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revisión

Transporte de lípidos de la membrana externa en micobacterias. ☆

Megan H. Touchette 1 , Jessica C. Seeliger •

Departamento de Ciencias Farmacológicas, Universidad de Stony Brook, Stony Brook, NY 11794, Estados Unidos

artículo informacion resumen

Historia del articulo: La compleja organización de la pared celular micobacteriana plantea desafíos únicos para el estudio de su ensamblaje. Aunque las micobacterias son
Recibido el 27 de octubre de 2016
clásicas fi Editado evolutivamente como bacterias Gram-positivas, su arquitectura de la pared celular se asemeja más a la de los organismos
Recibido en forma revisada el 13 de enero de 2017 Aceptado el 13
Gram-negativos. Poseen no solo una membrana citoplasmática interna, sino también una membrana externa de bicapa que encierra un periplasma acuoso
de enero de 2017 Disponible en línea el 19 de enero de 2017
e incluye diversos lípidos que se requieren para la supervivencia y la virulencia de las especies patógenas. Las preguntas sobre cómo se transportan los
lípidos de la membrana externa micobacteriana desde el lugar donde se producen en el citoplasma hasta donde funcionan en el exterior de la célula son,
por lo tanto, similares y convincentes, a los que han impulsado el estudio de las vías de transporte de la membrana externa Gram-negativas. Sin embargo,
Palabras clave:

Micobacterias Membrana
poco se entiende sobre estos procesos en micobacterias. Aquí contextualizamos estas preguntas comparando nuestro conocimiento actual de

externa Pared celular micobacterias con una mejor definición fi sistemas ned en otros organismos. Con base en este análisis, proponemos posibles modelos y destacamos los
Lipoproteína Transporte continuos desafíos para mejorar nuestra comprensión del ensamblaje de la membrana externa en estas bacterias importantes desde el punto de vista
médico y ambiental. Este artículo es parte de un número especial titulado: Lípidos bacterianos editado por Russell E. Bishop.

© 2017 Elsevier BV Todos los derechos reservados.

1. Introducción
Las micobacterias y los géneros relacionados en el suborden Corynebacterineae se distinguen por los
ácidos grasos inusuales de cadena larga, los ácidos itólicos, en sus paredes celulares. Este de fi Ninguna
característica ha servido como criterio para clasificar
fi catión de Corynebacterineae y los distingue de otros Actinomycetes como el organismo modelo muy
unidos en el otro extremo los ácidos tomólicos ( Figura 1 ; ver [2] para una revisión reciente y [3] para
una cobertura detallada de la biosíntesis y estructura de peptidoglucano micobacteriano y
arabinogalactano). En las micobacterias, el peptidoglucano está compuesto de cadenas lineales de
alternancia NORTE- acetilglucosamina y NORTE- acetilo o NORTE- unidades de ácido
glucoliluramúrico. Algunos de los residuos de ácido muramico son modi fi ed con un tetrapéptido ( L- alanilo
RE-

estudiado Streptomyces coelicolor. La estructura y síntesis de los ácidos micólicos y la pared celular
en general se ha estudiado más ampliamente en micobacterias debido a la importancia fi No puede
afectar las especies patógenas como M. leprae, M. avium
y M. tuberculosis (Mtb) en salud humana. Clases de taxonomía basadas en ADN fi Las micobacterias
son grampositivas, ya que muchos genes micobacterianos muestran una gran similitud con otros
genes de otras bacterias grampositivas. Sin embargo, no retienen Gramstain de manera confiable [1] ,
una indicación fenotípica de la arquitectura divergente de sus paredes celulares. Para iluminar la
singularidad de la pared celular micobacteriana, fi Primero, presente una descripción general de su
organización y composición y resalte componentes particulares para comparar con los sistemas
arquetípicos Gram-positivos y Gram-negativos.
Además de una membrana citoplasmática o interna de fosfolípidos y una capa de
peptidoglucano, las micobacterias tienen una capa extra de carbohidrato de arabinogalactano unida
al peptidoglucano en un extremo y
☆ Este artículo es parte de un número especial titulado: Lípidos bacterianos editado por Russell E. Bishop.
• Autor correspondiente.
Dirección de correo electrónico: jessica.seeliger@stonybrook.edu (JC Seeliger).
1 Dirección actual: Departamento de Biología Molecular y Microbiología, Facultad de Medicina de la Universidad de Tufts,
Yo asi- glutamil- L- meso- diaminopimelilo RE- alanina; L- Ala- yo Glu- metro DAP-DAla) y reticulado entre dos
D-Ala o dos residuos DAP. Algunos residuos de ácido muramic también están conectados a través
de una ramnosa NORTE-
enlazador acetilglucosamina-fosfodiéster a una cadena lineal de residuos de galactofuranosa unidos
por enlaces 5 y 6. El galactofurano está a su vez elaborado con cadenas de arabinofurano
ramificadas. Juntas, estas capas forman lo que comúnmente se conoce como el complejo
micobacteriano arabinogalactano-peptidoglicano (mAGP) ( Figura 1 ) Una fracción de las cadenas de
arabinofurano son esteri fi ed en sus terminales con ácidos micólicos. En su unión covalente al
polímero de la pared celular subyacente, estos ácidos micólicos unidos a arabinogalactano tienen
una conectividad y posición análogas en la pared celular a los ácidos teicoicos de la pared unidos a
peptidoglucano que se encuentran en las bacterias grampositivas canónicas. Sin embargo, como
ácidos grasos de cadena ultra larga son químicamente distintos de los ácidos glicopoliméricos
teicoicos ( Figura 2 ) Por otro lado, el lipomanano y el lipoarabinomanano de lipoglicanos
micobacterianos son tanto posicionales como químicamente análogos a los ácidos lipoteicoicos
anclados a la membrana, ya que ambos comprenden lípidos elaborados con cadenas de
polisacáridos ( Figura 2 ) Sin embargo, ambas comparaciones creen diferencias que caracterizan la
singularidad de las micobacterias. A diferencia de los ácidos teicoicos de la pared, los ácidos
micólicos unidos a arabinogalactano forman una barrera hidrófoba exterior a los polisacáridos de la
pared celular. Lipoarabinomanano y lipomanano

Boston, MA, Estados Unidos.

http://dx.doi.org/10.1016/j.bbalip.2017.01.005
1388-1981 / © 2017 Elsevier BV Todos los derechos reservados.
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Figura 1. Organización de la envoltura celular micobacteriana. A) Una representación detallada de la envoltura celular micobacteriana con énfasis en la conectividad de los polisacáridos de la pared celular. La abreviatura esquemática se usa para
representar unidades monoméricas clave de estos polímeros complejos. La unidad repetida de disacárido comprende N-acetil glucosamina (GlcNAc) y ácido N-acetil o N-glicosil-muramático (MurNac / MurNGlyc). Estas cadenas están reticuladas por
enlaces tetrapeptídicos. El arabinofurano (Ara F) y galactofurano (Gal F) Las cadenas de arabinogalactano están ancladas al peptidoglucano por la ramnosa (Rha pags)- Enlazadores GlcNAc-fosfodiéster. Estas capas juntas forman el complejo
micobacteriano de arabinogalactano-peptidoglucano (mAGP). Los términos complejos de mAGP son ésteres fi ed con ácidos micólicos, que junto con uniones no covalentes " lípidos libres " formar la membrana externa (caja sombreada). Por simplicidad,
solo se representa un galactofurano, un arabinofurano y una estructura representativa de ácido micólico. En B) los polisacáridos de la pared celular se muestran en simpli fi La forma externa y la membrana externa se resaltan para enfatizar los diversos
lípidos libres, que se detallan más detalladamente en Figura 2 . Esta representación esquemática se utiliza a lo largo de la revisión para simplificar las comparaciones con otras bacterias e ilustrar la distribución espacial de las proteínas involucradas en el
transporte de los lípidos de la membrana externa.

están expuestos en la superficie celular, lo que implica que a diferencia del ácido lipoteicoico, que Por lo tanto, aunque la pared celular micobacteriana tiene ciertas similitudes con la de los
está restringido a la membrana citosólica, se exportan más allá de la capa de ácido micólico al Gram-positivos típicos, su arquitectura general - con una membrana externa distinta que encierra un
exterior de la célula ( Figura 2 ) espacio periplásmico - más cerca

