Reino Monera:

El reino monera o mónera esta formado por las bacterias, organismos unicelulares procariotas que no tienen membrana
nuclear ni una forma específica de nutrición. Pueden ser autótrofos -son capaces de crear su propia comida- o heterótrofos -
obtienen su fuente de alimentación de otros organismos-. El reino monera contiene organismos con las estructuras más simples
en comparación con los otros reinos.
Este reino agrupa a todos los seres vivos que son unicelulares (que tienen una sola célula). Se considera como el grupo más
primitivo del mundo y forma parte de los cinco reinos biológicos. También se le conoce con el nombre de prokaryota o
prokaryotae.

Célula procariota

La palabra monera se deriva de la palabra griega moneres que significa “único”. Se refiere a los procariotas unicelulares y son
las formas de vida más simples y antiguas del planeta Tierra. 
Las bacterias son universales porque se pueden encontrar en casi cualquier lugar, incluso en las condiciones más extremas. Se
encuentran en el aire que se respira e incluso en el estómago de los seres humanos y otros animales.
La mayoría de los organismos del reino monera se pueden reproducir por el tipo de reproducción asexual denominado fisión
binaria. En este proceso la célula copia su ADN y luego se divide en dos células idénticas.
El reino monera se clasifica en dos grupos: Archaebacteria y Eubacteria.
En el grupo Archaebacteria se encuentran microbios conocidos como extremófilos, capaces de vivir en condiciones extremas.
Se dividen en termófilos, halófilos y metanógenos.
En el grupo Eubacteria se encuentran las consideradas como verdaderas bacterias; poseen pared celular y un flagelo que ayuda
en el movimiento.
El taxón monera fue propuesto por primera vez como un filo por Copeland en 1866. En 1925 fue elevado al rango de reino por
Édouard Chatton.

Historia
En 1866 Ernst Haeckel  propuso el taxón monera como un phylum. Con el transcurrir de los años y tras muchas
investigaciones, en 1925 Édouard Chatton eleva al filo al rango de reino.
En 1969 se realiza la última mega clasificación comúnmente aceptada con el taxón monera. Se trata del sistema de
clasificación de cinco reinos establecido por Robert Whittaker.
Posteriormente en 1977, Carl Woese junto a sus colaboradores introducen el sistema de tres dominios basados en: bacteria,
archaea y eucarya.

Estructura
Se caracterizan por tener  células sin núcleo, sin mitocondrias, sin membrana nuclear y con una pared celular rígida que rodea
la membrana plasmática.
Debido a que no tienen núcleo, todo el material genético en las células flota libremente en el  citoplasma y las únicas partes de
la célula que la conforman son la pared celular y los ribosomas.
Los organismos del reino monera contienen ADN, el cual está incluido en el citoplasma llamado nucleoide.  El citoplasma se
encuentra encerrado por una membrana plasmática que está debajo de la pared celular compuesta por lípidos y proteínas.
Principales características del reino morena
Su reproducción es asexual
La reproducción  de estos organismos es de forma asexual y se multiplican por escisión o bipartición, durante un período corto.
Una bacteria puede producir hasta un millón de sucesores. La célula hace un duplicado de sí misma y una molécula de ADN
pasa a una célula recién formada, siendo estas dos células genéticamente idénticas.
La fisión binaria no permite que las bacterias adquieran diversidad genética, la cuál es necesaria para que las bacterias resistan
los ambientes cambiantes.

La fisión procariótica, fisión binaria, es una forma de reproducción asexua

l.
Las bacterias tienen la capacidad de mezclar genes a través de varios procesos. Estos procesos incluyen conjugación,
transformación y transducción.

Cilios y flagelos
Los organismos del reino monera se movilizan por la presencia de cilios o flagelos, aunque algunos son casi inmóviles.  Las
bacterias se mueven con extensiones parecidas a los cabellos conocidos como flagelos, que son más largos que los cilios pero
menores en número.
Los flagelos en procariotas son mucho más delgados que en eucariotas y se unen a la superficie de la célula en lugar de al
citoplasma.
Se pueden encontrar en el frente de la parte posterior de la bacteria, en ambos extremos, o en ocasiones en toda su superficie.
Los barridos de flagelo son un movimiento de hélice para ayudar a las bacterias a que se muevan.

