CROMATOGRAFIA LIQUIDA DE ALTA RESOLUCION

La cromatografía líquida resulta de gran importancia dado que la mayoría de

los compuestos no son suficientemente volátiles como para poder ser
separados de forma directa mediante cromatografía de gases.

FUNDAMENTOS

El nombre de cromatografía líquida de alta resolución (HPLC, high

performance liquid chromatography) se emplea para distinguir los métodos
actuales de cromatografía líquida, que utilizan columnas de longitudes
comprendidas entre 3 y 30 cm con rellenos de tamaño de partícula de diámetro
de 3 a 10 µm, de los métodos clásicos de cromatografía líquida (LC) en los
que las columnas empleadas tienen longitudes de 50 a 500 cm y diámetros de
partícula de 150 a 200 µm. Por tanto, en HPLC se aplica una presión elevada
para forzar a la fase móvil a pasar por una columna que contiene partículas
muy pequeñas, consiguiendo así separaciones con gran resolución.
Una tendencia actual de la cromatografía líquida es la UPLC (ultra
performance liquid chromatography o ultra pressure liquid chromatography)
en la que las columnas son extremadamente cortas y rellenas con partículas de
diámetro inferior a 2 µm, trabajándose con instrumentación que soporta altas
presiones y con capacidad para resolver mezclas complejas en intervalos de
tiempo muy estrechos.
Tabla de clasificaicon de las tecnicas de cromatografia liquida
Método Técnica Fase estacionaria Tipo de equilibrio

LC Reparto Líquido Distribución entre líquidos inmiscibles

adsorbido sobre
un sólido
Reparto con Especies Distribución entre líquido y superficie
fases orgánicas enlazada
enlazadas enlazadas a una
superficie sólida
Adsorción Sólido Adsorción

Intercambio Resina de Int. Intercambio iónico

iónico Iónico
Exclusión Líquido en Distribución/Exclusión
por tamaño intersticios de un
sólido polimérico

Recordemos de la clasificación de los métodos cromatográficos atendiendo al

tipo de fases móvil y estacionaria así como al tipo de equilibrio, explicada en
el tema 16, que hablamos de cromatografía líquida (LC) cuando la fase móvil
se halla en estado líquido, y que de acuerdo con el tipo de fase estacionaria
empleada tenemos técnicas diferentes de LC para las que los equilibrios se
basan en distribución entre líquidos, adsorción, intercambio iónico o
exclusión.
Una de las técnicas de LC más usadas en la práctica es de reparto o partición
ya sea la modalidad básica o con fases enlazadas, en ocasiones también nos
referimos a ella como cromatografía líquido-líquido. La separación de los
componentes de la mezcla tiene lugar por distribución de los mismos entre las
dos fases líquidas, fundamentada en las diferencia de solubilidad entre dichos
componentes.
En cuanto a la LC de adsorción, la fase estacionaria es sólida (sílice o
alúmina), y los componentes de la mezcla se separarán según su distinta
tendencia a adsorberse sobre la superficie del sólido.
En las diapositivas siguientes se explica a partir de esquemas como tiene lugar
la separación en cromatografía líquida de intercambio iónico y de exclusión
por tamaños.
Cromatografía líquida de intercambio iónico. El proceso de intercambio
iónico es un equilibrio heterogéneo. Los cambiadores de iones son redes
tridimensionales de macromoléculas cargadas, a las que solemos referirnos
como resinas. Estas sustancias sólidas pueden tomar iones de una disolución,
cediendo otros de la misma carga a la disolución en cantidad equivalente. Los
intercambiadores iónicos pueden clasificarse en dos tipos principales:
catiónicos y aniónicos.
En la diapositiva se muestra una figura para cromatografía de intercambio
aniónico para el que la resina tiene carga positiva. Por tanto, las especies
cargadas negativamente se unirán a la resina, mientras que las que presenten
carga positiva, serán rechazadas por la resina, siendo eluidas de la columna.
Para conseguir la elución posterior de las especies negativas que han sido
retenidas se puede ir cambiando el pH de la fase móvil hasta igualarlo con el
punto isoeléctrico de la especie a eluir o hasta invertir su carga neta.
Un razonamiento similar se haría para resinas de intercambio catiónico, en
este caso las especies retenidas serían las cargadas positivamente. Ejemplos de
equilibrios de intercambio puede verse en la diapositiva para un
intercambiador catiónico tipo sulfónico y un intercambiador aniónico tipo
amina cuaternaria.
En la cromatografía de exclusión por tamaños también llamada de geles, la
fase estacionaria es un sólido polimérico compuesto por unas bolas de gel, que
presentan unos canales o intersticios en su estructura. Los componentes de la
mezcla se separan de acuerdo con su tamaño molecular, de modo que las
moléculas más pequeñas tendrán acceso a dichos canales, por los que la fase
móvil viaja a menor velocidad que por el exterior de las moléculas del gel. Las
especies de mayor tamaño molecular no tienen acceso a los canales del gel,
por lo que viajan a mayor velocidad, siendo eluidas antes de la columna
cromatográfica que lo hacen las especies cuyas moléculas son más pequeñas.
Debido a su fundamento, a esta técnica también se le conoce como
cromatografía de exclusión molecular o de exclusión por tamaños.