Figura 2. Comparación de envolturas de células bacterianas. Representación esquemática de la envoltura celular y sus componentes para bacterias y formicobacterias gramnegativas y gramnegativas típicas. Por simplicidad, el polisacárido terminal de antígeno
O del lipopolisacárido no está representado. Debido a que no se conoce la distribución exacta de los lípidos en la membrana externa de las micobacterias, los lípidos se ordenan en función de sus estructuras y anfifilicidad / hidrofobicidad. Las estructuras
químicas detalladas para componentes representativos de la envoltura celular se muestran en Fig. 3 .
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se asemeja a la de los gramnegativos ( Figura 2 ) Si bien no se conoce la estructura precisa de la
membrana externa micobacteriana, los ácidos micólicos forman una capa bien ordenada [4] y una
organización bicapa está respaldada por estudios de microscopía de crioelectrones [5 - 7] y es
físicamente razonable basado en los muchos lípidos anfifílicos que se encuentran fuera de la
membrana interna
[8] . Al igual que el lipopolisacárido (LPS) en la membrana externa Gram-negativa, los lípidos en la
membrana externa micobacteriana son necesarios para la supervivencia y la virulencia de las especies
patógenas. [9] . Las micobacterias y las bacterias gramnegativas tienen requisitos similares para el
transporte y el ensamblaje de los componentes de la membrana externa. Los lípidos de la membrana
externa, que se sintetizan total o parcialmente en el citoplasma, deben transportarse a través de la
membrana interna, solubilizarse y transportarse a través del periplasma acuoso, así como depositarse
y transportarse a través de la membrana externa. Además, el transporte más allá de la membrana
interna se produce en el ATP-de fi-
periplasma cientifico y, por lo tanto, plantea el problema de impulsar el movimiento direccional de
sustratos en ausencia de una fuente de energía.
En las micobacterias, las vías responsables de estos procesos, especialmente el transporte más
allá de la membrana interna, son poco conocidas. Dada su importancia biológica, los lípidos de la
membrana externa y sus vías de transporte asociadas son el foco de esta revisión. Debajo brie fl y
revise la estructura, función y mecanismos de transporte de la pared celular Gram-positiva y los
componentes de la membrana externa Gram-negativa y luego compare y contraste con nuestro
conocimiento actual de los sistemas micobacterianos correspondientes. Concluimos presentando
modelos propuestos para el transporte de lípidos de la membrana externa micobacteriana basados
​en este análisis y describiendo los desafíos restantes.
2. Transporte de componentes de la pared celular en bacterias Gram-positivas.
2.1. Visión general
El transporte de bacterias grampositivas y el ensamblaje de tres tipos principales de componentes de
la pared celular: peptidoglucano, ácidos teicoicos y proteínas de superficie. En general, las bacterias
grampositivas tienen una sola membrana, por lo que
" interior exterior " No se aplica la nomenclatura. Por precisión usamos el término " membrana citosólica " paraa los ácidos lipoteicoicos tipo IV. Las unidades repetidas se polimerizan sobre un glicerol-3-fosfato- NORTE-
bacterias grampositivas, excepto micobacterias. Dada esta arquitectura de membrana única, los
componentes de la pared celular grampositiva residen en la capa externa fl et de la membrana citosólica
o están unidos al peptidoglicano ( Figura 2 ) Los precursores sintetizados en el citoplasma deben ser así fl
ipped o transportados a través de la membrana citoplasmática para alcanzar su fi destinos finales. Las
enzimas en la pared celular luego unen componentes unidos a peptidoglucano, como subunidades de
peptidoglucano, proteínas y ácidos teicoicos de pared, en el andamio de peptidoglucano,
presumiblemente directamente de los precursores anclados a la membrana. Para proporcionar las
comparaciones más relevantes con los lípidos de la membrana externa micobacteriana, nos centramos
aquí en el transporte de ácidos teicoicos, en base a sus similitudes mencionadas, los ácidos
micobacterianos y los lipoglucanos de células micobacterianas.
Los ácidos teicoicos son glucopolímeros de la pared celular que están unidos a los lípidos (para los
ácidos lipoteicoicos) o al peptidoglucano (para los ácidos teicoicos de pared). Se han propuesto diversas
funciones para los ácidos teicoicos, aunque en general tienen papeles clave en la protección de la
envoltura celular Gram-positiva. Estas funciones incluyen la defensa contra la acción de los péptidos
antimicrobianos y los antibióticos, que respalda la orientación de la biogénesis del ácido teicoico para
aplicaciones terapéuticas. Mientras que los ácidos lipoteicoico y teicoico de pared tienen estructuras
centrales conservadas, la composición del glucopolímero extendido puede diferir ampliamente entre
especies e incluso dentro de las especies, dependiendo de las condiciones ambientales. Para un
tratamiento más detallado de la función y la biosíntesis del ácido teicoico de la pared y lipoteicoico, el
lector se remite a las revisiones recientes de Percy y Gründling y de Brown et al. [10,11] .
2.2. Ácidos lipoteicoicos
Para los ácidos lipoteicoicos, las vías biosintéticas de los ácidos lipoteicoicos Tipo I y Tipo IV
son las mejor caracterizadas y requieren diferentes tipos de transportadores en diferentes etapas.
Para facilitar la comparación, brie fl y esbozar las estructuras y vías para estos dos tipos. Para ambos
Tipo I
y los ácidos lipoteicoicos tipo IV, la estructura básica está compuesta por una estructura principal de
polímero no ramificada anclada por un glicerolípido ( Fig. 3 ) El ácido lipoteicoico tipo I comprende un
modulo de anclaje de diglucosil diacilglicerol fi ed con un esqueleto de poliglicerol-3-fosfato no
ramificado que se puede decorar con glucosa o RE- alanina El ácido lipoteicoico tipo IV es más
complejo y comprende un ancla de monoglucosil diacilglicerol con una cadena principal de unidades
de pseudopentasacáridos repetitivas.
Dentro de la biosíntesis de ácido lipoteicoico tipo I, el transporte a través de la membrana
citoplasmática se produce temprano en la vía: el núcleo de diglucosil diacilglicerol es
presumiblemente fl ipped por LtaA [12] , miembro de la superfamilia de facilitadores principales (MFS)
de transportadores integrales de proteínas de membrana, que generalmente son responsables de la
importación de solutos de molécula pequeña y dependen de la fuerza motriz del protón ( Fig. 4 UNA) [13]
. Todos modi fi cationes de diglucosil diacilglicerol para formar ácido lipoteicoico maduro, desde la
polimerización de la cadena de poliglicerol-3-fosfato hasta la adición de D-alanina y glucosa a esta
columna vertebral, luego ocurre en la capa externa fl et de la membrana citoplasmática. En contraste,
para el ácido lipoteicoico Tipo IV, el poliisoprenil portador de lípido undecaprenil-fosfato es modi fi ed
en el interior lea fl et con unidades repetidas de azúcar y ribitolfosfato antes del transporte por TacF,
una proteína de membrana integral que pertenece a una familia generalmente asociada con la
biosíntesis de polisacáridos, pero que no se ha caracterizado de otra manera ( Fig. 4 UNA) [14] . los fi paso
final se produce en el exterior lea fl et, donde el polímero es transferido por enzimas de la familia
LytRCpsA-Psr del fosfato de undecaprenilo en un ancla de glucosil diacilglicerol para formar ácido
lipoteicoico tipo IV [15] . Curiosamente, el polímero también se puede transferir de
undecaprenil-fosfato a peptidoglucano y, por lo tanto, se puede desviar a formar ácido teicoico de
pared. [dieciséis] .
2.3. Ácidos teicoicos de pared
Al igual que los ácidos lipoteicoicos, los ácidos teicoicos de pared son estructuralmente diversos,
pero comparten una estructura básica de estructura central. fi ed con una cadena lineal de unidades
de glicerol-3-fosfato o azúcar-ribitol fosfato que se pueden decorar más con RE- alanina y
monosacáridos ( Fig. 3 ) Los ácidos teicoicos de la pared canónica se sintetizan de una manera similar
acetilmannosamina NORTE- trisacárido de acetilglucosamina unido a un vehículo de fosfato de
undecaprenilo en la capa interna citoplasmática fl et. El polisacárido unido a lípidos es transportado a
través de la membrana por el transportador de casete de unión a ATP (ABC) TagGH ( Fig. 4 UNA) [17] .
Las proteínas TagTUV, que, como en la biosíntesis de ácido lipoteicoico tipo IV, pertenecen a la
familia de enzimas LytR-CpsA-Psr, son responsables de transferir el polímero del fosfato de
undecaprenilo en la capa externa. fl et al peptidoglucano [18] . Curiosamente, varios laboratorios
recientemente identi fi ed proteínas de la familia LytR-CpsA-Psr en M. tuberculosis y la bacteria
relacionada Corynebacterium glutamicum. En analogía directa con la formación de ácidos teicoicos de
pared, estos homólogos se asociaron con la unión covalente de arabinogalactano a peptidoglucano [19
- 21] . Estos resultados destacan la aparente conservación en la biosíntesis de la pared celular de los
Gram positivos, incluidas las micobacterias, a pesar de las estructuras y la composición divergentes.
En resumen, el transporte de ácidos teicoicos a la pared celular requiere proteínas de
membrana integral dedicadas. Para transportar sustratos, LtaA utiliza un gradiente de protones y
TagGH hidroliza el ATP; aunque se desconoce el mecanismo del transportador LTA Tipo IV TacF, un
mecanismo dependiente de energía probablemente también subyace en su función. En general,
estos ejemplos subrayan que se requiere energía para impulsar la translocación de los ácidos
teicoicos desde el citoplasma a la pared celular ( tabla 1 )
3. Transporte de componentes de la membrana externa en bacterias Gram-negativas.
3.1. Visión general
Para ensamblar su membrana externa, las bacterias Gram-negativas deben transportar y
ensamblar tres tipos principales de componentes: lípidos,
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Fig. 3. Estructuras químicas de componentes representativos de la pared celular encontrados en bacterias Gram-positivas (ácidos lipoteicoico y teicoico de pared) y lípidos de la membrana externa encontrados en bacterias Gramnegativas (lipopolisacárido) y
micobacterias ( fila inferior). Los cuadros sombreados resaltan las porciones de los ácidos lipoteicoico y teicoico de la pared que corresponden a los precursores biosintéticos que se transportan a través de la membrana citoplasmática (ver Fig. 4 UNA). Se
proporcionan abreviaturas comúnmente utilizadas en la literatura.

lipoproteínas y β- Proteínas de barril. Los mecanismos de transporte para los tres implican una
combinación de transportadores dependientes de ATP en la membrana interna, chaperonas en el
periplasma y β- proteínas de barril que facilitan la inserción y translocación / plegado de la carga en la
membrana externa ( Fig. 4 SI, tabla 1 ) Debido a la similitud en el mecanismo y la organización,
tocaremos brie fl y en el camino de transporte para
β- proteínas de barril, pero debido a que el transporte de lipoproteínas y LPS tienen la mayor
relevancia funcional para el transporte de lípidos de la membrana externa micobacteriana, nos
centramos en estas vías y resumimos a continuación sus características distintivas. Para obtener
más información en profundidad, los lectores son remitidos a revisiones recientes de Ricci y Silhavy
para la membrana externa. β- transporte de proteínas en barril [22] , Okuda y Tokuda para el transporte
de lipoproteínas [23] y Okuda et al. para transporte LPS [24] , así como las revisiones relevantes
dentro de este tema.
Sistemas de secreción de proteínas. Sin embargo, una vez que las lipoproteínas nacientes se
traslocan a través de la membrana interna por SecAYEG o el transportador de arginina gemela
TatABC [25,26] , una secuencia conservada adicional, el lipobox, los dirige a modi postraduccionales fi catión
por la diacilgliceril transferasa Lgt, la señal de peptidasa de tipo II LspA y la aciltransferasa Lnt, lo que
resulta en la triacilación de una cisteína N-terminal. Lgt y LspA se conservan en bacterias
Gram-negativas y Gram-positivas. Dentro de los Gram-positivos, la aciltransferasa terminal Lnt se
encuentra solo en especies con alto contenido de GC, incluidas las micobacterias. [27, 28] .
Mientras que todas las lipoproteínas Gram-positivas presumiblemente residen en la capa externa fl Et
de la membrana citoplasmática, en Gram-negativos, las lipoproteínas también pueden ser transportadas
a la membrana externa por el sistema Lol [23] . De hecho, solo una fracción menor de lipoproteínas se
retiene en la membrana interna mediante una señal de retención codificada por un ácido aspártico en el