Las bacterias también pueden moverse por la secreción de limo, y se deslizan a lo largo de las superficies. Sin embargo, otras
bacterias se mueven por filamentos axiales. Los filamentos axiales hacen que la celda gire y se mueva como un sacacorchos.

Poseen medios de defensas

Aunque no es algo obvio, los organismos en el reino monera sí tienen algunos medios de defensa.  En algunas especies de
bacterias, una cápsula formada por polisacáridos protege a la bacteria de los fagocitos (como los glóbulos blancos) y de la
desecación.
Ciertas bacterias también tienen medios de movimiento que pueden utilizar para alejarse de las cosas que puedan dañarlas.

Son resistentes
Cuando las condiciones de vida se vuelven demasiado duras para soportar a las bacterias, pueden desarrollar una dura pared
protectora alrededor de su ADN y un pequeño fragmento de citoplasma.
Esto crea una estructura altamente resistente y latente que es llamada endospora. El resto de la célula que permanece puede
morir.
Afortunadamente para la bacteria, la endospora puede resistir hasta años de congelación o sequía. Cuando las condiciones se
vuelven aptas para que las bacterias vuelvan a ser activas de nuevo, la endospora se vuelve una célula activa de nuevo.

Hábitat
Conformado por organismos procariontes de una célula, los miembros del reino monera pueden vivir de forma individual o en
grupos, y se pueden encontrar en todo tipo de hábitats, como los acuáticos, los terrestres y en el cuerpo humano.
Los organismos del reino monera pueden soportar temperaturas muy frías y muy altas, por lo que pueden vivir casi en
cualquier lugar. Algunos de estos organismos viven en los intestinos y benefician el proceso de digestión.
Sin embargo, constituyen un problema de salud para los integrantes del reino animal, dado que algunos organismos pueden
ocasionar peligrosas y mortales enfermedades.

Tamaño y forma
Pueden ser redondos, con forma de tirabuzón o sacacorchos, y algunos tienen pelos para la adhesión o flagelos en cola.
Son las estructuras celulares procariotas más simples y su tamaño es reducido, por lo general miden 1 micrómetro.

Diversos tipos de respiración

La respiración en estos organismos varía, pueden ser:

 Aerobios obligados: deben tener oxígeno para sobrevivir.

 Anaerobios obligatorios: no pueden sobrevivir en presencia de oxígeno.
 Anaerobios facultativos: pueden sobrevivir con o sin oxígeno.

Algunas bacterias son organismos autótrofos, es decir, obtienen el carbono del dióxido de carbono. A su vez, los organismos
que utilizan la luz para obtener su energía se conocen como fotoautótrofos.
Las quimiótrofos son las bacterias que reciben su energía de compuestos inorgánicos como el sulfuro de hidrógeno y el uso de
energía para ejecutar las actividades de la célula.
El resto de las bacterias son heterótrofos, organismos que obtienen carbono al ingerir moléculas orgánicas de organismos en
descomposición o por vivir en otro organismo conocido como huésped.

Las procariotas carecen de orgánulos

Con la excepción de los ribosomas, los procariotas carecen de orgánulos. Las células procariotas son células simples que no
tienen un núcleo o orgánulos unidos a la membrana. Tienen ADN y ribosomas.
No tienen orgánulos, ya que el citoplasma realiza el trabajo metabólico, y técnicamente solo se encuentra el ADN circular en la
región nucleoide y algunos ribosomas en un citoplasma procariótico.                     

Enriquecen el suelo
Las bacterias también enriquecen el suelo. Por ejemplo, los fijadores de nitrógeno convierten el nitrógeno del aire en nitrato,
que las plantas necesitan para vivir, y un número de cianobacterias ayudan a fijar los niveles de nitrógeno en la atmósfera.
Estas bacterias fotosintéticas también aportan grandes cantidades de oxígeno a la atmósfera. Las bacterias también
descomponen la materia y se utiliza para fertilizante.

Cuentan con rasgos especiales

Los fragmentos de ADN están en forma de plásmidos. A través de estos procesos las bacterias pueden obtener nuevos rasgos
que no podrían conseguir solamente a través de la fisión binaria.
Estos rasgos pueden incluir la capacidad de resistir el cambio en la acidez, la temperatura y también tienen la capacidad de
resistir los antibióticos.

