Laboratorio de biología molecular

Profesor: Dr. Francisco Javier Figueroa Martínez

Asistente de Profesor: Sarahi Cabrera Domínguez

Práctica 5: ENZIMAS DE RESTRICCIÓN (y ligación)

Introducción:
La práctica que llevarán a cabo revisa dos etapas muy importantes en la ingeniería genética, provee un
par de herramientas moleculares para cortar fragmentos de ADN en una secuencia específica, y utilizar
los fragmentos generados para fusionar (ligar) dos cadenas de ADN y construir una nueva molécula
“recombinante”. Durante el tema de replicación hablamos de las ligasas, enzimas encargadas de unir
cadenas de ácidos nucleicos durante la replicación; en el desarrollo de esta práctica, verán que las ligasas
son una de las herramientas más importantes en la tecnología del ADN recombinante, junto con las
llamadas “Enzimas de restricción”.

Las enzimas de restricción son endonucleasas (enzimas que pueden romper los enlaces fosfodiéster de un
ácido nucleico que no están en los extremos de la cadena) que cortan moléculas de ADN de doble cadena
en una secuencia específica. Originalmente, las enzimas de restricción fueron descubiertas por Werner
Arber (ganador del premio Nobel de Fisiología y Medicina en 1978 por su descubrimiento), quien las
identificó como un sistema de defensa bacteriano contra los bacteriófagos. Los bacteriófagos son
partículas virales que invaden a las bacterias y replican su propia información genética y eventualmente
pueden matar a la bacteria que funciona como hospedero. Las células que poseían endonucleasas de
restricción eran capaces de “restringir” el crecimiento del bacteriófago, cortando el DNA viral sin dañar el
genoma bacteriano.

En palabras de Sylvia, la hija de Werner Arber y en ese entonces de 10 años, “Cuando voy
al laboratorio de mi padre, usualmente veo algunas cajas sobre las mesas. Esas cajas
contienen colonias de bacterias. Esas colonias me recuerdan una ciudad con muchos
habitantes. En cada bacteria hay un Rey. El Rey es muuuuy largo, pero delgado. El Rey
tiene muchos sirvientes. Esos sirvientes son pequeños y gorditos, casi como pelotas. Mi
padre llama al Rey DNA y a sus sirvientes enzimas… mi padre descubrió un sirviente que
funciona como unas tijeras, Si un Rey extranjero invade una bacteria, este sirviente puede
cortarlo en fragmentos muy pequeños, pero este sirviente no hace ningún daño a su Rey”
(Konforti, 2000)

La importancia y versatilidad de las enzimas de restricción radica en que gracias a su gran especificidad
para reconocer una secuencia corta de DNA bicatenario e hidrolizar un enlace fosfodiéster en cada hebra,
siempre en la misma posición, se pueden utilizar como “tijeras moleculares” para generar fragmentos de
ADN que permitan el análisis de los patrones de restricción una secuencia de ADN (cuántos cortes y de
qué tamaño son los fragmentos generados por una enzima en particular), para la detección de
polimorfismos (cambios en la secuencia de nucleótidos de un gen que generan o destruyen sitios de
restricción) o fragmentos que puedan “ligarse” para producir DNA recombinante.
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Las enzimas de restricción se clasifican en tres grandes tipos, tipo I, tipo II y tipo III, pero en biología
molecular se usan las enzimas de restricción de tipo II porque son mucho más específicas, y cortan el ADN
en la secuencia de reconocimiento o muy cerca de ella. Las enzimas de restricción también pueden
clasificarse en enzimas que dejan extremos romos después del corte (cuando la endonucleasa corta ambas
cadenas en el mismo punto), o extremos cohesivos, cuando hace un corte asimétrico, de manera que en
los extremos algunas bases de una de las dos hebras de ADN quedan sin su base complementaria. (Observa
la figura 1).