3.2. Β- proteínas de barril y lipoproteínas + 2 posición, conocida como la regla +2 [29,30] . Con algunas excepciones, todos
el transportador ABC dependiente de ATP LolCDE elimina otras lipoproteínas de la membrana
Β- Las proteínas de barril destinadas a la membrana externa son fi Primero dirigido al sistema de interna ( Fig. 4 SI). La pérdida de LolCDE resulta en la retención de lipoproteínas en la capa
secreción de proteínas Sec y una señal N-terminal. Tras la secreción en el periplasma por el periplásmica fl et de la membrana interna, lo que implica LolCDE speci fi principalmente en la extracción
translocón SecAYEG, el polipéptido naciente desplegado está unido por chaperonas solubles SurA / de lipoproteínas de la membrana [31] . Esta es una función inusual entre los transportadores ABC,
Skp, transportado por difusión pasiva a través del periplasma y transferido a las lipoproteínas que típicamente translocan sustratos a través de la membrana interna. LolCDE luego entrega
BamBCDE y el β- barril BamA, que inserta y dobla el naciente β- barril en la membrana externa ( Fig. 4 SI). lipoproteínas a la proteína periplásmica soluble LolA, que sirve como chaperona, presumiblemente
Me gusta β- barril y otras proteínas secretadas, las lipoproteínas se codifican con una señal de para el resto lipídico N-terminal, durante la difusión pasiva a través del periplasma acuoso. [32,33] . En
secreción N-terminal que las dirige al Sec o Tat la interfaz de la membrana externa,
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Fig.4. Vías de transporte para la pared celular y los componentes de la membrana externa de las bacterias. A) En bacterias Gram-positivas, las proteínas integrales de membrana transportan precursores del ácido lipoteicoico y teicoico de pared a través de
la membrana citoplasmática. (C55-P, fosfato de undecaprenilo) B) En bacterias Gram negativas, sistemas de proteínas de membrana interna, chaperonas periplásmicas y lipoproteínas de membrana externa y β- proteínas barril coordinan el transporte de β- proteínas
de barril, lipoproteínas y lipopolisacárido en la membrana externa.

las lipoproteínas se transfieren a LolB, que es una lipoproteína anclada en la membrana externa y
tiene una af mayor fi nity para lipoproteínas que LolA, promoviendo así el transporte unidireccional [34] .
De hecho, un mutante soluble no lipidado de LolB (mLolB) todavía admite el transporte de
lipoproteínas, aunque el proceso es bidireccional y
las lipoproteínas están mal dirigidas transitoriamente a la membrana interna de origen, lo que sugiere
que la acilación de LolB facilita la direccionalidad en la vía de Lol [35] .
LolA y LolB tienen estructuras altamente homólogas a pesar de la baja identidad de secuencia
(8%), con una cavidad hidrófoba de fi ned por un

tabla 1
Componentes de las vías de transporte de la envoltura celular en bacterias canónicas Gram positivas y Gram negativas y en micobacterias.

Sustrato: Función (ubicación) Gram positivas Gram-negativo Familia de proteínas / tipo Micobacterias

Ácido lipo-teicoico Acido teicoico de β- Proteína Lipoproteína LPS Lípidos OM Familia de proteínas / tipo

pared de barril

Transporte (IM) LtaA una TagGH SecAYEG mi SecAYEG discos compactos MsbA mi Transportador ABC MmpL RND permease transportador MFS
TacF si transportador MFS Rv1410c
Extracción (IM) LolCDE LptB 2 FG Proteína anclada a la Drr? Brecha / Transportador ABC Proteína de membrana

LptC hélice ABC transporter TM MmpS? Llp? Lipoproteína

Chaperona (periplasma) SurA / Skp LolA LptA Proteína periplásmica Llp? Lipoproteína
soluble
Recepción / inserción (OM) BamBCDE LolB LptE Lipoproteína Llp? Lipoproteína
Inserción / transporte (OM) BamA LptD β- proteína barril ?

IM = membrana interna; OM = membrana externa.

una Ácido lipoteicoico tipo I.

si Ácido lipoteicoico tipo IV.

C Aunque SecAYEG utiliza ATP para impulsar la translocación de proteínas, el translocon en sí no es miembro de la superfamilia de transportadores ABC claramente diferente.
re Aunque no se muestra en Fig. 4 , las lipoproteínas también pueden ser translocadas por TatABC, que depende de la fuerza motriz del protón para la secreción [25,26] .