Clasificación
El reino de monera  se clasifica en bacteria -Archaebacteria y archaea -Eubacteria-.

Bacteria
Las bacterias son los organismos más abundantes en el planeta y comprenden todos los microorganismos procariotas, que no
tienen núcleo definido. Son de diferentes tamaños y formas, una misma especie puede adoptar distintos tipos morfológicos.
Dependiendo de la especie pueden medir entre 0,5 y 5 μm, y algunas alcanzan los 0,5 mm. Las bacterias más pequeñas,
pertenecientes al género mycoplasma, llegan a medir solo 0,3 μm.
En ambientes naturales las bacterias se pueden anclar a determinadas superficies para formar un agregado celular en forma de
capa denominado biopelícula o biofilme, que puede congregar diversas especies bacterianas.
Las bacterias pueden sobrevivir en ambientes más extremos, como los manantiales de aguas calientes y ácidas, en desechos
radioactivos, en las profundidades del mar y en los hábitats terrestres.
En los seres humanos las bacterias también pueden sobrevivir y se encuentran en la piel y en el tracto digestivo.   Se estima que
existe aproximadamente diez veces más células bacterianas que células humanas.
Estas células bacterianas pueden ser inofensivas o beneficiosas. Sin embargo, algunas bacterias pueden causar enfermedades
respiratorias e infecciosas, incluyendo cólera, difteria, escarlatina, lepra, sífilis y tifus, entre otras.

Archaea
Las archaea son microorganismos que definen los límites de la vida en la Tierra.
Son unicelulares carentes de núcleo y son microscópicos. Sus células se encuentran envueltas en diversos materiales que les
confieren una alta resistencia a los antibióticos.
Aunque se parecen mucho a las bacterias, son muy distintas y tienen características muy particulares. Debido a ello, poseen un
gran potencial biotecnológico.
Viven en los ambientes más extremos del planeta. Se pueden conseguir en  ambientes como fuentes hidrotermales y fuentes
termales.
Son capaces de crecer en un ambiente de altas y bajas temperaturas; sobreviven a   elevadas concentraciones de sal o bajos pH,
donde es imposible la sobrevivencia de cualquier otro ser vivo.
Se pueden encontrar cerca de grietas en lo profundo del mar a temperaturas superiores a 100 °C, en aguas termales, o en aguas
extremadamente alcalinas o ácidas. Sobreviven en el tracto digestivo de las vacas, las termitas y la vida marina donde se
produce el metano.
Las archaea se alimentan de los compuestos inorgánicos, entre los que se encuentran el hidrógeno, dióxido de carbono,
alcoholes, azufre y fierro.
Son utilizadas para la producción de bioplásticos, que se degradan rápidamente y no contaminan. En la ciencia se usan como
modelo para la búsqueda de vida fuera del planeta Tierra.

Nutrición
La nutrición en el reino monera suele ser muy diversa. Sin embargo, puede decirse que tienen básicamente dos tipos de
nutrición: autótrofa y heterótrofa.

Nutrición autótrofa
Los procariontes autótrofos son aquellos que producen sus propios alimentos. La nutrición autótrofa se divide en
quimiosintética  y fotosintética.
La  nutrición quimiosintética es aquella en la que las bacterias generan sus alimentos con base en sustancias químicas
inorgánicas como fuente de energía.
La quimiosintética es el método utilizado por todas aquellas bacterias que se encuentran en lugares en donde no llega la luz
solar.
Por su parte, la nutrición fotosintética es utilizada por las bacterias, las plantas y algas que usan la luz solar para transformar la
materia inorgánica en materia orgánica  para su desarrollo.

Nutrición heterotrófica
Es la forma en que los organismos obtienen su alimento de otros organismos.
La nutrición heterotrófa tiene como fuente de nutrición el carbono orgánico. Existen tres tipos de nutrición heterotrófica en las
bacterias:

 Nutrición saprófita: es aquella en la cual las bacterias se alimentan de organismos en descomposición.

 Nutrición parásita: en este tipo de nutrición las bacterias se alimentan de organismos vivos.
 Nutrición simbiótica: la materia orgánica se obtiene de otro ser vivo, en donde ambos se benefician.

