PRÁCTICA 4

TINCIÓNES DIFERENCIALES: GRAM Y

ENDOSPORAS

INTRODUCCIÓN
Las tinciones diferenciales son aquellas tinciones que se usan para diferenciar de manera más
explicita los microorganismos y las estructuras propias de las células.

En esta práctica el principal objetivo es diferenciar la tinción de Gram y la tinción de

endosporas y sus respectivos usos. Además, aprenderemos a hacer ambas tinciones siguiendo
los pasos adecuados.

La principal diferencia de la tinción de Gram y la de endosporas es que en la primera la

diferencia dependerá del grosor de la capa de peptidoglicano, lo que da como resultado
células moradas y rosadas; y en la segunda tinción, predomina el verde de malaquita para
distinguir entre células metabólicamente activas y estructuras latentes.

PROCEDIMIENTO
La tinción de Gram la realizamos a partir de un medio liquido, para las mesas pares
Pseudomonas aeruginosa (Gram -) y para las impares, mi caso, Staphylococcus aureus.

Los pasos anteriores a tinción son los siguientes:

1. Esterilizar el asa por contacto directo con la llama, colocando esta vertical a la llama.
2. Dejamos enfriar el asa a la vez que abrimos el bote con los microorganismos, cerca de
la llama, como máximo a unos 30 centímetros de esta.
3. Tomamos una o dos muestras de nuestros microorganismos con el asa y las colocamos
en un portaobjetos.
4. Esterilizamos de nuevo el asa.
5. Secamos la muestra, ya que los microorganismos se encontraban en un medio líquido,
a una distancia óptima, a la cuál nuestros microorganismos eviten la lisis.
6. Fijamos la muestra flameándola unas tres veces
Para comenzar, definitivamente, con la tinción de Gram, teñiremos la muestra con violeta de
Genciana, de esta forma se tiñen tanto los microorganismos Gram + como los Gram -, y dejar
reposar la muestra durante un minuto. A continuación, lavamos con agua destilada para
eliminar el exceso. Seguidamente, cubriremos la muestra con Lugol y volveremos a dejarlo
actuar durante un minuto. Acto seguido, lavaremos con decolorante de Gram durante unos
quince segundos y aclararemos con agua destilada. Por último, echamos safranina, que
solamente atraviesa la pared de las bacterias Gram +, un minuto después lavamos con agua
destilada y secamos para su posterior observación.

La tinción de endosporas la realizaremos a partir de un medio sólido, a partir de una colonia de

bacilos crecida en una placa de agar nutritivo de la práctica 6.

Antes de comenzar con la tinción hay que seguir unos pasos previos: primero esterilizamos el
asa para la obtención de microorganismos de nuestro medio sólido. Más tarde, colocamos una
pequeña gota de suero fisiológico en un portaobjetos y ponemos la muestra obtenida con el
asa encima, todo este proceso debe realizarse a unos 30 centímetros del asa. A continuación,
como en el caso de la tinción de Gram, secamos y fijamos la muestra para comenzar con la
tinción.

Para la tinción de endosporas seguiremos los siguientes pasos:

1. Cubrir abundantemente con verde de malaquita en ebullición, sin permitir que se

evapore, entre 5 y 10 minutos.
2. Lavar durante 30-60 segundos con agua destilada.
3. Cubrir durante 1 minuto con safranina, con la misma intención que en la tinción de
Gram.
4. Lavar y secar la preparación para poder ser observada al microscopio.

RESULTADOS

En esta foto, realizada por mis compañeros, se

observan Pseudomonas aeruginosa, que como
sabemos, son Gram -, pero también lo podemos
comprobar observando colonias de bacilos.

Sin embargo, en esta foto observamos Staphylococcus aureus, que

como sabemos son Gram + y podemos comprobarlo observando
colonias de cocos.
Por último, en la tinción de endosporas, aunque no encontramos colonias grandes como en las
fotografías anteriores, podemos observar esporas y células vegetativas, aunque sin distinción
en esta primera imagen resulta muy difícil. En cambio, en la segunda imagen, no propia,
podemos diferenciar de verde las esporas (2), de rojo las células vegetativas (1) y los dos
colores juntos marcan la presencia de una célula vegetativa con endosporas (3).

CONCLUSIÓN
Podemos concluir con la gran diferencia entre ambas tinciones. En el caso de la tinción de
Gram hemos observado dos tipos de microorganismos, uno Gram + y otro Gram –, y hemos
aprendido a diferenciarlos dependiendo de la forma que tengan las bacterias. En el caso de la
tinción de endosporas, hemos aprendido una nueva tinción y un nuevo colorante, además de
que hemos aprendido a diferenciar por color y formas las esporas de las células vegetativas.