mi El sustrato para MsbA es el complejo de oligosacáridos con núcleo de lípido A [41] . El antígeno O se transloca independientemente por un transportador Wzx [42] . 1344
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incompleto β- barril propuesto por α- hélices [36] . Curiosamente, la cavidad solo es lo suficientemente
grande como para unir una sola cadena de acilo; todavía no se comprende cómo se acomodan las
dos cadenas de acilo adicionales. LolB tiene una cavidad abierta en la que una molécula de
polietilenglicol se ha cocristalizado, posiblemente emulando una cadena de acilo de lipoproteína
unida ( Fig. 6 ) Si bien no se han resuelto estructuras de cocristales con LolA, la forma no ligada se ha
resuelto en conformaciones abiertas y cerradas que se cree que son relevantes para la unión y
liberación del sustrato en base a datos estructurales y bioquímicos. El mutante LolA R43L favorece la
conformación abierta y no puede transferir lipoproteínas a LolB, lo que implica cambios
conformacionales de LolA para facilitar el transporte unidireccional de lipoproteínas [37] .
Finalmente, LolA y LolB interactúan entre sí en las entradas a sus respectivas cavidades de
unión al ligando hidrofóbico, en un llamado
" boca a boca " orientación, basada en especificaciones del sitio fi c estudios de fotocrosslinking de
proteínas en bacterias vivas [38] . Estos datos respaldan un modelo de transporte que implica la
transferencia directa del resto de la cadena de acilo de lipoproteína entre las dos proteínas ( Fig. 4 SI).
Si bien se presume que LolB deposita lipoproteínas en la capa interna periplásmica fl et de la
membrana externa, las lipoproteínas también se han detectado en la superficie celular. A diferencia
del transporte a través del periplasma, el transporte de lipoproteínas a través de la membrana
externa parece ser especıfico de sustrato proteico. fi c y confiar en diversos mecanismos, desde
sistemas de secreción Tipo II hasta Bamcomplex y otros [39,40] .
3.3. Lipopolisacárido
La membrana externa de las bacterias gramnegativas es una bicapa asimétrica con fosfolípidos
en la capa interna. fl et y lipopolisacárido (LPS) en la capa externa fl et ( Figura 2 ) Aún no se conocen
los mecanismos por los cuales los fosfolípidos alcanzan la membrana externa, pero se ha delineado
la vía general para el transporte de LPS ( Fig. 4 SI) [24] . LPS es un glicolípido complejo compuesto de
lípido A glicosilado por oligosacáridos de núcleo interno y externo y el antígeno O. El lípido A
comprende un fosforilado NORTE- ésteres de acetilglucosamina disacárido fi ed con múltiples ácidos
grasos ( Fig. 3 ) El complejo de oligosacáridos del núcleo lípido A y el antígeno O se elaboran en el
citoplasma y se transportan por separado al periplasma antes de que se liguen para formar LPS
maduro. El complejo de lípidos A-core oligosacáridos es fl atravesado por la membrana interna por el
transportador ABC MsbA [41] mientras que las unidades de antígeno O unidas al fosfato de
undecaprenilo son transportadas por un translocase Wzx [42]
( Fig. 4 SI, tabla 1 )
El sistema Lpt media el transporte posterior de LPS maduro a la membrana externa. Similar a
LolCDE en la vía de transporte de lipoproteínas, un transportador ABC, LptB 2 Se requiere FG para
extraer LPS de la membrana interna, después de lo cual se transfiere a LptC en la membrana interna
y luego se entrega a LptA periplásmico ( Fig. 4 SI, tabla 1 ) LptA tiene un retorcido β- estructura de
gelatina e interactúa consigo mismo in vitro de forma de cabeza a cola para formar una hendidura
hidrófoba continua que se une al LPS, muy probablemente a los restos de la cadena de acilo [43] .
Los dominios periplásmicos de LptF, LptG y LptC en la membrana interna y el dominio N-terminal de
LptD en la membrana externa son estructuralmente homólogos a LptA. Se ha demostrado que estos
dominios de LptC y LptD interactúan con LptA también en una orientación de cabeza a cola basada
en las especificaciones del sitio fi c estudios de fotocrosslinking en células vivas [44] . Basándose en
estos y otros datos, LptA no actúa como una chaperona de difusión libre como lo hace LolA en la ruta
de Lol, sino que forma un puente continuo que conecta LptB 2 FG a través de LptC en la membrana
interna a los componentes posteriores LptDE en la membrana externa ( Fig. 4 SI) [24] . Además, en
lugar de confiar en el diferencial af fi Para impulsar el transporte unidireccional, el movimiento de LPS
hacia la membrana externa depende de sucesivas rondas de hidrólisis de ATP por LptB 2 FG ( tabla 1 );
la energía se transduce presumiblemente entre las proteínas Lpt interactuando por cambios
conformacionales [45] . En el fi Pasos finales LptA transfiere LPS al extremo N del componente de
membrana externa LptD, que transfiere LPS a través de su resto de lípido A a la cavidad
intramembrana hidrófoba dentro de su C-
1345
terminal β- dominio de barril Mientras tanto, el oligosacárido de núcleo hidrofílico y el polisacárido de
antígeno O de LPS se translocan a través del canal formado por LptD y LptE [46 - 51] .
4. Resumen del transporte de la pared celular en bacterias canónicas Gram-positivas y
Gram-negativas
Una comparación de los sistemas de transporte anteriores, sus componentes y sus mecanismos
revela algunas similitudes intrigantes ( tabla 1 ) Todos requieren un transportador transmembrana
dependiente de energía para mover los sustratos a través de la membrana citoplasmática. En la
mayoría de los casos, este es un transportador dependiente de ATP, aunque el transporte Tipo I LTA
se basa en LtaA, un transportador MFS que es impulsado por la fuerza motriz protónica, y no se
conoce el mecanismo del transportador de ácido lipoteicoico Tipo IV TacF.
Toda la carga destinada a la membrana externa en bacterias Gram negativas está unida en algún
momento por proteínas similares a chaperonas que solubilizan las regiones hidrófobas expuestas de los
sustratos, ya sean proteínas o lípidos. Mientras naciente β- Presumiblemente, las proteínas de barril están
unidas por las chaperonas Skp / SurA directamente después de la secreción, tanto las lipoproteínas como
las LPS están
fi primer modi fi ed en la lea periplásmica fl et de la membrana interna y requieren un transportador ABC
adicional para impulsar la extracción energéticamente desfavorable de sus anclajes lipídicos de la
membrana interna antes de transferirlos a las chaperonas correspondientes. Carga es entonces " recibido
" en la membrana externa por lipoproteínas y luego insertadas, plegadas o transportadas de manera
diversa por la membrana externa β- Proteínas de barril. Como se señaló anteriormente, no se conoce
la forma en que las lipoproteínas cruzan la membrana externa para alcanzar la superficie celular,
aunque hasta ahora los mecanismos temáticos parecen ser diversos y específicos del sustrato. fi C.
En general, estas comparaciones apuntan a un requisito especial para la extracción de membrana
dependiente de energía para sustratos que contienen lípidos que son fl ipped y modi fi ed antes del
transporte a través del periplasma. Otros temas comunes son la presencia de proteínas de
chaperona periplásmicas solubles, lipoproteínas de la membrana externa que reciben carga en la
interfaz de la membrana y la membrana externa que se extiende β- barriles que insertan y / o
traslocan sustratos en la membrana externa. El principal contraste está en si el transporte a través
del periplasma es pasivo, como para las proteínas (lipo), o impulsado por la hidrólisis de ATP, como
para LPS.
5. Transporte de componentes de la membrana externa en micobacterias.
5.1. Visión general
Al igual que las bacterias Gram negativas, las micobacterias deben transportar y ensamblar
proteínas y lípidos en la membrana externa. Se han identificado varias proteínas de la membrana
externa. fi ed en micobacterias [52] , pero su transporte y plegamiento no se han caracterizado y, como
era de esperar, las micobacterias carecen de homólogos para el sistema de transporte de proteínas
Bam de bacterias Gram-negativas. Del mismo modo, las micobacterias carecen de homólogos
directos para la vía de transporte de lipoproteínas Lol, lo que lleva a suponer que todas las
lipoproteínas micobacterianas residen en la membrana interna. Sin embargo, Mtb codifica hasta 100
lipoproteínas basadas en identidades bioinformáticas fi catión del motivo lipobox [53] y no se ha
explorado la posibilidad de que algunas de estas lipoproteínas puedan translocarse a la membrana
externa por una vía alternativa. Entre los componentes de la membrana externa, el transporte de
lípidos se caracteriza mejor debido a las funciones que desempeñan numerosos lípidos de
membrana externa en la virulencia y supervivencia micobacterianas, aunque las vías y los
mecanismos no se entienden completamente.
Dedicamos nuestra discusión a las principales clases de lípidos de la membrana externa que
han sido implicados en Mtb patogenicidad y para el cual el conocimiento de la biosíntesis y el
transporte son los más extensos. Las estructuras de familias representativas de lípidos de membrana
externa se proporcionan en Fig. 3 para mostrar las amplias similitudes con los sustratos de transporte
discutidos anteriormente, incluida la prevalencia de glucopolímeros y glucolípidos y características
tales como la acilación múltiple, como en LPS. En general, los lípidos de la membrana externa
micobacteriana se distinguen por inusualmente largos
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cadenas de acilo con modi múltiple fi cationes, que incluyen la insaturación y la ramificación de metilo.
Entre los grupos de acilo lipídico de la membrana externa, los micoles son quizás los más extremos:
cada uno α- ramificado y β- la cadena de ácido graso hidroxilado comprende 60 - 90 carbonos y tiene
modos variables proximales y distales fi cationes, incluidos los grupos ceto, metoxi y ciclopropilo (ver [54]
para una revisión exhaustiva de la estructura del ácido micólico y la biosíntesis).
Como se menciono anteriormente, lipoarabinomannan y lipomannan son
lipoglucanos que consisten en un núcleo lipídico elaborado con una cadena de polisacárido (ver [55] para
una revisión de glicoconjugados micobacterianos). El núcleo lipídico común es el fosfatidilo. myo- inositol
manósido (PIM), un fosfolípido ubicuo de membrana interna de micobacterias, que es una
modificación adicional fi ed con una cadena de acilo adicional y cuatro azúcares de manosa
adicionales para formar Ac 1 PIM 4 ( Las figs. 2, 3 ) Las cadenas de acilo son principalmente ácido
palmítico, esteárico o tuberculostearico (10-metiloctodecanoico) y, por lo tanto, tienen una longitud
similar a la de otros fosfolípidos de membrana interna comunes a las micobacterias, como
fosfatidilglicerol, fosfatidiletanolamina y cardiolipina. [56] . El AC 1 PIM 4 4 el núcleo se glucosila luego
con una cadena de manosilo lineal para formar lipomanano y luego se elabora con cadenas de
arabinosilo lineales y / o ramificadas para formar lipoarabinomanano. En Mtb los terminales de
arabinosa no reductores están cubiertos con 1 - 3 azúcares de manosa.
Una segunda clase de lípidos de la membrana externa son los glicolípidos de trehalosa, que son
muy diversos estructuralmente. El dimilato de trehalosa comprende ésteres de trehalosa fi ed a las 6 y
6 ′ posiciones con ácido micólico. Por lo tanto, los mycolates se encuentran no solo unidos
covalentemente al arabinogalactano, sino también como parte de " gratis " lípidos en la membrana
externa. Una subclase de lípidos de trehalosa son las aciltrehalosas, en las cuales el disacárido es
modi fi ed en la posición 2 con un ácido graso de cadena lineal (con mayor frecuencia ácido palmítico
o esteárico) y en el 2 ′, 3 ′, 4 y / o 6 ′ posiciones con ácidos grasos únicos insaturados y ramificados con
metilo (los ácidos micolipénicos se representan en Fig. 3 ; también se encuentran las variantes
relacionadas ácido micosanoico y micopanoico, que tienen diferentes longitudes de cadena y
números de ramas de metilo) [57] . La poli (o penta) acillthalosa completamente elaborada se
encuentra en la membrana externa junto con el intermediario biosintético diacildrehalosa [58] . Una
tercera subclase, los sulfolípidos (también conocidos como sulfatidas o sulfoglicolípidos), consisten
en trehalosa-2-sulfato tetracilado en el 2 ′ - posición con un ácido graso de cadena lineal (típicamente
ácido palmítico o esteárico) y en el 3 ′, 4 y 6 posiciones con un ácido graso metilramificado único,
ácido (hidroxi) ftioceranico [59] . A diferencia de la poliaciltrehalosa, el diacil sulfolípido intermedio
biosintético no parece ser un componente principal de la membrana externa, pero Mtb
El análisis de mutantes y la enzimología noqueados mostraron que tanto la diacilthalosa como el
diacil sulfolípido son ésteres fi ed exclusivamente en las posiciones 2 y 3 [60 - 62] . Esta
regioselectividad idéntica probablemente tiene su origen en sus loci biosintéticos, que codifican
aciltransferasas homólogas de la familia de proteínas asociadas al policétido. Esta similitud también
es relevante para discusiones posteriores sobre el transporte de estas dos subclases de glicolípidos
de trehalosa.
Una tercera clase de lípidos de la membrana externa son aquellos que contienen el ácido graso
de ramificación de metilo, ácido micocerosico. Los dimicocerosatos se dividen en dos subclases, los
dimicocerosatos de tiocerol y los glicolípidos fenólicos, que comparten un alquilo común. β- diol
(phthiocerol) core diesteri fi ed con ácidos micocerosicos ( Fig. 3 ) [63] . En los glicolípidos fenólicos, un
oligosacárido se une a través de un grupo fenólico al ω- término del tiocerol; la estructura del
oligosacárido es específica de la especie fi C. Mientras que el lipoarabinomanano, el lipomanano y el
dimalolato de trehalosa se encuentran a través de las micobacterias, los sulfolípidos, diversas
acillthahalosas y dimicocerosatos se han aislado solo de un número limitado de especies, incluidos
los principales patógenos humanos y los de los Mtb complejo [58,64] . Para estos lípidos ramificados
con metilo, las longitudes de cadena (C21 a C46) superan con creces las de lipoarabinomanano,
lipomanano y fosfolípidos internos típicos (C16, C18). (Aunque no se discute aquí, las micobacterias
no tuberculosas y no patógenas también contienen lípidos de trehalosa de cadena ultra larga, como
el polifleato de trehalosa, que están ausentes de Mtb [ sesenta y cinco] ) Además, para cada tipo de
ácido graso, tanto la cadena
longitud y el número y tipo de modi fi los cationes pueden variar, dando lugar a múltiples isoformas
para un lípido dado. El aumento de la disponibilidad de metil malonil-CoA, un precursor de lípidos
ramificados con metilo, condujo a aumentos tanto en el tamaño como en la abundancia de
dimicocerosato y sulfolípido de tiocerol, lo que sugiere una respuesta metabólica mediante la cual las
micobacterias pueden modular la composición y las propiedades de sus membranas en respuesta a
señales ambientales [66] .
En resumen, la membrana externa de las microbacterias contiene lípidos con estructuras,
tamaños y propiedades fisicoquímicas variadas ( Fig. 3 ) En contraste, los sistemas de transporte
descritos anteriormente para los organismos Gram-positivos y Gram-negativos típicos están dedicados
a características moleculares altamente conservadas que son ubicuas en la pared celular,
particularmente para Lol, que reconoce un motivo lipídico conservado común a todas las lipoproteínas,
y al sistema Lpt, que presumiblemente reconoce los restos acilo de LPS. Los lípidos de la membrana
externa micobacteriana, por lo tanto, plantean desafíos más amplios y complejos para el transporte. A
continuación proporcionamos una perspectiva histórica sobre el descubrimiento y la caracterización de
las vías de transporte de lípidos de la membrana externa y usamos los lípidos en Fig. 3 ejemplificar la
diversidad de mecanismos tal como se entiende actualmente. También utilizamos la plantilla general
para el transporte extraída de nuestra comparación anterior de otros sistemas de transporte de
membrana externa ( Fig. 4 ) para guiar la discusión y enmarcar las preguntas restantes sobre cómo se
produce el transporte de lípidos en la envoltura de las células micobacterianas.
5.2. Transporte de lípidos de la membrana externa a través de la membrana citoplasmática.
Muchas de nuestras ideas iniciales sobre el transporte de lípidos de la membrana externa
surgieron de las pantallas de la biblioteca de transposonmutantes en las que la pérdida de virulencia en
mutantes particulares condujo a la caracterización de defectos de localización de lípidos y la asignación
de sustratos a las proteínas de la envoltura celular, la mayoría de ellos transportadores integrales de
membrana [67 - 70] . Junto con los análisis posteriores que exploraron las proteínas homólogas, estos
estudios informaron principalmente nuestra comprensión del transporte a través de la membrana
interna, así como revelaron conexiones íntimas entre la biosíntesis de lípidos y el transporte, como se
describe a continuación. Las vías de exportación de lípidos mejor entendidas incluyen un miembro de la
familia Mycobacterial Membrane Protein Large (MmpL), que fue revisado recientemente y
exhaustivamente por Chalut (ver también Tabla 2 ) [71] . Las proteínas MmpL pertenecen a la
superfamilia de resistencia-nodulación-división (RND) de transportadores integrales de membrana. Los
ejemplos de otras bacterias incluyen drogas y efectos catiónicos.
fl bombas ux, exportadores de lipooligosacáridos putativos y componentes de sistemas de secreción
de proteínas, con muchos sustratos que tienen una naturaleza anfifílica [72] . De hecho, mientras que
la pérdida de la función MmpL en micobacterias se ha asociado con fenotipos de resistencia [73,74] ,
otra evidencia experimental apunta a un papel fisiológico para estos transportadores en el transporte
transmembrana de especi fi c tipos de lípidos [61,62,65,75 - 81] . Se han asignado sustratos lipofílicos a
8 de 13 MmpLs en Mtb y un adicional de 2 en M. smegmatis y otras micobacterias no tuberculosas ( Fig.
5 , Tabla 2 ) Mientras que muchas de las principales clases de lípidos de la membrana externa están
representadas en Fig. 3 están asociados con transportadores MmpL, una gran excepción es el
lipoarabinomanano y el lipomanano. En el modelo actual, el Ac 1 PIM 4 4 el núcleo lipídico se sintetiza
en el citoplasma y se modifican aún más fi ed por las glicosiltransferasas unidas a la membrana en la
valva periplásmica de la membrana interna, pero el transportador de Ac 1 PIM 4 4 no es conocido [55] .
Los estudios de la familia MmpL han explotado la coubicación de
mmpL genes con genes de biosíntesis para llegar a sustratos transportadores putativos, que fueron
con fi rmed por análisis de lípidos en mutantes con pérdida de función. Por ejemplo, en Mtb que carece
de la función MmpL7, los dimicocerosatos de tiocerol no se vierten en el medio de cultivo y, por lo
tanto, es probable que estén ausentes de las capas más externas, pero aún se detectaron en
asociación con las células, presumiblemente la membrana interna
[67] . La aparente especi fi La ciudad de MmpL7 para lípidos de dimicocerosato es consistente con la
localización conjunta de mmpL7 con los genes para la biosíntesis de dimicocerosato. Por otro lado,
para los lípidos de trehalosa, la pérdida de sulfolípidos y poliaciltrehalosas del MmpL correspondiente
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Tabla 2
Componentes de las vías de transporte de lípidos de membrana externa conocidas y previstas en micobacterias.