TIPOS DE BACTERIAS SEGÚN SU FORMA

Aunque muchas especies tienen formas irregulares, en general, las bacterias presentan algunas formas básicas:

las cocáceas o cocos: forma esférica

los bacilos: forma cilindrica
las espiroquetas: forma de espiral
y los vibriones: forma de coma
Las cocáceas, a su vez, se encuentran separadas en algunas especies y forman grupos de células
independientes en otras:

Diplococos: Estos grupos de células son generalmente de dos individuos

Tetracococos: Son grupos de células de cuatro individuos
Estreptococos: Son grupos de más individuos formando cadenas largas
Estafilococos: Forman masas irregulares parecidas a ramos de uvas
Ejemplos
Algunos ejemplos de organismos del reino monera son:

Bacilo de Koch
Es la bacteria causante de la tuberculosis.

Clamidia
Bacteria Gram negativa, causante de enfermedades de transmisión sexual.

Escherichia col
Conocida como E. coli, es un bacilo Gram negativo de la familia de las enterobacterias que produce infecciones
gastrointestinales.

Salmonella
Es una bacteria anaerobia que contamina los alimentos y genera trastornos intestinales en los seres humanos.

Clostridium Septicum
Es una bacteria anaerobia Gram positiva.  Forma parte de la flora intestinal de los humanos y es la causante de los abscesos,
grangrena, enterocolitis neutropénica y sepsis.

Vibrio
Es un género de bacterias incluidas en el grupo gamma de las proteobacterias. Provocan enfermedades en el tracto digestivo y
son las causantes del cólera.

Neisseria gonorrhoeae
Es un diplococo Gram negativo causante de la gonorrea, que es una enfermedad de transmisión sexual.

Helicobacter pylori
Es una bacteria de Gram negativa. Sobrevive solamente en el aparato digestivo de los seres humano.
En algunos casos se desconoce la presencia de la H. pylori dado que no se presenta ningún síntoma. Sin embargo, en otros
casos puede generar gastritis y úlceras, entre otras afecciones.
Staphylococcus
Son microorganismos que están presentes en la mucosa y en la piel de los humanos y de otros mamíferos y aves. El
Staphylococcus puede causar  diarreas, vómitos y náuseas.

Bifidobacterium
Es Gram-positiva, anaeróbica y no mótil. Son un grupo de bacterias que se asientan en los intestinos. Las bifidobacterias se
pueden utilizar para restaurar la flora intestinal.

Streptococcus
Es una bacteria formada por cocos Gram positivos. El  streptococcus se encuentra conformado por dos grupos.
Los streptococcus del grupo A producen infección en la garganta, en la piel, entre otros. Los streptococcus del grupo B son los
patógenos causantes de las infecciones en la sangre, neumonía y la meningitis en los recién nacidos.

Serpulina hyodysenteriae
Es una bacteria causante de la disentería porcina, que solo afecta a los cerdos.

Sorangium cellulosum
Es una bacteria Gram-negativa y tiene el genoma más grande conocido en una bacteria.

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Aspectos positivos del reino monera
El reino monera incluye bacterias que pueden alojarse en animales, humanos y plantas. Estas pueden ser favorables, dado que
matan organismos que causan enfermedades patógenas.
Otro de los aspectos positivos incluye su participación en la producción de antibióticos, como la estreptomicina, que se utiliza
para el tratamiento de infecciones.

CULTIVO DE BACTERIAS
Esterilización

En el laboratorio de Microbiología es imprescindible trabajar con material y soluciones estériles con objeto de que los
resultados que se obtengan correspondan al microorganismo o microorganismos que están presentes en la muestra en estudio y
no a contaminantes que procedentes del medio o los materiales, puedan desarrollarse y falsear las pruebas. Para ello antes de
comenzar el trabajo práctico se esterilizará, junto con los medios de cultivo, el material que posteriormente va a ser utilizado.
Se entiende por esterilización los procedimientos por los cuales se eliminan todas las formas vivas de microorganismos, sean
patógenos o no, que se hallen en un material. Esta esterilización suele efectuarse con calor húmedo en unos aparatos
denominados autoclaves.

¿Qué es el autoclave?

El autoclave es un instrumento habitual en los laboratorios de Microbiología. Es un sistema cerrado donde se forma vapor de
agua que se somete a una presión elevada, una atmósfera, lo que hace que el agua alcance una temperatura de 121ºC causando
la desnaturalización de enzimas lo que conlleva a la muerte de los microorganismos y la destrucción de las esporas.
Habitualmente,  se esteriliza a 121ºC durante 20 minutos.