Figura 1. Fragmentos de ADN cortados con una enzima de restricción que genera
extremos cohesivos (Eco RI) o con una que genera extremos romos (Eco RV). Nota que
las secuencias que reconoce cada enzima son distintas. (Modificado de Bertero 2017)

Los fragmentos de ADN obtenidos después de la restricción pueden unirse nuevamente utilizando otras
enzimas llamadas ligasas (como las que unen los fragmentos de Okasaki). Las DNA ligasas requieren como
sustrato dos extremos de DNA; un extremo 5’ (portador de un grupo fosfato (ver figura 1)) y un extremo
3’ (grupo hidroxilo de la desoxirribosa) para formar un nuevo enlace fosfodiéster, con el gasto de una
molécula de ATP. La ligasa puede unir tanto extremos romos como extremos cohesivos, siendo esta última
situación mucho más favorable y específica cuando los extremos cohesivos fueron obtenidos usando la
misma enzima de restricción, pues las bases no apareadas en cada extremo del ADN tienen a formar
puentes de hidrógeno entre ellas (ver Figura 2).
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Figura 2. Ligación de dos fragmentos de ADN que fueron obtenidos por restricción con la misma enzima
de restricción. Gracias a sus extremos cohesivos (los extremos son complementarios entre sí) el proceso
de ligación es más eficiente. La reacción requiere de Mg2+ (como cofactor) y de ATP.

Objetivos
● Comprender los fundamentos de la tecnología del ADN recombinante.

o Comprender el uso y versatilidad de las enzimas de restricción.

o Comprender la función de la DNA ligasa.

Información suplementaria

1.- Información general.

● Lee y analiza el texto “Fundamentos de construcción de plásmidos recombinante e importancia de

las enzimas de restricción y la ADN ligasa”.
● Revisa la página de Thermofisher y la de New England Biolabs ara que te des una idea del gran
número de enzimas de restricción con elevada especificidad, estabilidad y pureza disponibles
comercialmente. Si haces click en cualquiera de las enzimas, puedes encontrar su información y la
secuencia de ADN que reconoce para cortar. Revisa al menos 3 enzimas de restricción distintas.

2.- Vídeos:
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● Video breve de construcción de plásmido, ver desde el inicio hasta el minuto 5:20: Clonación de
ADN y ADN recombinante | Biología | Khan Academy en Español
● Breve descripción de las enzimas de restricción además de cómo podemos conocer los sitios de
restricción con herramientas virtuales: Enzimas de Restricción. Es importante que lo revises, porque
uno de los ejercicios de la práctica es muy similar a lo que hacen en el vídeo.

Actividades:

Practica en el Laboratorio:
En el laboratorio se cuenta con un par de plásmidos que se utilizan para la clonación y expresión de genes.
Los plásmidos son pKI que tiene 6777 pb y el plásmido pGPD de 6295 pb. El mapa de los plásmidos
incluyendo los sitios de restricción para 4 enzimas de restricción comunes en laboratorios de biología
molecular se muestran a continuación:

Se le proporcionará a cada equipo un tubo que contiene uno de los dos plásmidos. El objetivo de la práctica
es identificar de qué plásmido se trata utilizando enzimas de restricción.
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Material:
Para todos los equipos:

• Una micropipeta de 2- 10 microlitros o de 2-20 microlitros.

Para el equipo que preparará el gel:

• Una probeta de 50 ml
• Una espátula
• Un matraz Erlenmeyer de 250 ml

Se deben preparar 40 ml de gel al 1.2%

Para el equipo responsable del gel:

• Un equipo para electroforesis de agarosa.

Metodología:

1.- Cada equipo recibirá una muestra de plásmido y puede hacer una restricción. La muestra y la restricción que le
corresponde se asignará según su posición en el laboratorio:

2.- Preparar la reacción de restricción en un microtubo de 500 µL:

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Componente Volumen

DNA Plásmido 3 µl

Amortiguador de reacción + 3 µl
enzima de restricción

Agua 9 µl

Nota: El amortiguador de reacción y la enzima de restricción se venden en tubos separados. Preparamos la mezcla
antes por los pequeños volúmenes de enzima que se requieren para cada reacción.
3.- Incubar la reacción a 37 °C durante dos horas.

4.- Durante la incubación, el equipo responsable de preparar el gel de agarosa debe preparar 40 ml de
agarosa al 1.2% en TAE 1X.

5.- El equipo responsable del equipo de electroforesis debe preparar el equipo para realizar el gel. El gel
deberá tener para cargar las siguientes muestras: Marcador molecular, plásmidos sin digerir, plásmidos
digeridos con Bam HI y plásmido cortados con Pst I. (Dibujen en el pizarrón como van a cargar el gel)

6.- Todos los equipos deben dibujar un gel de agarosa en el que muestren cuáles son las bandas que
esperan ver al final del experimento. Deben entregar este gel al profesor antes de correr el gel
experimental.