Sustrato Abreviatura C Mtb Msm Número total de ácidos grasos / sustituyentes acilo Familia de proteínas / tipo

MmpL MmpS Brecha ABC MFS Lipoproteína

Monomilato de trehalosa una TMM X X 2 MmpL3

Diacyltrehalose una DAT X 2 MmpL10 re
Poliacilthalosa una PALMADITA 55

Sulfolípido una SL X 44 MmpL8 re Savia

Polifleato de trehalosa una TPP X 66 MmpL10 re Brecha

Lipooligosacárido una LOS X 3 MmpL12 re Gap2

Glycopeptidolipid si GPL X 1 MmpL4a re MmpS4 Gap MmpL4b re

Micobactina si MBT X X 1 MmpL4 MmpS4

Carboximicobactina si cMBT 1 MmpL5 MmpS5
Monomeromycolyl diacylglyceride mmDAG X 1 MmpL11
Éster de cera Mycolate mWE 1
Dimicocerosato de tiocerol PDIM X 2 MmpL7 C DrrABC LppX
Fenolglicolípido PGL 2
Triacilglicérido ETIQUETA X X 3 Rv1410c LprG
Lipoarabinomanano / lipomanano LAM / 3
LM
? X LprA
? X LprF

una Grupo de la cabeza de trehalosa.

si Grupo principal derivado de péptidos.

C Abreviaturas comúnmente utilizadas en la literatura.

re Los genes que codifican los transportadores se colocalizan con genes para la biosíntesis. Negrita = estructura mostrada en Fig. 3 , Msm = M. esmegmatis

El transportador (MmpL8, MmpL10) condujo no solo a la pérdida de estos lípidos en la superficie
celular, sino también a la acumulación de lípidos precursores más profundos en la célula [61,62,80,81]
. (Se ha informado un fenotipo análogo para la vía TPP en M. smegmatis [ sesenta y cinco] .) El
transporte y la síntesis parecen estar acoplados en estas vías, con MmpLs actuando quizás como
andamios para las aciltransferasas antes de transportar sus productos. Sin embargo, la asignación
de sustratos de transporte en estos casos depende de la localización precisa de las enzimas
biosintéticas. Por ejemplo, el dominio catalítico de la poliacyltrehalose acyltransferase Chp2 se ha
localizado al citoplasma o al periplasma en estudios separados [80,81] . La localización citoplasmática
es consistente con los transesteri Chp2 fi catión de diacildrehalosa, en el cual el subproducto
monoacyltrehalose puede reingresar directamente a la vía biosintética de poliacyltrehalose [81] . En
este modelo, MmpL10 transporta tanto el intermedio de diaciltrehalosa como el
biosíntesis basada en datos análogos para la aciltransferasa homóloga Chp1 [82] . Por el contrario, la
localización periplásmica de la aciltransferasa Chp2 implica que MmpL10 transporta solo
diacildrehalosa. Como tal, la pérdida de la función MmpL10 interrumpe la biosíntesis de
poliaciltrehalosa simplemente al evitar que Chp2 acceda a su sustrato de diacildrehalosa. Se ha
propuesto un modelo análogo para la función MmpL en M. smegmatis biosíntesis de polifleato de
trehalosa basada en la exportación predicha in silico de la aciltransferasa conocida como pE [sesenta
y cinco] . En general, una mejor comprensión del reconocimiento, función y mecanismo del sustrato
MmpL aguarda un análisis estructural y bioquímico detallado. Las estructuras cristalinas de los
dominios solubles de MmpL3 y MmpL11 [83] han sido resueltos y una envoltura molecular basada en
microscopía electrónica para el homólogo MmpL3 CmpL1 de C. glutamicum

fue reportado recientemente [84] , pero todavía falta una estructura a nivel atómico de un MmpL de
fi producto final de poliaciltrehalosa, ya que ambos lípidos se encuentran en la membrana externa [58] . longitud completa. Hasta ahora, los datos estructurales y bioquímicos disponibles respaldan una gran
Esta idea también se ha propuesto para el sulfolípido. similitud con otras permeases de RND, con un