Siembra

Sembrar o inocular es introducir artificialmente una porción de muestra (inóculo) en un medio adecuado, con el
fin de iniciar un cultivo microbiano, para su desarrollo y multiplicación. Una vez sembrado, el medio de cultivo se
incuba a una temperatura adecuada para el crecimiento.

Las reglas fundamentales para efectuar la siembra exigen:

 Que se efectúen asépticamente

 Que los medios de cultivo y el instrumental a utilizar estén esterilizados
 Que se realicen solo los manipuleos indispensables
 Que se trabaje fuera de toda corriente de aire. De ser posible utilizando un mechero o bien Flujo
laminar.

Existen diferentes tipos de siembra de acuerdo al medio utilizado y los requerimientos del microorganismo a
estudiar.

Medios sólidos:

 Siembra por inmersión: se coloca el inóculo en una placa o caja de Petri y sobre el mismo se vierte
 el medio de cultivo previamente fundido. Este método se utiliza para microorganismos aerobios.

 Siembra en doble capa: se procede de la misma manera que por inmersión. Una vez solidificado el
medio se vierte una cantidad extra de medio necesaria para cubrir la capa anterior (generalmente
10 ml. aprox.). Este método se utiliza para microorganismos anaerobios facultativos y
microaerofílicos.

 Siembra en superficie: se vierte sobre una placa de Petri el medio de cultivo fundido, se deja
solidificar y se coloca sobre la superficie el inóculo. Con ayuda de una espátula de Drigalsky se
extiende el inóculo hasta su absorción total por el medio de cultivo. Este tipo de siembra se
recomienda para microorganismos aerobios estrictos.

 Siembra en estría: se vierte sobre una placa de Petri el medio de cultivo fundido y se deja
solidificar
 Existen distintas técnicas para la siembra en estrías, el objeto es obtener colonias aisladas

Técnica A

Consiste en cargar el ansa con la muestra y hacer estrías paralelas en la

cuarta parte de la superficie de la placa, se quema el ansa, se enfría, se
gira la placa a 90° y se vuelve a estriar tocando 3 o 4 veces el área
sembrada inicialmente y cubriendo otro cuarto de la placa. Por último, sin
quemar el ansa, se estría el resto de la superficie sin sembrar.

Técnica B

Con el ansa cargada se hacen 3 o 4 estrías; se quema el ansa, se hacen 3 o 4

estrías perpendiculares a las anteriores, se quema el ansa y se repite el
procedimiento hasta agotar la superficie de la placa.

 Siembra en agar en tubo inclinado o bisel: en este caso se colocan 5 ml de medio de cultivo fundido y estéril,
se inclina el tubo y se deja enfriar.

El inóculo se siembra, con ayuda de ansa, de la siguiente manera:

En profundidad con ansa de punta: se pica con el

ansa el cultivo a sembrar y se introduce mediante
punsión en el medio contenido en la parte inferior
del tubo.

En superficie con ansa de aro: se pica con el ansa el

cultivo a sembrar y se esparce el mismo sobre la
superficie en bisel en forma de zigzag.
 Clasificación de los medios de Cultivo
Según sus cualidades físicas

 líquidos
 semisólidos
 sólidos
 Gaseosos
Según su origen

 Naturales: son los preparados a partir de sustancias naturales de origen animal o vegetal como ser extractos
de tejidos o infusiones y cuya composición química no se conoce exactamente.
 Sintéticos: son los medios que contienen una composición química definida cualitativamente y
cuantitativamente. Se utilizan para obtener resultados reproducibles.
 Semisintéticos: son los sintéticos a los que se les añaden factores de crecimiento bajo una forma de un
extracto orgánico complejo, como por ejemplo extracto de levadura.
Según su formulación

 Químicamente definidos: se conoce la cantidad exacta de cada uno de los compuestos que hay en el medio.
 Complejos: se realizan a partir de extractos naturales (extracto de levadura, sangre, etc.); no se conoce
exactamente cuál es la composición del medio; sin embargo, presenta la ventaja de que ya están presentes todos
o casi todos los elementos que una célula puede requerir.
Según su uso