Ejercicio para casa Restricciones.

Usando la secuencia de la práctica anterior (Citocromo C, Humano; I.D. JF919224.1) encuentra sus sitios de
restricción:
a. ¿Cuántos cortes de HaeIII tiene la secuencia?

b. Se realizaron reacciones de restricción utilizando las siguientes enzimas: Nco I, Eco RI, Hind III y Xma I
(cada una en una reacción por separado, es decir tienes 4 reacciones distintas). Posteriormente, se
realizó una electroforesis en gel de agarosa. Indica en el gel como se verían los fragmentos de ADN
resultantes. No olvides incluir el fragmento de ADN sin cortar en el último carril (el control).
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Nota: Para conocer los cortes realizados por las enzimas de restricción realiza lo siguiente:
1. Entra a NCBI y busca la secuencia del citocromo C correspondiente a Homo sapiens (Usa la
casilla de búsqueda para buscar el número de identificación de la secuencia: JF919224.1).
2. Copia la secuencia en formato FASTA (en los resultados, hay una en azul que dice “FASTA”).

3. Pega la secuencia en la página del NEB cutter (como lo hicieron en el segundo video) y presiona “submit”.
4. A continuación, se mostrará el mapa con los sitios de restricción en la secuencia.

Actividad extra: ¿Quieres ver cuantos sitios de corte tienen en verdad los plásmidos que utilizamos? Puedes
descargar las secuencias de los siguientes links y utilizar el NEB cutter para revisarlo.

pGDP: https://drive.google.com/file/d/1wuOQ7C7AT5hI-J5lPlz_K6U98rnPK09b/view?usp=sharing

pKI: https://drive.google.com/file/d/1ww63p5UNwdgYtmdcaSYKCTYJCDgLAsVG/view?usp=sharing
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Ejercicios para casa Reacción de ligación.

En un experimento independiente, se obtuvieron 3 fragmentos de ADN mediante cortes con enzimas de
restricción (indicadas en la imagen), y se intentó hacer una reacción de ligación con los fragmentos
obtenidos. Después del tiempo de ligación se hizo un gel de electroforesis para verificar el resultado. Los
fragmentos de DNA con los que se trabajó son los siguientes. Se indica el tamaño de cada fragmento, y las
enzimas utilizadas para la restricción.

a. Indica en el gel cómo se observarán los productos de las reacciones de ligación, así como su
tamaño.

1. Fragmento 1 y 2
2. Fragmento 1 y 3
3. Fragmento 2 y 3
b. ¿Todos los fragmentos se pudieron ligar? ¿Porqué?
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Reporte de práctica (por equipo)

● El reporte debe incluir los resultados, análisis y discusión de los resultados, una breve
conclusión y un cuestionario.
● El análisis de resultados debe incluir la comparación entre lo que obtuvieron en el gel
experimental y lo que pensaron que obtendrían en el gel teórico (punto 6 de la metodología).

Conclusión
Breve conclusión de la práctica. No olvides concluir respecto a la importancia de las enzimas de restricción y la DNA
ligasa para la tecnología del ADN recombinante.

Cuestionario de la actividad

1. ¿Cómo se asigna el nombre de las enzimas de restricción?

2. ¿Qué es un sitio de restricción?
3. ¿Cuál es el papel de las enzimas de restricción en la construcción de la ingeniería genética?
4. ¿Cuántas enzimas de restricción encontraste que se venden comercialmente?
5. ¿Qué ventajas tiene para la ingeniería genética que haya tantas enzimas de restricción?
6. ¿Qué es el NCBI? ¿Qué tipo de información puedes encontrar ahí?
7. ¿Qué opinas de que existan sitios en internet que pueden identificar sitios de restricción en una secuencia
de ADN? ¿Cuál es la utilidad de estos sitios?
8. ¿Cuál es el papel de la ligasa en la ingeniería genética?
9. ¿Se puede “ligar” cualquier par de segmentos de ADN?
10. ¿podrías haber usado los sitios de restricción de Kpn I o Hind III para identificar los plásmidos que se usaron
en la práctica?

Referencias:

● Bertero, Alessandro & Brown, Stephanie & Vallier, Ludovic. (2017). Methods of Cloning.
10.1016/B978-0-12-803077-6.00002-3.
● Konforti, B. The servant with the scissors. Nature Structural Biology 7, 99-100 (2000)