Fig.5. Vías representativas para el transporte de lípidos de la membrana externa en micobacterias. Se supone que los transportadores MmpL fl Los lípidos de la membrana externa ip o sus precursores a través de la membrana interna, pero aún no está claro cómo se
transportan los lípidos a la membrana externa. Algunas vías de transporte requieren proteínas adicionales, incluidas proteínas de membrana integral de función desconocida (por ejemplo, Sap, un miembro de la familia Gap), transportadores dependientes de ATP
(por ejemplo, DrrABC, un transportador ABC) y / o lipoproteínas (por ejemplo, LppX y LprG, miembros de la familia Llp). Se desconocen sus funciones precisas en el transporte. (No representado: proteínas MmpS, que son proteínas ancladas en hélice
transmembrana con dominios periplásmicos C-terminales; ver Tabla 2 , Fig. 7 .)
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Organización del homotrímero y residuos conservados que se requieren para la función MmpL y que
probablemente forman el relé de protones por el cual la fuerza motriz del protón se traduce en la
translocación del sustrato. [84] . La vía que ha recibido la mayor atención últimamente es el transporte
de mycolate, debido a su esencialidad e identidad. fi catión como el objetivo de varios compuestos con
actividad antibacteriana, incluyendo BM212 (un 1,5-diarilpirrol), AU1235 (una adamantilurea),
THPP-2 (un tetrahidropirazolo pirimidina) y el candidato preclínico SQ109 (un análogo de
etilendiamina de la tuberculosis droga etambutol) [76, 85 - 87] . El sustrato para MmpL3 no es el ácido
micólico en sí mismo, sino un precursor de azúcar acilado, trehalose monomycolate (TMM; Las figs.
3, 5 ) [76,77, 86] , posiblemente en forma acetilada [88] . Como se señaló anteriormente para los
ácidos teicoicos, los lípidos de poliisoprenilo, como el fosfato de undecaprenilo, comúnmente sirven
como portadores para la modificación del azúcar. fi cationes El monomilato de trehalosa es una
inversión interesante de esa disposición, en la que el azúcar funciona como el " portador " para ellos
chocolate. Una vez transportado por MmpL3, el monomilato de trehalosa sirve como donante de
mycolate en el periplasma. El destino del monomilato de trehalosa tiene mayor similitud con la
biosíntesis de ácido lipoteicoico tipo IV, en el que después de ser fl Al pasar por la membrana
citoplasmática, el precursor unido a fosfato de undecaprenilo se puede transferir a los lípidos o al
peptidoglucano para formar ácido lipoteicoico o teicoico de pared. En las micobacterias, las
aciltransferasas del complejo Antigen85 (Ag85ABC; también conocido como FbpABC)
transesterifican el mycolate de una molécula de monomilato de trehalosa a otra, presumiblemente en
la membrana interna, para formar el dimilato de trehalosa de lípidos de la membrana externa ( Fig. 3 ) [89,90]
de apo y ligando, y es más similar a LolB, que mantiene una conformación abierta independiente de
. Además, las mismas enzimas transfieren el mycolate del monomilato de trehalosa directamente al
arabinogalactano para formar micolitos anclados a la pared celular. [91] . Dado el tamaño y la extrema
hidrofobicidad de los micoles, transesteri fi el catión en arabinogalactano, así como el transporte de
trehalosa dimilato a la membrana externa, probablemente requieran solubilización en el periplasma y
una fuente de energía para la extracción de la membrana interna, como en el transporte de
lipoproteínas gramnegativas y LPS ( Fig. 5 ; tabla 1 ) Estos requisitos también se cumplirían para otros
lípidos de la membrana externa ( Tabla 2 ) Sin embargo, los mecanismos para estos procesos
posteriores no se han identificado fi ed, más allá de las pocas intrigantes excepciones discutidas en
las siguientes secciones.
5.3. Más allá de la membrana citoplasmática: lipoproteínas de unión a lípidos de la familia Llp
En contraste con nuestro conocimiento del transporte por proteínas MmpL, el destino de los
lípidos de la membrana externa después de cruzar la membrana interna es en gran parte
desconocido. Una excepción es el transporte de dimicocerosatos de tiocerol. Exportación de
dimicocerosato de tiocerol a las capas lipídicas más externas de Mtb requiere no solo MmpL7 [67] ,
pero también la lipoproteína LppX [69] , y ambos están codificados dentro del grupo de genes de
biosíntesis de dimicocerosato de tiocerol ( Tabla 2 ; Fig. 5 ) Un Mtb
Tennesse:: lppX el mutante no arrojó dimicocerosato de tiocerol al medio de cultivo que contiene
detergente, pero retuvo este lípido en capas celulares más profundas, lo que sugiere un defecto
específico fi Cally en el transporte. Apoyando su papel como chaperona solubilizante, la estructura de
LppX reveló que los ácidos grasos co-puri fi ed de E. coli estaban atados a un bolsillo hidrofóbico
formado por un incompleto β- barril apostado por varios α- hélices, que muestran que LppX es
estructuralmente homólogo a LolA / B ( Fig. 6 ) Mientras que el bolsillo hidrofóbico dentro de LolA / B es
suficiente fi Con capacidad para acomodar solo una cadena de acilo, la cavidad central de LppX es lo
suficientemente grande como para unir las largas cadenas de acilo ramificadas con metilo del
dimicocerosato de tiocerol (y presumiblemente también los glucolípidos fenólicos relacionados
estructuralmente), aunque la unión directa de los lípidos de dimicocerosato a LppX no tiene Sin
embargo, se ha demostrado.
Curiosamente, LppX pertenece a una familia de cuatro homólogos en micobacterias que incluye
LprA, LprF y LprG y que en lo sucesivo denominaremos la familia Llp (lipoproteína de unión a lípidos)
( Fig. 6 ) LprG es ubicuo en las micobacterias y otros miembros del suborden Corynebacterineae,
mientras que LprA, LprF y LppX están más restringidos
y se encuentra en gran parte o completamente en especies patógenas, lo que sugiere roles más
especializados. De hecho, como se señaló anteriormente, los dimicocerosatos, que son los
supuestos sustratos para LppX, son factores de virulencia principalmente limitados al Mtb complejo de
micobacterias patógenas [64] . Recientemente, LprG también se ha implicado también en el
transporte de lípidos. Mientras lppX, lprA y lprF se predice que son monocistrónicos, lprG se
co-transcribe con rv1410c, Un transportador MFS. Ambos genes son necesarios para Mtb virulencia y
supervivencia in vivo [92 - 94] . La pérdida de la función LprG y / o Rv1410c está asociada con un
defecto en la visualización de la superficie del lipoarabinomanano [95,96] y con la acumulación
intracelular de triacilglicéridos [94] , que son ubicuos en la membrana interna pero también se
encuentran en la membrana externa [8,58] . De acuerdo con estos fenotipos, LprG se une a los
lípidos triacilos in vitro y se ha cocristalizado con dos sustratos supuestos, el glicérido de tripalmitoilo
( Fig. 6 ) y el lípido central de lipomanano / lipoarabinomanano, triancilfosfatidilinositol dimanósido (Ac 1 PIM
2) [ 94,97] . A diferencia de LolA / B, la cavidad de LprG puede unirse a las tres cadenas de acilo de
estos ligandos y, por lo tanto, puede solubilizar completamente los lípidos en el periplasma acuoso.
Además, mientras que la unión de lípidos indujo la expansión de la cavidad hidrófoba de LolB, no son
evidentes cambios distintos en las características estructurales individuales de LprG cuando el
ligando está presente versus ausente, según nuestros cálculos del volumen de la cavidad de la
proteína ( Δ ~ 1000 Å 3) [ 98] . La estructura independiente de ligando de LprG contrasta con las
conformaciones cerradas y abiertas que se han observado para LolA y propuestas para sus formas
la unión del ligando [36] . Más allá de simplemente unirse a los lípidos, hemos demostrado que LprG
transfiere el triacilglicérido entre las membranas de la bicapa en un ensayo in vitro basado en
vesículas, proporcionando el fi primera evidencia directa de actividad de transporte de lípidos para
LprG o cualquier proteína asociada a transporte de micobacterias [94] . Mientras que el af fi no se ha
determinado la cantidad de LprG para triacilglicéridos, LprG tiene una unión diferencial af fi nidades de
los lípidos de fosfato de inositol-manósido que dependen de la longitud de la cadena de manosa,
pero independientes de la acilación, lo que sugiere que LprG reconoce el glicano a través de sitios
fuera del bolsillo hidrofóbico [95] . Además, el análisis estructural identifica fi surcos hidrofóbicos ed
cerca de la entrada de bolsillo, lo que lleva a la hipótesis de que estos sitios acomodan las cadenas
de acilo más largas de isoformas de triacilglicéridos más grandes que exceden la capacidad de
bolsillo [94] . En general, los fenotipos de deleción génica, las propiedades de unión de lípidos, modi
de lipoproteínas fi catión y localización de la pared celular de LprG y LppX apoyan un papel para
ambas proteínas aguas abajo del transporte transmembrana de la membrana interna por Rv1410c y
MmpL7, respectivamente ( Fig. 5 ) Los homólogos restantes de Llp, LprA y LprF, obviamente no están
localizados con los loci biosintéticos lipídicos conocidos, lo que hace que las predicciones funcionales
sean diferentes. fi culto. Si bien sus funciones potenciales en el transporte de lípidos siguen siendo
desconocidas, los datos bioquímicos y estructurales indican que ambos se unen a los lípidos, aunque
a las especies de diacilo. [97,99] . Dado que tanto LprA como LprF tienen una posible preferencia por
lípidos más pequeños y no se predice que sean esenciales ni in vitro ni in vivo [70,92] , una hipótesis
es que son funcionalmente redundantes. En toda la familia Llp, los tamaños de cavidad calculados
varían ampliamente (LppX norte LprG norte LprA norte LprF; ~ 2800 N ~ 1500 N ~ 1400 N ~ 1000 Å 3) [ 98]
y sugieren que el tamaño del sustrato puede distinguir las funciones de estos homólogos. El papel de
LppX en la unión de lípidos más grandes también puede ilustrarse por su estructura divergente ( Fig.
6 ) LprG, LprA y LprF tienen estructuras muy similares, con la entrada a la cavidad hidrófoba formada
por bucles ( β 1 - 2), ( β 3 - 4), ( β 5- α 2) y ( α 2 - 3) En LppX, esta entrada se desplaza al lado opuesto de la
proteína y es fi ned en su lugar por bucles ( α 1-
β 1), ( β 2- β 3), ( β 4- β 5) y por hélice 2. Es probable que la hélice 3 también forme parte de la entrada
de bolsillo, pero no está resuelta en la estructura LppX y podría indicar más fl Exibilidad para
acomodar las largas cadenas ramificadas de metilo de dimicocerosatos ( Las figs. 3, 6 )
5.4. Otras proteínas asociadas al transporte
Las proteínas Llp no son la única familia de " accesorio " proteínas que se han relacionado con
transportadores de lípidos. MmpLs también son funcionalmente y
 MH Touchette, JC Seeliger / Biochimica et Biophysica Acta 1862 (2017) 1340 - 1354 1349

Fig.6. Estructuras cristalinas de proteínas periplásmicas asociadas al transporte en bacterias. ( parte superior) LolA se muestra en la conformación cerrada, que se estabiliza mediante enlaces de hidrógeno entre R43 (en bucle β 3 - 4) y residuos inhelices α 1
y α 2 (ID de PDB: 1IWL). LolBwas co- cristalizado con una molécula de polietilenglicol (ID de PDB: 1IWN). ( fondo) LppX fue cocristalizado con dos α-
ácidos linolénicos y un ácido docosahexaenoico. La línea verde discontinua indica la posición aproximada de la hélice. α 3, que no está resuelto (PDB ID: 2BYO). LprG se cocristalizó con un triacilglicérido (PDB ID: 4ZRA) y LprA con un
fosfatidilglicerol (JHC Tsai y JC Sacchettini, comunicación personal). Por análisis bioquímico, LprF se une a un diacilglicolípido; solo el diacilglicérido se incorporó a la densidad de electrones resuelta en el cocristal (PDB ID: 4QA8).

genéticamente asociado con proteínas pequeñas de Micobacteria Membrane Protein (MmpS),
transportadores ABC y las pequeñas proteínas transmembrana de 6 hélices de la familia de
proteínas asociadas a glucopéptidos (Gap). Aunque los tres tipos de proteínas se han relacionado
fenotípicamente con el transporte de lípidos, sus funciones exactas siguen siendo desconocidas.
Vías de transporte identi fi ed hasta ahora tiene una variedad de arquitecturas organizacionales ( Tabla
2 ), pero los motivos y requisitos para las diferentes combinaciones no son evidentes. La inclusión de
proteínas particulares en una ruta dada obviamente no está relacionada con las propiedades de los
respectivos sustratos lipídicos, aunque todavía no se han probado varias hipótesis razonables. Por
ejemplo, MmpL8 y MmpL10 están estrechamente relacionados en secuencia y tienen sustratos
estrechamente relacionados (trehalosa sulfatada acilada frente a trehalosa acilada). En la vía de los
sulfolípidos, la presencia de la proteína de membrana Sap, que se requiere para los niveles de tipo
salvaje y la localización de sufolípidos en la membrana externa. [82] , puede ayudar a la discriminación
del sustrato en el transporte de actilrehalosa sulfatada frente a la no sulfatada ( Fig. 5 ) Las proteínas
de la familia Gap, incluida la Sap, se asocian principalmente con glucolípidos a base de trehalosa,
con la excepción de la proteína Gap asociada con el transporte de glucopeptidolípidos, que es un
tripéptido glucosilado acilado individualmente que se encuentra en micobacterias no tuberculosas ( Tabla
2 ) [65,100,101] . Las proteínas de la familia Gap son proteínas integrales de membrana, pero carecen
de homología con proteínas de función conocida y no se sabe que dependen de la energía.
complicado por la incertidumbre con respecto a la localización de micobactina. Mientras que el
derivado anfifílico carboxibactina se secreta al medio ambiente, la microscopía electrónica de
transmisión ha detectado micobactina lipofílica en la membrana interna o próxima a ella. [103] y por
análisis de vesículas de membrana liberadas por micobacterias [104] , aunque estos datos no
necesariamente impiden la presencia de micobactina en la membrana externa.
Excepcionalmente, el transporte de dimicocerosato de tiocerol requiere no solo MmpL7, sino
también el transportador ABC DrrABC, que está codificado en el mismo grupo de genes que MmpL7.
La pérdida de la función DrrC evita de manera similar que el dimicocerosato de tiocerol llegue a las
capas externas de la célula
[105] . El dimicocerosato de tiocerol es uno de los lípidos de la membrana externa más hidrófobos
que se ha caracterizado estructuralmente y, como las lipoproteínas y las bacterias LPS en bacterias
Gram negativas, puede requerir la energía adicional de la hidrólisis de ATP mediada por DrrABC
para el proceso desfavorable de extracción de la membrana interna ( Fig. 5 ) Entre las proteínas de la
familia Llp, LppX también está singularmente co-localizado con un locus biosintético de lípidos. Si
bien esto podría indicar un requisito único para un " chaperona " En el transporte de dimicocerosato de
tiocerol, el hecho de que LprG no esté co-localizado con los genes biosintéticos para ninguno de sus
supuestos sustratos triacilglicéridos o lipoarabinomanano sugiere que el sintenomato podría ser
suficiente. fi cient pero no necesariamente obligatorio para la asignación funcional al transporte de
lípidos de la membrana externa.