 Medio general: medio en donde crecen todo tipo de microorganismos, excepto los que necesitan
condiciones especiales (por ejemplo, agar CLED).
 Medio selectivo: permite seleccionar el crecimiento de una especie o grupo determinado (hongos, bacterias
entéricas, protozoos...).
 Medio diferencial: permite identificar una especie con otra, ambas en el mismo medio. Puede ser por su
crecimiento, su metabolismo,su respiración, etc. (por ejemplo, medio de McConkey).
 Medio de enriquecimiento: contiene los nutrientes necesarios para apoyar el crecimiento de una amplia variedad de
microorganismos, se utiliza para la cosecha de diferentes tipos de microorganismos en un mismo medio.
 Medio mínimo: contiene la mínima cantidad de nutrientes posible que permite el crecimiento de una especie.
 Medio de transporte: preparado para servir como almacenamiento temporal a especímenes transportados o en
transferencia; mantienen su viabilidad y su concentración simple.

Resumen: clonación de ADN (Bacteriana)

Puntos más importantes:

 La clonación de ADN es una técnica de biología molecular que hace muchas copias idénticas de un
fragmento de ADN, como un gen.
 En un experimento típico de clonación, se inserta un gen blanco en un fragmento circular de ADN
llamado plásmido.
 El plásmido se introduce en bacterias mediante un proceso llamado transformación y las bacterias que
contengan el plásmido se seleccionan mediante antibióticos.
 Las bacterias con el plásmido correcto se utilizan para hacer más ADN plasmídico o, en algunos casos, se
induce la expresión del gen para hacer proteína.

Introducción

Cuando escuchas la palabra "clonación" tal vez pienses en la clonación de organismos completos, como Dolly la
oveja. Sin embargo, lo único que significa clonar algo es hacer una copia genéticamente exacta de ese algo. En un
laboratorio de biología molecular, lo que se clona con más frecuencia es un gen u otro fragmento pequeño de ADN.

Si tu amiga la bióloga molecular dice que su "clonación" no está funcionando, es casi seguro que está hablando de
copiar fragmentos de ADN, ¡no de hacer la siguiente Dolly!
 Resumen de la clonación de ADN

La clonación de ADN es el proceso de hacer múltiples copias idénticas de un fragmento particular de ADN. En un
procedimiento típico de clonación de ADN, el gen u otro fragmento de ADN de interés (tal vez el gen de una proteína
humana médicamente importante) se inserta primero en un fragmento circular de ADN llamado plásmido. La
inserción se realiza con enzimas que "cortan y pegan" ADN y se obtiene una molécula de ADN recombinante, ADN
ensamblado de fragmentos provenientes de múltiples fuentes.

Diagrama que muestra la construcción de una molécula de ADN recombinante. Un fragmento circular de ADN
plasmídico tiene extremos irregulares que coinciden con los de un fragmento del gen. El plásmido y el fragmento de
gen se unen para producir un plásmido que contenga el gen. Este plásmido que contiene el gen es un ejemplo de ADN
recombinante, una molécula de ADN ensamblada a partir de ADN de múltiples fuentes.

A continuación, se introduce el plásmido recombinante en bacterias. Se seleccionan las bacterias que contengan el
plásmido y se cultivan. Al reproducirse, estas replican el plásmido y lo pasan a su descendencia, y de esta forma
hacen copias del ADN que contienen.

¿Qué sentido tiene hacer muchas copias de una secuencia de ADN en un plásmido? En algunos casos, necesitamos
muchas copias de ADN para realizar experimentos o construir nuevos plásmidos. En otros casos, el fragmento de
ADN codifica una proteína útil y las bacterias se utilizan como "fábricas" para producir la proteína. Por ejemplo, el
gen de la insulina humana se expresa en bacterias E. coli para producir la insulina que usan los diabéticos.

Los pasos de la clonación de ADN

La clonación de ADN se utiliza para muchos propósitos. Como ejemplo, veamos cómo la clonación de ADN se
puede utilizar para sintetizar una proteína (como la insulina humana) en bacterias. Los pasos básicos son:

1. Abrir el plásmido y "pegar" el gen dentro. Este proceso depende de enzimas de restricción (que cortan el
ADN) y de ADN ligasa (que une el ADN).
2. Transformar bacterias con el plásmido. Se usa selección con antibióticos para identificar las bacterias que
incorporaron el plásmido.
3. Cultivar bacterias portadoras de plásmido en gran cantidad y usarlas como "fábricas" para producir la
proteína. Recolectar la proteína de las bacterias y purificarla.
Revisemos con más detalle cada paso.

