandes derivados del DNA clonado o de oligo-
nucleótidos correspondientes a una región específica del DNA.
Las sondas grandes pueden proporcionar gran precisión por-
que son menos sensibles a los cambios de una sola base en el
DNA estudiado. Por otra parte, las reacciones de hibridación
ocurren con mayor rapidez con sondas pequeñas, y pueden ser
diseñadas contra regiones conservadas de DNA en las cuales es
poco probable que ocurran sustituciones de bases. Las ampli-
ficaciones de una región estudiada por PCR seguida por detec-
ción de un producto amplificado después de hibridación con
una sonda han demostrado mayor sensibilidad que los méto-
dos de detección directa.
En fechas recientes han ocurrido mejorías significativas en
los métodos para pruebas diagnósticas moleculares, en especial
aquellas que incorporan tecnologías de amplificación de ácidos
nucléicos como PCR. A nivel comercial, se encuentran dispo-
nibles varios instrumentos que combinan la amplificación de
PCR del DNA estudiado de amplicones en el mismo contene-
dor cerrado. Esta tecnología se conoce como PCR en tiempo
real, lo que implica que los amplicones de PCR pueden detec-
tarse y cuantificarse en tiempo real. En la actualidad “tiempo
real” se refiere a la detección de amplicones después de cada
ciclo de PCR. Los formatos de detección con sonda implican la
detección de fluoróforos. Los resultados son semicuantitativos
y pueden obtenerse en un tiempo considerablemente menor
que el necesario para realizar un análisis de PCR convencional.
MANIPULACIÓN DEL DNA CLONADO
Las técnicas de ingeniería genética permiten la separación y
expresión completamente independiente de genes relacionados
con los patógenos. Las vacunas preparadas con genes creados
por ingeniería genética permiten medidas de seguridad que no
era posible lograr con anterioridad. Por ejemplo, puede prepa-
rarse una vacuna contra una proteína de la cubierta viral (antí-
geno de superficie del virus de la hepatitis B) que fue producida
en ausencia de cualquier gen relacionado con las funciones de
replicación viral; la inoculación con tales vacunas no implica el
riesgo de introducir un virus funcional. Las dificultades poten-
ciales en el desarrollo de tales vacunas radica en la facilidad
con la cual las mutaciones virales pueden producir variantes
genéticas que no son reconocidas por el sistema inmunitario
de defensa de un individuo vacunado. Por último, las vacunas
actuales (y en el futuro) contienen una amplia gama de proteí-
nas que anticipan la respuesta genética del patógeno.
Cepas recombinantes en el medio ambiente
Los avances científicos importantes han desencadenado en
ocasiones reacciones públicas adversas, de forma que es pru-
dente considerar las consecuencias potenciales de la ingeniería
genética. Un tema de preocupación más inmediata es conocer
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CAPÍTULO 7 Genética microbiana 125

si los patógenos han sufrido relativamente pocas modifica-
ciones genéticas. Éstas deben ser investigadas en laboratorios
diseñados especialmente para controlar a los microorganis-
mos. La necesidad de contención disminuye después que los
genes para las funciones específicas, como cubiertas proteíni-
cas, son separados de los genes relacionados con la replicación
o toxicidad de un patógeno. Sobre todo, deben observarse las
precauciones estándar relacionadas con laboratorios de micro-
biología, principalmente porque fomentan hábitos que son de
utilidad si un patógeno potencial entra al laboratorio.