Hasta ahora, las proteínas MmpS se han asociado exclusivamente con los metabolitos
derivados de aminoácidos, glucopeptidolípidos y (carboxi) micobactina, una especificidad de
micobacterias. fi c sideróforo [78,102] . Se predice que las proteínas MmpS tienen una hélice
transmembrana única y un dominio soluble C-terminal en el periplasma. La estructura del dominio
MmpS4 C-terminal se resolvió y mostró un siete β- sándwich de cadena sin homología con proteínas
dentro de otras vías de transporte de la membrana externa o de hecho con cualquier proteína de
función conocida [78] . Aún así, su topología e interacción funcional y física con MmpL4 sugieren una
posible similitud funcional con la proteína de transporte LPS LptC, que también tiene un dominio
soluble C-terminal anclado por una sola hélice transmembrana y está asociado con un transportador
de membrana integral (LptB 2 FG; Fig. 4 SI). Interpretar estos resultados en el contexto general del
transporte de lípidos a la membrana externa es
Finalmente, LppX y LprG pueden tener funciones análogas en vías con diferentes mecanismos:
en el transporte de dimicocerosato de tiocerol, MmpL7 puede actuar como un fl ippasa que transloca
el dimicocerosato de tiocerol en la capa periplásmica fl et de la membrana interna. En este modelo,
DrrABC extrae dimicocerosato de tiocerol de la membrana interna y lo pasa a LppX. Por el contrario,
y suponiendo la ausencia de un transportador ABC correspondiente en el transporte de
triacilglicéridos, Rv1410c puede transportar triacilglicéridos a través de la membrana y entregarlos
directamente a LprG. Los mecanismos divergentes para MmpL7 y Rv1410c no son irrazonables ya
que pertenecen a familias de proteínas distintas. Queda por determinar cuál de estos modelos, si
alguno, es relevante para otras vías que contienen MmpL que carecen de un transportador ABC
co-localizado.
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6. Modelos potenciales y preguntas restantes para el transporte de lípidos micobacterianos OM
Un intento de generalizar el transporte de lípidos de la membrana externa en las micobacterias y
hacer comparaciones con los procesos de transporte de la membrana externa en otras bacterias revela
dónde pueden existir diferencias potenciales y persisten brechas importantes ( tabla 1 ) Los
transportadores en la membrana interna son ubicuos, pero las funciones de otras proteínas asociadas
al transporte, presumiblemente en procesos posteriores, siguen sin estar claras. El transporte de
lipoproteínas y LPS utiliza componentes separados para el transporte de la membrana interna, la
extracción de la membrana interna, el desplazamiento periplásmico y la inserción de la membrana
externa de sustratos anfifílicos y requieren hasta seis proteínas o complejos de proteínas. Si bien se
puede hipotetizar una función de extracción para DrrABC, las proteínas Gap y MmpS carecen de
homología con proteínas de función conocida y no se sabe que dependen de la energía, lo que hace
que sus funciones precisas sean diferentes fi culto a predecir. Ninguna vía micobacteriana, tal como se
ha caracterizado hasta ahora, contiene todos los componentes necesarios para cumplir fi Todas estas
funciones. Algunas funciones múltiples o proteínas adicionales, aún no caracterizadas, están
involucradas.
Como se señaló anteriormente, los miembros de la familia Llp son estructuralmente homólogos
a LolA / B. Esta similitud invita a las comparaciones que podrían permitir posibles ideas sobre la
función Llp y pistas sobre el mecanismo de transporte de lípidos micobacterianos. Todas las
proteínas Llp son lipoproteínas conocidas o predichas y LprG, al menos, mantiene una conformación
abierta independiente de la unión del ligando. De esta manera, son más similares a LolB, y no se ha
chaperona y transporta los lípidos a la membrana externa. C) Los lípidos pueden ser recibidos por proteínas adicionales, probablemente incluyendo un β- proteína de barril, que facilita la inserción y / o transporte a través de la membrana externa. 1350
identificado ningún equivalente soluble para LolA fi ed. Sin embargo, la localización de la membrana
externa es necesaria para la función normal de LolB y, hasta el momento, no se ha identificado el
nomecanismo para transportar lipoproteínas (es decir, ningún equivalente funcional del sistema Lol
en sí) fi ed en micobacterias. Dado que se presume que todas las lipoproteínas micobacterianas
residen en la capa externa fl et de la membrana interna, las proteínas Llp pueden parecerse
funcionalmente a LptC, que en la corriente " PEZ " El modelo de transporte LPS pasa el lípido del
transportador ABC LptB 2 FG a LptC y luego a LptA ( Fig. 4 SI, Fig. 7 ) [24] . Una construcción LolB
soluble que carece de acilación N-terminal
complementó la función de LolB, pero no mostró preferencia por la membrana interna o externa y, en
consecuencia, los sustratos de LolB fueron translocados de manera transitoria, lo que indica que la
localización de la membrana externa de LolB es importante para la direccionalidad del transporte [35] .
Hemos demostrado que un puri fi Ed soluble variante de LprG que carece de la modificación de lípidos fi el
catión transfiere el triacilglicérido marcado entre las bicapas lipídicas, lo que demuestra que LprG
puede extraer lípidos independientemente del anclaje de la membrana [94] , pero la importancia del
modi lípido N-terminal fi catión a la función LprG en las células no se ha determinado. Por lo tanto, LprG
puede estar anclado en una o ambas membranas internas y externas, o puede desplazarse entre las
membranas a través de anas aún no identificadas fi sistema de transporte de lipoproteínas ed ( Fig. 7 )
Además de los experimentos que diseccionan la función LprG, la eliminación genética y los estudios
bioquímicos sobre LprA y LprF podrían contribuir a modelos mecanísticos para estas proteínas y sus
vías relacionadas.
Basado en los sistemas análogos de Lol y Lpt, así como en las presuntas restricciones físicas
discutidas anteriormente para las proteínas Llp, postulamos que otras proteínas más allá de las
resumidas en Tabla 2 son necesarios para completar la cadena de transporte ( Fig. 7 )
Desafortunadamente, ni la sintenía ni la homología de secuencia ofrecen candidatos obvios para
componentes adicionales. Identi fi El catión de estos jugadores adicionales requerirá el desarrollo de
enfoques novedosos, tales como ensayos de defectos de transporte de lípidos que conducen a
pruebas genéticas y métodos bioquímicos que interrogan especi fi c interacciones lípido-proteína y
proteína-proteína. Se necesitan nuevas herramientas para permitir tales enfoques y se analizan más
adelante.
Como es el caso de las proteínas MmpL, LppX y LprG están asociadas con especi fi c sustratos
lipídicos (dimicocerosatos y triacilglicéridos / lipoarabinomanano, respectivamente). Sin embargo,
aunque hay 13 proteínas MmpL de longitud completa codificadas en Mtb solo hay 4 proteínas Llp. Si
las proteínas Llp como familia participan en el transporte de todos los lípidos de la membrana
externa, deben tener (1) especificaciones de sustrato más amplias fi ciudad de lo que se entiende
actualmente y / o (2) un mecanismo por el cual solubilizan lípidos más grandes de lo que permitirían
sus cavidades de unión. El sustrato aparente speci fi La ciudad mostrada por LppX y LprG puede
deberse a funciones

proteína MmpS o Llp a una proteína periplásmica, que puede mediar el transporte por difusión pasiva (representada) o formando un puente continuo entre la membrana interna y la membrana externa. En el modelo 2, la proteína Llp es solubilizada por una

de más modi fi catión a forma madura, si es necesario, los lípidos se extraen de la membrana en proteínas chaperonas periplásmicas que transportan sus sustratos a la interfaz de la membrana externa. En el modelo 1, los lípidos se pasan a través de una