Instrumentación
La imagen muestra los principales componentes de la instrumentación
empleada en cromatografía líquida, a través de la fotografía de un equipo
comercial, siendo éstos: depósitos de fase móvil, bomba cromatográfica,
sistema de inyección, columna cromatográfica y detector.

Depósitos de fase móvil.

Existen desde equipos comerciales tan simples que solamente cuentan con un
recipiente de fase móvil, hasta aquellos con cuatro recipientes, que permiten
por tanto hacer de forma automática las mezclas de disolventes requeridas
para la separación. Los depósitos de los disolventes suelen ser de vidrio. Con
frecuencia incluyen dispositivos para eliminar los gases disueltos y partículas
sólidas, que puedan interferir en el funcionamiento del detector así como crear
canales o contaminar la columna cromatográfica.
Salvo en la cromatografía de exclusión molecular, la fase móvil tiene un papel
activo en todas las técnicas de LC. Por tanto, la adecuada selección de la fase
móvil es una de las decisiones más importantes en la optimización de una
separación mediante LC.
La fotografía muestra los componentes de un cromatógrafo líquido que
dispone de un único reservorio de fase móvil, y por tanto sólo permite trabajar
en modo de elución isocrática (modalidad que será explicada más adelante).
Además a diferencia del sistema mostrado en la diapositiva anterior, la
inyección de muestra tiene lugar por medio de una válvula de lazo o bucle de
muestra.
Los sistemas de bombeo o bombas cromatográficas empleadas en HPLC han
de cumplir una serie de requisitos:
 Ser capaces de proporcionar altas presiones, como mínimo superiores a
6000 psi.
 El flujo de disolvente liberado ha de encontrarse libre de impulsos.
 Deben ser capaces de proporcionar velocidades de flujo de fase móvil
entre 0,1 y 5 mL min-1, que son los valores habituales de trabajo.
 El flujo suministrado ha de presentar una reproducibilidad en torno al
valor programado de un 0,5%, como mínimo. Esto implica que para un
flujo programado de 2 mL min-1, el flujo real debe estar comprendido
durante toda la separación entre 1,99 y 2,01 mL min-1.
 El sistema estará fabricado de material resistente a la corrosión,
considerando la posibilidad de utilizar disoluciones de carácter ácido
y/o básico como fase móvil.
En la diapositiva se muestra una fotografía de una parte del sistema de
bombeo en un cromatógrafo líquido, obsérvese a la izquierda los cuatro
canales de entrada de disolventes desde sus recipientes contenedores
(nombrados de A a D). Las bombas vienen internamente provistas de un
pistón oscilante, válvulas de control de flujo y atenuadores de pulso, para
proporcionar valores de flujo exactos y precisos.
La inyección de muestra puede llevarse a cabo mediante muestreadores
automáticos, como el representado en la diapositiva 7, y más detalladamente
en la 12, o mediante el uso de válvulas de bucle de muestreo. Éstas últimas
constituyen el sistema de inyección más difundido en LC
Las válvulas de bucle o lazo de muestreo vienen provistas de bucles con
volúmenes internos determinados, y permiten la inyección de volúmenes de
muestra generalmente comprendidos entre 5 y 500 µL, mediante el uso de
microjeringas.