Excepciones interesantes a esta regla general son los
microorganismos creados por ingeniería genética que pue-
den proporcionar beneficios sociales si se introducen al medio
ambiente. Muchos microorganismos se derivan de bacterias
no patógenas que se presentan naturalmente con frecuencia de
hasta 105/g de tierra. La evidencia disponible sugiere que la
depredación y competencia eliminan con rapidez a las cepas
de bacterias creadas por ingeniería genética después que se
introducen al medio ambiente. El reto primario sería mantener
los beneficios biológicos en el medio ambiente de los microor-
ganismos modificados por ingeniería genética, más que eli-
minarlos. Sin embargo, esto no está exento de consecuencias
sociales. Entre los ejemplos de microorganismos modificados
por ingeniería genética se encuentran las cepas de Pseudomo-
nas que producen una proteína que favorece la formación de
cristales de hielo. La utilidad de estos organismos naturales
es apreciada por propietarios dependientes utilizados para el
esquí, quienes de manera deliberada introducen las bacterias en
el ambiente sin despertar preocupaciones del público en gene-
ral. Un efecto secundario desafortunado de la introducción de
estos microorganismos es que los cristales de hielo favorecen el
daño de cultivos, por ejemplo de la lechuga, durante la tempo-
rada en la cual es probable que se presenten heladas leves. Las
bacterias mutantes que no forman cristales de hielo se diseña-
ron por microbiólogos quienes esperan que el microorganismo
mutante pueda proteger los cultivos de lechuga al ocupar tem-
poralmente el nicho que normalmente no es habitado por cepas
formadoras de hielo; sin embargo, los intentos para utilizar
microorganismos mutantes en estudios de campo se acompa-
ñaron de protestas sustanciales y los estudios se realizaron sólo
después de procesos judiciales prolongados y costosos. Los pre-
cedentes legales que han surgido de lo anterior, además de otras
aplicaciones similares recientes, establecerán las guías respecto
al uso progresivo y beneficioso de las técnicas de bioingeniería
genética y facilitarán el conocimiento de situaciones en que está
justificada la cautela extrema.
OBJETIVOS
1. Describir la estructura de un nucleótido, un par de bases y
la estructura líneal y tridimensional de DNA bicatenario.
2. Conocer las diferencias entre RNA y DNA en lo referente
a estructura, complejidad y tamaños relativos.
3. Identificar las funciones de formas de RNA, por ejemplo,
mRNA, rRNA, tRNA y ribozimas.
4. Detallar las diferencias básicas entre un cromosoma pro-
cariótico y otro eucariótico.
5. Explicar específicamente los términos que se han apli-
cado a la recombinación bacteriana y la transferencia
genética: transposones, conjugación, transformación y
transducción.
6. Describir los mecanismos de mutación bacteriana y redis-
posición génica.
7. Articular los medios fundamentales por los cuales son
transcritos los genes bacterianos que incluyan los con-
ceptos de transcripción y traducción acopladas, activador,
represor y atenuación.
8. Señalar las diferencias entre ribosomas eucarióticos y los
procarióticos y describir las fases en la traducción ribosó-
mica procariótica
9. Comprender el concepto de bioingeniería genética y
comentar los instrumentos importantes que intervienen
en tal proceso (como enzimas restrictivas, ligadura, clona-
ción y expresión).
10. Describir los instrumentos que permiten la identificación
del DNA: restricción, mapeo, secuenciación, mutagénesis,
hibridación y otros métodos de detección.
11. Apreciar los beneficios y posibles aspectos negativos de
bacterias recombinantes (obtenidas por bioingeniería) en
el entorno.
PREGUNTAS DE REVISIÓN
1. ¿Cuál es el mecanismo por el que pueden surgir mutaciones en
las bacterias?
(A) Sustitución de bases
(B) Deleciones
(C) Inserciones
(D) Reordenamiento
(E) Todas las anteriores
2. La forma de intercambio genético en el cual el DNA donador se
introduce en el receptor por medio de un virus bacteriano es:
(A) Transformación
(B) Conjugación
(C) Transfección
(D) Transducción
(E) Transferencia horizontal
3. La enzima DNAsa degrada el DNA desnudo. Si dos cepas de bac-
terias de la misma especie se mezclaron en presencia de DNAsa,
¿cuál método de transferencia génica sería inhibido con mayor
probabilidad?
(A) Conjugación
(B) Transducción
(C) Transformación
(D) Transposición
(E) Todos los anteriores
4. La replicación, ¿de cuál de los siguientes requiere la integración
física con el replicón bacteriano?
(A) Bacteriófago con DNA monocatenario
(B) Bacteriófago con DNA bicatenario
(C) Bacteriófago con RNA monocatenario
(D) Plásmido
(E) Transposón
5. La transformación de un par de bacterias durante el proceso de
conjugación en la Escherichia coli requiere:
(A) Lisis del donador
(B) Una pilosidad sexual

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