1. Cortar y pegar el ADN

¿Cómo pueden unirse fragmentos de ADN de diferentes fuentes? Un método habitual utiliza dos tipos de
enzimas: enzimas de restricción y ADN ligasa.

Una enzima de la restricción es una enzima que reconoce una secuencia blanco específica y corta el ADN en dos en
ese lugar o en un sitio cercano. Al cortar, muchas enzimas de restricción producen extremos de cadena sencilla cortos
que sobresalen. Si dos moléculas tienen extremos sobresalientes que se empatan, pueden complementar sus bases y
unirse. Sin embargo, no se combinan para formar una molécula de ADN completa hasta que la ADN ligasalas une
sellando los espacios en el esqueleto del ADN.
 Nuestro objetivo al clonar es insertar un gen blanco (el de la insulina humana, por ejemplo) en un plásmido.
Con ayuda de una enzima de restricción cuidadosamente elegida, digerimos:

 El plásmido, que solo tiene un sitio de corte.

 El fragmento del gen blanco, que tiene un sitio de corte cerca de cada extremo.
Luego, combinamos los fragmentos con ADN ligasa, la cual los une para formar un plásmido recombinante que
contenga el gen.

Diagrama que representa la digestión con enzimas de restricción y la ligación en un esquema simplificado.

Empezamos con un plásmido bacteriano circular y un gen blanco. En ambos extremos del gen blanco hay sitios de
restricción, secuencias de ADN reconocidas por una enzima de restricción particular. En el plásmido, también hay un
sitio de restricción reconocido por esa misma enzima, justo después de un promotor que dirigirá su expresión en
bacterias.

El plásmido y el gen blanco (por separado) se digieren con la enzima de restricción. Los fragmentos se purifican y se
combinan. Ambos tienen "extremos cohesivos", o salientes de ADN de cadena sencilla, por lo que pueden pegarse.

La enzima ADN ligasa une los fragmentos con extremos complementarios para formar una única molécula completa
de ADN. Esto produce un plásmido recombinante que contiene el gen blanco.

2. Transformación y selección bacteriana

Mediante el proceso llamado transformación pueden introducirse plásmidos y otros tipos de ADN en bacterias,

como la inofensiva E. coli que se usa en los laboratorios. Durante la transformación, células bacterianas preparadas
especialmente se someten a un choque (como alta temperatura) que las anima a incorporar ADN extraño.
 El ADN producido en la ligación (que puede ser una mezcla de plásmidos deseados, plásmidos de productos
secundarios y fragmentos de ADN lineal) se agrega a las bacterias. Las bacterias se someten a un golpe de calor, que
mejora la eficacia con la que el ADN entra durante la transformación. Sin embargo, solo una pequeña minoría de las
bacterias incorporará con éxito un plásmido.

Típicamente, los plásmidos contienen un gen de resistencia a antibióticos que permite a las bacterias sobrevivir en
presencia de un antibiótico específico. Así, las bacterias que incorporan el plásmido pueden seleccionarse en placas
de medio de cultivo que contenga el antibiótico. Las bacterias sin plásmido morirán, mientras que las bacterias que
contienen plásmido pueden vivir y reproducirse. Cada bacteria sobreviviente dará lugar a un pequeño grupo con
forma de punto, o colonia, de bacterias idénticas que contienen el mismo plásmido.

Panel de la izquierda: diagrama de un plásmido que contiene un gen de resistencia a antibióticos.

Panel de la derecha: todas las bacterias de la transformación se colocan en una placa con antibióticos. Las bacterias
sin plásmido mueren a causa del antibiótico. Cada bacteria que tenga plásmido forma una colonia, un grupo de
bacterias clonales que contienen el mismo plásmido. Una colonia típica se ve como un punto pequeño y blanquecino
del tamaño de una cabeza de alfiler.