En la imagen se muestran las conexiones de la válvula de inyección a la
bomba cromatográfica así como a la columna.
En la imagen podemos apreciar el funcionamiento de una válvula de inyección
de bucle de muestreo. Como hemos mencionado anteriormente, este tipo de
válvulas tienen dos posiciones: carga e inyección.
Cuando la válvula se encuentra en la posición de carga, la fase móvil entre
desde la bomba cromatográfica y sale directamente hacia la columna. En esta
posición haciendo uso de una microjeringa se carga el bucle con la disolución
bajo análisis, obsérvese que se inyectará siempre un volumen superior al del
bucle con el fin de desplazar la disolución contenida inicialmente y
asegurarnos de que el bucle se halla completamente lleno de la disolución a
analizar, el volumen sobrante es drenado a un recipiente de residuos de
muestra.
Al pasar la válvula a la posición de inyección, las conexiones internas de la
misma cambian de modo que la fase móvil ahora entra en el bucle de muestra,
arrastrándola hacia la columna.
Vemos aquí el compartimento de muestreador automático, de la
instrumentación mostrada en la imagen 7, abierto. De este modo, podemos
apreciar la bandeja donde se colocan las disoluciones que han de ser
analizadas, el brazo mecánico que toma dichas disoluciones para inyectarlas
en el sistema, así como los viales que contienen las disoluciones para lavar
dicho brazo.
La fase estacionaria de las columnas cromatográficas de HPLC viene
empaquetada en una columna principal de plástico que a su vez va
resguardada por una carcasa de aluminio anodizado. Resulta muy adecuado el
uso de guardacolumnas, que se colocan justo antes de la columna, y van
rellenas de la misma fase estacionaria de la columna cromatográfica, con el fin
de alargar la vida útil de esta última. La columna se ajusta a los canales de
entrada y salida de fase móvil por medio de fritas de titanio poroso, que
permiten un ajuste perfecto entre los canales y la columna.
Las columnas más ampliamente usadas en HPLC presentan longitudes
comprendidas entre 5 y 30 cm, diámetros internos de 4 a 10 mm y tamaño de
partícula del material de relleno de 5 a 10 µm. También existen columnas de
menores dimensiones a las que solemos referirnos como microcolumnas, sus
longitudes oscilan de 3 a 7 cm, sus diámetros internos de 1 a 4 mm y los
tamaños de partícula de 3 a 5 µm.
Si se comparan las eficacias generalmente obtenidas, expresadas en número de
platos por metro, con los dos tipos de columnas, se observa que son superiores
en el caso de las microcolumnas.
Como en todo tipo de proceso cromatográfico, la selección adecuada de la
fase estacionaria resulta imprescindible para conseguir una buena separación.
El tipo de relleno más común son las partículas de sílice, que a veces se
recubren con una fina película orgánica.
La fotografía de la diapositiva (F») corresponde al soporte más común
empleado en HPLC, son partículas microporosas esféricas de sílice muy pura,
permeables al disolvente y con un área superficial de varios centenares de
metros cuadrados por gramo, 150 para la fotografía de la izquierda y 300 para
la de la derecha. Dado que la sílice se disuelve en agua a pH superior a 8, para
analizar compuestos básicos, se pueden usar soportes poliméricos

