Técnicas de Tinción

Microbiología y Biotecnología
Juan Pablo Delgado

Objetivo
El objetivo principal de esta práctica es mediante el uso de distintas técnicas de tinción lograr
visualizar los microorganismos al microscopio, logrando detallar la estructura y morfología
microbiana.
Introducción
La mayoría de los microorganismos presentes en la tierra son muy pequeños para ser
visualizados a ojo humano, por ende, se hace uso de diferentes técnicas de tinción como un
auxiliar y poder mejorar el contraste de la imagen vista en el microscopio.
En esta práctica se van a realizar tres técnicas de tinción, dos para bacterias y una tinción
para hongos. El procedimiento de tinción para bacterias será: tinción de gram y tinción de
esporas. Y la técnica para los hongos será mediante una tinción de azul de lactofenol.
Lista de materiales:
• Asa redonda
• Portaobjetos
• Cubreobjetos
• Caja de Petri
• Cristal violeta
• Lugol
• Alcohol acetona
• Fuscina
• Microscopio
• Reactivo verde de malaquita
• Reactivo azul de lactofenol
• Cinta adhesiva

Procedimiento
Bacterias:
Primero realizaremos la tinción de gram, para ello se tomará una pequeña muestra de nuestra
siembra por agotamiento que se realizo anteriormente y se hará un frotis (distribución de la
muestra por la superficie del portaobjetos). Una vez cubierto el porta objetos, se va a calentar
cuidadosamente con un mechero, esto para fijarlos bien en la superficie del portaobjetos.
Una vez fijados se realiza la tinción de gram, esta consiste de cuatro pasos:
1. Se agrega el reactivo cristal violeta (que su función será teñir el interior de la célula)
y se deja actuar por un minuto, después de ese lapso de tiempo se hace un lavado con
agua destilada y se continua con la tinción de gram.
2. Como segundo paso se agrega un poco de Lugol y se deja por un minuto (el Lugol
interacciona con la pared celular), una vez terminado el minuto se vuelve hacer un
lavado.
3. El siguiente proceso en la tinción de gram es desteñir, para ello se agrega alcohol
acetona durante treinta segundos y una vez termina ese tiempo, se hace un lavado
para retirar el exceso de alcohol acetona. El proceso de desteñir es solo para el caso
de bacterias gram negativas puesto que, las gram positivas ya están
impermeabilizadas.
4. Como último paso se le agrega fuscina y se deja durante un minuto, una vez se termina
ese último minuto se hace un lavado para poder pasar al microscopio. Si se hizo un
correcto procedimiento de tinción de gram, las bacterias gram negativas debieron
haber quedado teñidas de rosado en este último procedimiento, en cambio las gram
positivas debieron haber quedado desde un primer instante de color morado.
Ya habiendo lavado el portaobjetos después de la fuscina, se coloca un cubreobjetos y se
pasa al microscopio a observar en 100x para lograr identificar la estructura del
microorganismo y el tipo de característica gram.
La segunda técnica de tinción para bacterias es por esporas, para ello se toma una muestra de
una bacteria de tipo bacillus y se hace un frotis sobre la superficie de un portaobjetos, una
vez hecho el frotis se hace nuevamente una fijación con la llama del mechero. Cuando ya
esta fijada la bacteria se agrega el reactivo verde de malaquita y se comenzara a flamear (ir
colocando y sacando el portaobjetos de la llama del mechero) constantemente, esto para
liberar gases, el proceso de flameo va durar 5 minutos y si se llega a acabar el reactivo se le
volverá a colocar para que no se acabe. Este proceso con de flamear con el verde de malaquita
se hace para permeabilizar la pared celular.
Una vez pasan los cinco minutos, se le agregará fuscina y se deja actuar durante un minuto,
esta fuscina es para generar contraste en donde las células se tiñen de rosado, mientras que
la espora queda de color verde. Después de que pasa el minuto con la fuscina, se hace un
lavado con agua destilada para retirar el exceso de reactivo. Ahora ya lavado nuestra muestra,
se cubre con un cubreobjetos y se pasa al microscopio para observar su estructura y la
presencia de esporas.
Hongos
Por medio del cultivo de hongo que se realizo en la practica anterior se realiza esta práctica,
para ello se toma un pedazo de cinta adhesiva y se pasa por encima del hongo para que haya
contacto, una vez se pasa la cinta, se retira con cuidado.
Con un portaobjetos se colocará una gota de azul de lactofenol y con el pedazo de cinta que
porta el hongo se colocará sobre este, es decir, que el reactivo tenga contacto directo con el
hongo, una vez hecho esto se coloca un cubre objetos y se pasa a observar en el microscopio.