No necesariamente todas las colonias contendrán el plásmido adecuado. Eso es porque, durante una ligación, los
fragmentos de ADN no siempre se "pegan" exactamente como queremos. Por el contrario, debemos recolectar ADN
de varias colonias y ver si cada una contiene el plásmido correcto. Se usan métodos como la digestión con enzimas de
restricción y la PCR para revisar los plásmidos.

3. Producción de proteínas

Una vez que hemos encontrado una colonia de bacterias con el plásmido adecuado, podemos hacer crecer un gran
cultivo de bacterias que contengan el plásmido. Luego le damos a las bacterias una señal química que les ordena
producir la proteína blanco.

Las bacterias sirven como "fábricas" miniatura que producen grandes cantidades de proteína. Por ejemplo, si nuestro
plásmido contuviera el gen de la insulina humana, las bacterias comenzarían a transcribir el gen y traducir el ARNm
para producir muchas moléculas de la proteína de la insulina humana. 
 La colonia elegida crece en un cultivo grande (en un matraz de 1 litro, por ejemplo). Se induce la expresión del gen
contenido en el plásmido en las bacterias de ese cultivo, con lo que el gen blanco se transcribe en ARNm y el ARNm
se traduce en proteína. La proteína codificada por el gen se acumula dentro de las bacterias.

Una vez que se ha producido la proteína, las células bacterianas pueden romperse para liberarla. Hay muchas otras
proteínas y macromoléculas flotando en las bacterias además de la proteína blanco (la insulina en nuestro ejemplo).
Debido a esto, la proteína blanco debe ser purificada o separada del resto del contenido de las células con técnicas
bioquímicas. La proteína purificada puede utilizarse en experimentos o, en el caso de la insulina, administrarse a
pacientes. 

¿Realmente es tan simple hacer insulina?]

Pues... sí y no. La insulina recombinante que hacen las compañías farmacéuticas de verdad se genera en bacterias y se
expresa de un plásmido que contiene un gen modificado de la insulina humana. La insulina que producen las
bacterias se purifica mediante un tipo de columna de purificación.

Sin embargo, producir insulina biológicamente activa requiere algunos pasos adicionales. La insulina se produce
como una cadena polipeptídica única. Sin embargo, se deben formar puentes disulfuro dentro de la cadena y parte de
ella debe cortarse para formar dos cadenas separadas (que se mantienen juntas únicamente por los puentes disulfuro).
Solo entonces la insulina es biológicamente activa, es decir, capaz de actuar como una hormona en el cuerpo de un
paciente.

La producción de insulina que pueden usar los diabéticos requiere que estos pasos adicionales se incorporen al
procedimiento de purificación de proteína para que la proteína insulina alcance su forma tridimensional correcta.

Usos de la clonación de ADN

Las moléculas de ADN construidas mediante técnicas de clonación se utilizan para muchos fines en la biología
molecular. Una breve lista de ejemplos incluye:

 Productos biofarmacéuticos. La clonación de ADN puede utilizarse para producir proteínas humanas con
aplicaciones biomédicas, como la insulina mencionada anteriormente. Otros ejemplos de proteínas recombinantes
incluyen la hormona del crecimiento humana, que se administra a pacientes que son incapaces de sintetizarla, y el
activador tisular del plasminógeno (tPA), que se utiliza para tratar infartos y prevenir coágulos sanguíneos. Proteínas
recombinantes como estas suelen producirse en bacterias.
 Terapia génica. En algunas transtornos genéticos, los pacientes carecen de la forma funcional de un gen en
particular. La terapia génica intenta proporcionar una copia normal del gen a las células del cuerpo del paciente. Por
ejemplo, la clonación de ADN se utilizó para construir plásmidos que contuvieran una versión normal del gen que
falla en la fibrosis quística. Cuando se suministraban los plásmidos a los pulmones de pacientes con fibrosis quística,
la función pulmonar se deterioraba más lentamente^22start superscript, 2, end superscript.
 Análisis genético. En laboratorios de básica investigación, los biólogos suelen usar la clonación de ADN
para crear versiones recombinantes artificiales de genes que les ayudan a entender cómo funcionan los genes
normales de un organismo. 
Estos son solo algunos ejemplos de cómo hoy en día se utiliza la clonación de ADN en la biología. La clonación de
ADN es una técnica muy común que se utiliza en una gran variedad de aplicaciones de la biología molecular

Esquema resumene de clonación bacteriana