Secuenciación de sanger

Es el mas usado desde la antigüedad

Se toma una secuencia de adn de interés por calor se desnaturaliza, este adn se separa en una
cadena codificante y una complementaria, se toma la complementaria y se genera un primer o
partidor o cebador, que es una cadena de acido nucleico que sirve como punto de partida de
replicación de adn este primer es generalmente de rna, este primer permite al dna polimerasa
continuar la síntesis del adn, los dntp desoxirribonucleotidos trifosfato, que son dna polimerasa
son los que continúan la síntesis de adn, se usan por lo general variantes de esta molecula usando
fosforo32 u otro isotopo radioactivo para su visualización en gel poliacrilamida, se usa además
ddntp dideoxirribonucleotido trifosfato que al tener falta de un grupo hidroxilo no puede formar
enlaces fosfodiester con otros nucleótidos, al agregar este ddntp el proceso se detiene y se libera
la cadena si se usa ddntp en mas baja concentración que dntp la síntesis del nuevo dna se va a
detener en varios puntos dependiendo de las bases nitrogenadas del primer y la cadena
complementaria

Si tomamos 4 tubos con gel poliacrilamida cada uno con dda ddg ddc ddt adenina, guanina citosina
y timina en cada tubo las cadenas se van a separar por peso molecular la actividad de los isotopos
se van a ver en una película de nitrocelulosa pudiéndose contar de abajo a arriba la cadena que se
generar es igual a la cadena codificante

Las semillas se sembraron duchefa biochemie es una empresa que hace medios de cultivo a
medida, en este caso se genero uno para la arabidopsis con agarosa que es un polisacárido se
extrae de algas gellidium y gracillaria, uso para construir geles que por electroforesis permiten
separar moléculas de adn además de agarosa al 1 o 2,5 % se usa también en el cultivo solido
buffers disolventes como agua destilada, factores de crecimiento como hormonas agua y
minerales además también nutrientes para el cultivo

Semillas tratadas en frio por 48 horas para sincronizar la germinación luego se cultivan en un
fitotron a 20 grados, el fitotron es una cámara para el crecimiento de plantas con todos los
medios optimos para el desarrollo de estas además se toma a 20 grados por que el nivel de
oxigeno disuelto en agua después de esta temperatura disminuye por lo que las raíces lo van a
recibir en menor medida
Se va a exponer a la luz el cultivo por 4 horas para inducir la germinación luego se envuelven con 3
capas de lamina de aluminio para la eskotomorfogenesis y se colocan en un fitotron a 20 grados
que ya se sabe por que

La Etiolación es un proceso natural que ocurre en las plantas por la ausencia prolongada de luz en
una zona específica o en la planta completa. Este fenómeno se basa en la pérdida parcial o total de
los pigmentos clorofílicos en los tejidos de los tallos transformándolos en tejidos blanquecinos
muy similares al de las raíces. se caracteriza por el crecimiento del hipocotilo, débil al final en
forma de gancho y con un cotiledón caído y pequeño de coloración amarilla y con dificultad para
realizar la fotosíntesis “etiolación”. Inicia con la skotomorfogenesis
En la tinción de la pared celular se uso yoduro de propidio durante 10 min y se lavo posteriormente
con agua, esta tinción es caracterizada por ser un agente de intercalación fluorecente que se
puede usar para teñir células se usa generalmente para viabilidad celular o contenido del adn o en
ciclo celular, el yoduro de propidio no puede atravesar células vivas se usa para diferenciar células
necróticas apoptoticas y sanas,

Microscopio confocal

En el esquema de la izquierda podemos ver un objeto tridimensional (rosa) que tiene varios
planos focales. La luz de todos los planos es refractada por la lente, pero solo la que procede del
plano central, que está en foco (haz azul), es capaz de pasar a través del pinhole dándo lugar a
una imagen nítida y perfectamente definida de las estructuras situadas en el plano focal  sin
interferencia de la luz procedente del resto del objeto. 
Para estudiar un objeto en microscopía confocal se toman imágenes procedentes de distintos
planos focales, a cada una de éstas se las denomina sección óptica, porque equivale a la imagen
obtenida al seccionar la muestra con un microtomo (secciones ópticas).
Con sistemas informáticos adecuados es posible realizar una reconstrucción tridimensional del
objeto a partir de las distintas secciones ópticas, del mismo modo que con los distintos cortes de un
sistema radiológico de TAC o resonancia magnética se puede reconstruir informáticamente
estructuras anatómicas humanas.
EL estado de exitacion se da cuando Cuando se forma un enlace entre dos átomos en una
molécula,
los orbitales atómicos de cada uno de los átomos que forman el enlace generan dos
orbitales: uno enlazante de baja energía y otro antienlazante de energía mucho mayor.
Cuando la molécula no está excitada, los electrones que forman un enlace específico se
encuentran ocupando los orbitales enlazantes, debido a que estos son de energía menor
y por lo tanto de esta manera la molécula es más estable.
Asociados a cada nivel electrónico se encuentran diferentes niveles vibracionales, por lo
que cuando una molécula es irradiada con energía de cierta frecuencia o longitud de
onda esta puede pasar a diferentes niveles vibracionales de alguno de los estados
excitados

la fluorescencia es una manifestación del fenómeno de fotoluminiscencia “Emisión de luz como

consecuencia de la absorción previa de una radiación.” Absorción de el laser, La fluorescencia
cesa
casi inmediatamente después de que a la muestra se le suspende la radiación

La
relación que existe entre fluorescencia y concentración es directamente proporcional; a
mayor concentración mayor fluorescencia y viceversa, por lo que una gráfica de
intensidad de fluorescencia contra concentración es una línea recta (siempre y cuando
A<0.05 ).