En la imagen se muestran columnas de cromatografía líquida de diferentes

dimensiones con carcasa de acero y de plástico.
Dado que las columnas se degradan fácilmente con el polvo, partículas de las
muestras o disolventes, es común proteger la entrada de la columna con otra
columna corta, a la que se llama precolumna, que contiene la misma fase
estacionaria que la columna analítica. Las partículas finas y solutos que
interaccionan con fuerza con la fase estacionaria, quedan retenidas en la
precolumna, no ensuciando la columna analítica. Simplemente habrá que
reemplazar cada cierto tiempo la precolumna.
Aunque en cromatografía líquida la termostatización de la columna no es tan
importante como en cromatografía de gases, y en la mayoría de los casos se
trabaja a temperatura ambiente, en ocasiones conviene elevar la temperatura
de la columna. Las temperaturas máximas de trabajo en LC no suelen superar
los 65 ºC, y se consiguen a través de bloques metálicos que transmiten el calor
a la columna.
El sistema de detección elegido dependerá de la naturaleza de los compuestos
químicos bajo análisis. Los detectores comerciales más comúnmente usados
se basan en medida de la absorción de la radiación ultravioleta-visible, de
fluorescencia molecular, de conductividad, índice de refracción, alguna
propiedad electroquímica, y finalmente la espectrometría de masas.
Se muestran en la imagen los esquemas básicos de dos de los sistemas de
detección más empleados en HPLC:
En la espectrometría de absorción visible-ultravioleta se emplea una célula de
flujo diseñada de tal modo que la radiación procedente de la fuente atraviesa
un determinado trayecto del flujo de fase móvil, detectándose la absorción de
luz en dicho camino óptico.
En cuanto a la espectrometría de masas, merece ser destacada por tratarse de
una técnica tan poderosa no sólo a nivel cuantitativo sino también a nivel de
identificación de especies a través de los espectros de masas de las especies
químicas. En la figura se muestra un diagrama de bloques, donde vemos que
el efluente de la columna cromatográfica se introduce en una fuente de
ionización a presión atmosférica. Los iones producidos se separan en el
analizador de masas de acuerdo a los valores de sus relaciones masa/carga
(m/z), para pasar finalmente al detector.

Optimizacion de la separación cromatográfica

El primer paso en la optimización de una separación cromatográfica mediante
LC supone la elección de la técnica más adecuada: reparto, adsorción,
intercambio iónico ó exclusión por tamaños. Para ello es necesario conocer
cuatro parámetros de las especies químicas bajo análisis: peso molecular,
solubilidad, polaridad y estructura química.

La imagen presenta un esquema básico que sirve de guía para esta elección de
acuerdo con las propiedades citadas.
La selección de la fase móvil comienza por desechar aquellos disolventes que
resultan inadecuados debido a sus características físicas. Seguidamente se
considera la fuerza de la fase móvil que resulta más adecuada para una
separación eficaz de los analitos bajo estudio en el menor tiempo posible; en
este sentido detallaremos posteriormente la elución isocrática y en gradiente.
La selectividad de los disolventes también ha de tenerse en cuenta de modo
que los analitos sean eluidos a tiempos de retención diferentes de otros
componentes de la muestra que no sean objeto de estudio, llegándose de este
modo a conseguir la selección de la fase móvil más adecuada.

Para comprender la importancia del ajuste de la fuerza de la fase móvil,

veamos como ejemplo la separación de ocho compuestos llevada a cabo
empleando distintas mezclas de acetonitrilo y agua, de diferentes proporciones
de ambos disolventes. En la diapositiva vemos que al disminuir la
concentración del disolvente orgánico, al ir disminuyendo la fuerza de la fase
móvil, los componentes de la mezcla van siendo eluidos a tiempos de
retención cada vez mayores. Sin embargo, con ninguna de las fases móviles
mostradas en la diapositiva se consigue una separación total de todos los
compuestos, pues véase que para una mezcla agua/acetonitrilo 60/40, los
compuestos 2 y 3 no se han separado totalmente, y además es necesario
esperar más de una hora para que el compuesto ocho sea eluido; lo que resulta
un problema no solo por el largo tiempo de análisis requerido, sino también
por el ensanchamiento de las bandas de aquellos compuestos eluidos a
tiempos muy largos.
Todos los cromatogramas mostrados en la diapositiva se han obtenido bajo el
modo de elución isocrático, lo que significa que la composición de la fase
móvil no ha variado a lo largo de la separación.