Fig.7. Modelos para el transporte de lípidos de la membrana externa en micobacterias. A) Los lípidos de la membrana externa o sus precursores son fl ipped o transportados a través de la membrana interna por una o más proteínas de membrana. B) Después
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redundancia y sustratos superpuestos entre las proteínas Llp, pero esta hipótesis aún no se ha
probado utilizando cepas de genes múltiples inactivados. Los lípidos de la membrana externa como
el trehaloso dimilato que son más grandes que la cavidad de una sola proteína Llp pueden
acomodarse uniéndose a múltiples proteínas Llp. Esto sería funcionalmente análogo a la unión de
polipéptidos nacientes por múltiples trímeros Skp en el periplasma durante β- transporte de proteínas
en barril al complejo Bam en la membrana externa [106] .
Las micobacterias pueden haber desarrollado diversas vías para la exportación de lípidos para
acomodar la amplia variedad de lípidos de la membrana externa y posiblemente para permitir la
regulación independiente de varios componentes y, por lo tanto, la modulación controlada de la
composición de los lípidos de la membrana externa. Por ejemplo, el regulador de respuesta de dos
componentes PhoPR regula positivamente la biosíntesis de los lípidos de aciltrehalosa y los genes
transportadores correspondientes. mmpL8 y mmpL10 [ 107] . En consecuencia, un Mtb mutante
defectuoso para phoP carecían de sulfolípidos y acilltrehalosas, pero mantenían niveles de lípidos de
micolato de tipo salvaje, que son transportados por MmpL3. Además, la corregulación de genes que
codifican proteínas de transporte putativas puede indicar funciones relacionadas. La pérdida del factor
sigma SigF está asociada con defectos de la envoltura celular y la sobreexpresión de SigF condujo a
la regulación positiva de mmpL11, mmpL12, y lprA [ 108] , lo que aumenta la posibilidad de que LprA
esté involucrado en el transporte de ésteres de micolato y / o lipooligosacáridos, que son
oligosacáridos modi fi Los lípidos de trehalosa se encuentran principalmente en micobacterias fuera del Mtb la pared celular a través de análogos de trehalosa o monomilato de trehalosa y se utilizan para unir fl uoróforos
complejo ( Tabla 2 )
En los ejemplos anteriores, la biosíntesis y el transporte de un lípido dado están co-regulados a
nivel transcripcional. Por otro lado, la ubicuidad de los portadores dependientes de protones, como
las permeasas RND y los transportadores de MFS en el transporte de lípidos de la membrana
externa, plantea la intrigante posibilidad de que cambios inducidos ambientalmente en la fuerza
motriz de los protones en fl uence la composición de la membrana externa al afectar la actividad del
transportador. En condiciones de limitación de energía, como la restricción de carbono y la infección
del huésped, Mtb activa vías respiratorias alternativas, como resultado de lo cual se puede alterar la
fuerza motriz del protón [109] . Estos cambios podrían en fl uence la función del transportador de
manera que altere el fl Ux de lípidos a la membrana externa. Mecanismo apostólico que los cambios
en la fuerza motriz del protón afectarían la actividad del transportador es la unión competitiva de
protones y sustrato, como se ha caracterizado en el transportador MFS y el antiportador de protones
MdfA [110] . Como se señaló anteriormente para la familia MmpL, una mejor comprensión de la
función del transportador y el mecanismo espera un examen bioquímico y estructural más detallado
de estas proteínas.
7. Desafíos actuales en la exploración de las vías de transporte de lípidos de la membrana externa
Nuestra comprensión mecanicista de las vías de transporte de lípidos de la membrana externa se
vería ayudada por nuevos enfoques y herramientas. En un enfoque de detección genética, la
identificación de mutantes defectuosos en el transporte de lípidos particulares de la membrana
externa requeriría ensayos apropiados. Idealmente, un ensayo detectaría una firma molecular para el
transporte de un lípido o lípidos particulares, en lugar de un fenotipo proximal como la permeabilidad
de la membrana o la hidrofobicidad de la superficie, ya que tales propiedades generales
probablemente conducirían a numerosos falsos positivos. Las técnicas analíticas de lípidos más
comunes, como la cromatografía de capa delgada o la espectrometría de masas combinadas con
extracción diferencial con solventes, son demasiado engorrosas y requieren una masa celular
demasiado grande para ser practicables para aplicaciones de detección de alto rendimiento, aunque
la automatización puede eventualmente hacer que tales enfoques sean factibles. fi los anticuerpos c
permitirían analizar la superficie de los lípidos en mutantes individuales o en una biblioteca agrupada,
por ejemplo, fl clasificación de células asistida por fluorescencia. Si bien las micobacterias están
rodeadas por una cápsula de polisacárido, esta capa poco asociada generalmente se pierde en
condiciones estándar de cultivo in vitro que contienen detergente, lo que hace que los lípidos de la
membrana externa sean potencialmente accesibles para la detección de la superficie. Este enfoque se
ha utilizado para caracterizar la pantalla de lipoarabinomanano
1351
fenotipo de un Mtb Δ lprG mutante [95] , pero su aplicación más amplia está limitada por la falta de
anticuerpos apropiados. Además, los glucanos hidrofílicos grandes en lipoarabinomanano y
lipomanano son fácilmente accesibles por anticuerpos, mientras que la especi fi c la detección de otros
lípidos por anticuerpos podría estar limitada por sus posiciones dentro de la membrana externa. No
se esperaría que el dimicocerosato de tiocerol, por ejemplo, estuviera expuesto al solvente. Por el
contrario, sin embargo, se usó un anticuerpo desarrollado por la presentación en fagos para
inmunostener el dimicocerosato de tiocerol en la superficie de Mtb [ 111] . Dado que los principales
lípidos de la membrana externa como el sulfolípido y el trehaloso dimilato pueden aislarse mediante
protocolos bien establecidos para generar puri fi El antígeno ed, la metodología de presentación de
fagos, que evita problemas potenciales con la antigenicidad lipídica, puede ser más práctica y
ampliamente aplicable que los métodos tradicionales para generar anticuerpos.
Alternativamente, las vías de transporte podrían diseccionarse mediante métodos bioquímicos
que identifican proteínas que interactúan con los lípidos de la membrana externa o con otras
proteínas que funcionan en el transporte de lípidos de la membrana externa. Por ejemplo, los lípidos
fotorreactivos bifuncionales se han utilizado para reticular, enriquecer e identificar proteínas que
interactúan con los lípidos en las membranas celulares. [112,113] . Los grupos reactivos
bioortogonales también se han incorporado metabólicamente en lípidos micobacterianos y micoles de
para imágenes [114 - 116] , pero aún no ha incorporado la funcionalidad reactiva para la reticulación a
biomoléculas o se ha utilizado para af no covalentes fi enriquecimiento de las proteínas que
interactúan. Por otro lado, se han identificado interacciones proteína-proteína en micobacterias fi ed y
con fi en gran parte utilizando pantallas de dos híbridos
[117 - 120] . Por ejemplo, las pantallas de dos híbridos de levadura produjeron interacciones
novedosas entre un dominio soluble predicho de MmpL7 y la enzima biosintética de dimicocerosato
PpsE [118] y entre LprF y el dominio sensor de la histidina quinasa KdpD [117] . Sin embargo, estos
ensayos reconstituyen las interacciones proteína-proteína en el citoplasma. Debido a que las
proteínas de la pared celular no se expresan en su entorno nativo, las interacciones detectadas
pueden no ser fisiológicas. Además, los métodos de dos híbridos disponibles actualmente no pueden
aplicarse en la pared celular porque dependen de los metabolitos ausentes de la pared celular /
periplasma. Por el contrario, las interacciones entre las proteínas de la pared celular y entre las
proteínas y los lípidos de la pared celular se han investigado con éxito en los sistemas Lol y Lpt por
sitio específico. fi c fotocrosslinking, como se señaló anteriormente [38,44, 51] . Este enfoque utiliza la
incorporación de un aminoácido fotorreactivo no natural en las proteínas, que se ha demostrado en
un principio de prueba con GFP expresado en micobacterias [121] . Cuando se usa para la
fotocrosslinking entre proteínas endógenas en micobacterias, tiene el potencial de descubrir
proteínas que interactúan con transportadores conocidos y, por lo tanto, pueden estar relacionadas
funcionalmente [122] . Muchas preguntas en el transporte de la membrana externa requieren la
capacidad de interrogar la topología de la membrana, es decir, resolver no solo en qué membrana,
sino en qué fl Et de los sustratos de membrana interna o externa residen o se acumulan. La
reconstitución en los proteoliposomas permite un control completo sobre la composición tanto de
lípidos como de proteínas, pero técnicamente es un desafío debido a las preocupaciones sobre la
preservación de la función de las proteínas.
fi cultivo de aislamiento de lípidos micobacterianos, y la falta de conocimiento sobre la incorporación
estable de dichos lípidos en las membranas de la bicapa. En bacterias Gram negativas, las
preguntas en el transporte se han resuelto utilizando sistemas que se derivan de las células y, por lo
tanto, preservan la composición y la topología de la membrana nativa. Estos incluyen esferoplastos,
en los que se eliminan el peptidoglucano y la membrana externa para aislar los contenidos de
membrana interna y citoplasmática, y las vesículas de membrana invertida, que permiten la
estimulación de los procesos transmembrana desde la cara citoplasmática de la membrana interna.
Estas preparaciones han permitido la reconstitución precisa y la interrogación mecanicista de
diversos pasos en el transporte, incluida la liberación de proteínas de la membrana interna por LolA [30,123]
y secreción de proteínas impulsada por ATP por los sistemas Sec y Tat [124] . En contraste, la
generación y aplicación de esferoplastos en micobacterias solo se ha informado con moderación en
la literatura. [125 - 129] . Como alternativa, la liberación espontánea.
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de vesículas de membrana de micobacterias y estas vesículas consisten principalmente en lípidos
citoplasmáticos [130] . Sin embargo, dada la estructura de doble membrana de las micobacterias, el
origen y la topología de estas vesículas de membrana aparentemente internas no están claras y
pueden no ser representativas de la membrana interna en las células intactas. Se han utilizado
vesículas de membrana invertidas de micobacterias para medir la actividad enzimática iniciada por
especi fi c sustratos añadidos exógenamente [131 - 134] , pero no se han aplicado a problemas en la
translocación de lípidos. En general, la aplicación más amplia de los sistemas de vesículas in vitro se
vería facilitada por la sensibilidad y especi fi c herramientas como los anticuerpos que pueden detectar
lípidos en las superficies de la membrana.
En resumen, quedan muchas preguntas en el transporte de lípidos de la membrana externa
micobacteriana que son convincentes debido a la importancia del transporte para la virulencia de las
especies patógenas. El reciente advenimiento de la lipidómica micobacteriana, que permite un pro-
tejo molecular integral
fi abadejo [135] y métodos de extracción de micelas inversas, que eliminan selectivamente los lípidos de la
membrana externa no unidos covalentemente [136] , ya ha permitido nuevos conocimientos sobre la
composición de la membrana micobacteriana [8, 137] . En combinación, estos enfoques prometen ayudar a
los estudios de transporte al proporcionar una discriminación sin precedentes de los lípidos entre las
membranas interna y externa. Mientras que el transporte de lípidos de la membrana externa
micobacteriana sigue siendo un desafío técnico fi campo, el desarrollo de herramientas adicionales y la
posterior aplicación de tecnologías existentes como las especificaciones de lípidos fi anticuerpos c y especi.
del sitio fi Es probable que el fotocrosslinking de proteínas c produzca descubrimientos importantes en esta
área poco estudiada.
Documento de transparencia
los Documento de transparencia asociado con este artículo se puede encontrar, en versión en
línea.
Agradecimientos
Agradecemos a Jennifer HC Tsai y James C. Sacchetini por proporcionar las coordenadas de
estructura cristalina LprA. Esta investigación no recibió ninguna especi fi c Subvención de agencias de
financiación públicas, comerciales o sin ánimo de lucro. fi t sectores.
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