FACTORES QUE AFECTAN LA FLUORESCENCIA.- La intensidad de fluorescencia es

afectada por los siguientes factores:
1. Estructura: La fluorescencia se presenta más comúnmente y en forma más intensa
con compuestos que tienen grupos funcionales aromáticos con bajas energías de
transición p®p*. Compuestos que tienen estructuras de carbonilos alifáticos y
alicíclicos o de dobles enlaces cojugados con un alto grado de estabilidad de
resonancia también pueden presentar fluorescencia, pero el número de estos es
relativamente pequeño comparado con el número de sistemas aromáticos
fluorescentes.
La sustitución de grupo funcional en el anillo de benceno cambia la longitud de onda
de máxima absorción con un cambio correspondiente en la posición e intensidad de la
línea de emisión de fluorescencia.
2. Temperatura y naturaleza del solvente: El efecto de un aumento en la temperatura
incrementa el número de choques moleculares, por lo que la desactivación tiende a
efectuarse a través de procesos no radiativos y por lo tanto se inhibe la fluorescencia.
La viscosidad del solvente tiene efectos similares, a mayor viscosidad menor número
de choques moleculares y mayor intensidad de fluorescencia.
La polaridad del solvente también tiene influencia en la fluorescencia, debido al efecto
hipsocrómico y batocrómico que el solvente ejerce sobre el compuesto.
3. Efecto del pH: Debido a las diferentes formas químicas que son posibles de existir a
diferentes condiciones de pH, la intensidad de fluorescencia también es afectado por
este factor. Ejemplo: el fenol y el ión fenolato tienen diferentes propiedades
fluorescentes, por lo que si las condiciones son de pH básico la especie estará en el
equilibrio químico en la forma del fenol y/o ion fenolato, afectando así la intensidad de
fluorescencia.
4. Efecto del oxígeno disuelto: Debido al paramagnetismo de la molécula de oxígeno,
esta tiende a desactivar cualesquier estado activado por oxidación fotoquímica de la
especie fotoluminiscente, provoca cruzamiento intersistemas y conversiones de las
moléculas excitadas al estado triplete .por lo que es deseable que el oxígeno no se
encuentra presente en solución o su concentración sea mínima

Láser de estado sólido. Este tipo de láser se caracteriza por tener como medio activo no un gas,
sino una varilla ó una plancha sólida de aislante cristalino ligeramente impurificado. Es el
constituyente impurificador lo que proporciona la estructura energética requerida para producir el
efecto láser. La red cristalina actúa especialmente como material huésped, aunque también
modifica la estructura energética global.

Fotos de 1024x 1024 pixeles en la sección óptica con intervalo de z de 1 um

Se cuantifico el angulo por estudio de la primera capa de células de la corteza del hipocotilo “ capa
debajo de la epidermis” para cada condición ambos mutantes y salvaje, se cuantifico la torsión el
angulo de 12 hipocotilos a partir de 3 replicas, angulo se midio en relación con el eje hipocotilico, 0
es igual a no torsión, angulos positivos o negativos marcan torsión a izquierda o derecha
respectivamente,

Para la medición del angulo de torsión se uso Fiji es un programa que tienen miles de plugins para
el análisis y proceso tales como reconstrucción y análisis morfológico de una foto

Y en cuanto a los análisis estadísticos y trazado de datos se uso, R EL CUAL ES UN POTENTE

SOFTWARE ESTADISTICO ADEMAS LIBRE Esta característica permite aplicar cálculos a un
conjunto de valores a la vez sin la necesidad de utilizar un algoritmo más sofisticado como una
función bucle,  Algunas técnicas avanzadas y robustas solo pueden realizarse con este
software.

 Ambiente de trabajo muy flexible y extensible.

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 Gran cantidad de información sobre sus funciones y paquetes de funciones.
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Prueba de suma de rango de wilcoxon

El método es aplicable a muestras pequeñas, siempre y cuando sean mayores que 6 y menores
que 25. Las muestras grandes deben ser mayores a 25 y éste se debe transformar en valor de Z,
para conocer la probabilidad de que aquella sea o no significativa.

Dicha prueba estadística consiste en sumar los rangos de signo frecuente; por ello, no se tiene una
ecuación o fórmula, como se observa en otras pruebas estadísticas.

Observaciones

pareadas

Pasos:

1. Arreglar las observaciones pareadas y obtener las diferencias de cada pareja.

2. Arreglar las diferencias en función de rangos como valores absolutos, sin importar el signo, pero
de manera que los rangos conserven el signo correspondiente a la diferencia.

3. Obtener la sumatoria de los rangos cuyo signo es el menos frecuente, por ejemplo: si el signo es
+, se considerará para efectuar sumatorias; sin embargo, la sumatoria mencionada finalmente
pierde el signo.

4. Si se trata de muestras pequeñas, comparar el valor obtenido con los valores críticos de la tabla
de Wilcoxon.

5. Distribuir las muestras mayores que 25 bajo la curva normal y, por tanto, calcular el valor Z, en
referencia al cual se debe consultar la probabilidad de diferir con respecto al promedio en la tabla
de probabilidades asociadas.
6. Decidir si se acepta o rechaza la hipótesis.