La elución en gradiente constituye una solución al problema de separación

planteado en la anterior diapositiva, consistiendo en variar la composición de
la fase móvil a lo largo de la separación. Si se programa una variación en la
fuerza de la fase móvil, comenzando en este caso por un 30% de ACN, serán
separados los tres primeros compuestos; los siguientes compuestos serán
eluidos al aumentar el porcentaje del disolvente orgánico en primer lugar hasta
un 45 y posteriormente hasta un 80. La elución en gradiente así programada
permite la separación total de los ocho compuestos en algo más de media hora,
de modo que las bandas no sufren demasiado ensanchamiento y el tiempo de
análisis no es demasiado largo.
Nótese que la polaridad de la fase móvil ha ido disminuyendo a lo largo de la
separación, de modo que los compuestos más polares son eluidos antes que los
menos polares. La elución por gradiente se aplica cuando han de separarse
compuestos de polaridades muy diferentes. Uno de los inconvenientes de
orden práctico que presenta este tipo de elución es que una vez finalizado el
programa de gradiente es necesario esperar un tiempo para reequilibrar el
sistema en las condiciones iniciales de la fase móvil, lo que supone un tiempo
de espera entre inyecciones consecutivas, que no es necesario cuando se
trabaja en elución isocrática.

Finalmente citaremos las dos modalidades de trabajo posibles cuando se

selecciona la LC de reparto, que atiende a las polaridades relativas de la fase
móvil y la fase estacionaria (recordemos que en esta técnica cromatográfica
las dos fases son líquidas). Si la fase estacionaria tiene carácter polar (ej.
alcohol) y la fase móvil tiene carácter apolar (ej. hexano) hablamos de «LC de
reparto en fase normal»; si por el contrario, la fase estacionaria tiene carácter
apolar y la móvil es polar, entonces hablamos de «LC de reparto en fase
reversa o inversa».
En LC de reparto en fase reversa al aumentar la polaridad de la fase móvil
aumenta el tiempo de elución de los compuestos, en LC de reparto en fase
normal ocurre al contrario.
 Aplicaciones al análisis de alimentos

La imagen muestra un ejemplo de separación empleando LC de reparto en

fase reversa y detección fluorimétrica, corresponde a la separación de 5
sulfonamidas: sulfonamida (S), sulfoguanidina (SG), sulfodiazina (SD),
sulfopiridina (SP) y sulfometoxazol (SM). Los datos completos de este trabajo
se pueden encontrar en la siguiente referencia «Journal of Chromatography A,
726 (1996) 125».
La cromatografía líquida de adsorción se emplea para separar compuestos
orgánicos con distintas grupos funcionales en su estructura química.
Las fases estacionarias que se emplean para este tipo de cromatografía son
alúmina y sílice, esta última en mayor extensión. La diapositiva muestra los
compuestos que pueden separarse mediante este tipo de cromatografía,
ordenados de mayor a menor tiempo de retención con el que son eluidos de la
columna. Obsérvese que los compuestos menos polares presentan mayor
afinidad por la fase estacionaria.
Los cromatogramas de la figura corresponden a aplicaciones de la LC de
intercambio iónico para análisis de aguas.
Los cromatogramas A y B se obtuvieron con una columna IonPac AS14
usando como fase móvil una disolución de carbonato sódico 1,0
mM/bicarbonato sódico 3,5 mM y detección por conductividad. La figura A
corresponde a la mezcla de estándares, mientras que la B a la muestra de agua
bajo análisis, donde se ha especificado para cada anión la concentración en
ppm encontrada en la muestra.
Los cromatogramas C y D se obtuvieron usando una columna IonPac CS12A,
ácido sulfúrico 11 mM como fase móvil y detector de conductividad. De
nuevo la figura C corresponde a la mezcla estándar de cationes, y la B a la
muestra analizada, donde se ha especificado para cada anión la concentración
en ppm encontrada en la muestra. donde se ha especificado para cada anión la
concentración en ppm encontrada en la muestra.
La separación de proteínas es una aplicación importante de la cromatografía
de exclusión molecular. El cromatograma mostrado presenta la separación de
cinco proteínas de masas moleculares comprendidas entre 12400 y 290000,
obsérvese que éstas son eluidas en orden decreciente de su masa molecular.