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UNIVERSIDAD DE CALDAS

FACULTAD DE CIENCIAS EXACTAS Y NATURALES LABORATORIO


BIOQUIMICA GENERAL

Práctica N 3. Espectrofotometría UV-Visible: Extracción y cuantificación de clorofila A y B

Elaborado por: Diana Marcela Ocampo S.


Departamento de Química

Fundamento

La fotosíntesis es un proceso de suma importancia para la biosfera porque convierte la


energía de la radiación solar en energía química que puede ser usada por todas las formas
de vida (Kraub 2003). Para la fotosíntesis la planta utiliza la radiación fotosintéticamente
activa (PAR) que está en el rango entre 400 a 700nm.

La fotosíntesis comprende dos reacciones globales diferenciadas. En la primera se realiza la


transducción de energía, y en la segunda la reducción y fijación del carbono. Este conjunto
complejo de dos reacciones ha sido objeto de intensa investigación y ha resultado en la
postulación de dos conceptos fundamentales para las reacciones fotoquímicas; el primero se
refiere al concepto de unidad fotosintética (Emerson y Arnnon 1932) y el segundo el
concepto de dos fotosistemas (Hill y Bendal, 1960). De acuerdo al primer concepto en
todos los sistemas fotosintetizadores (bacterias, algas verdes unicelulares y plantas) los
pigmentos que absorben la luz se dividen en dos grupos, los que absorben y transfieren la
energía hacia el centro de reacción y los que conforman este centro que constituyen un tipo
particular de moléculas de clorofila (Chl a P680 y Chl a P700) y que llevan a cabo la
reacción fotoquímica (Zeinalov 2005). De acuerdo al segundo concepto la luz induce una
transferencia de electrones vectorial que requiere la cooperación de dos tipos de
fotosistemas llamados I y II (PSI y PSII) los cuales funcionan como una maquinaria
fotoeléctrica, aquí el agua es usada como donador de electrones que induce una separación
de cargas en el PSII, con la liberación de O2 como bioproducto. En el PSI, la reducción del
aceptor terminal dona un electrón a la ferredoxina el cual es usado para reducir NADP+ que
finalmente se utiliza en la conversión de CO2 a carbohidratos. El flujo de electrones en el
PSII y PSI está ligado a una serie de reacciones de transferencia de electrones a través de
plastoquinonas, el complejo citocromo b6/f y la plastocianina.
Todas estas reacciones están acopladas al consumo y liberación de protones en ambos lados
de la membrana tilacoidal formando una diferencia de potencial electroquímico necesario
para la síntesis de ATP con la intermediación de la ATPasa protónica. Tanto el PSII como
el PSI tienen su propio centro de pigmentos antena formados por clorofila (chl) y moléculas
de carotenoides (Kraub 2003). Los cuatro complejos que permiten la fotosíntesis se
distribuyen en el cloroplasto: PSII en el grana, PSI en las lamelas, ATPasa en las lamelas y
el complejo de citocromo en la grana y sus márgenes (Ben-She y Nelson 2004).

Los conceptos relacionados con la segunda reacción que implica reducción y fijación de
CO2 a moléculas orgánicas con la utilización de subproductos de la primera reacción, fue
delineada por Bassham et ál. 1954 y otros quienes dilucidaron la ruta completa de
asimilación del dióxido de carbono con intermediarios y las enzimas relacionadas en este
proceso. El ciclo de Calvin (ruta C3) representa la ruta central de la reducción del CO 2. El
ciclo C3 se inicia cuando la enzima Ribulosa 1-5 bifosfato carboxilasa oxigenasa (Rubisco)
realiza la carboxilación del CO2 al aceptor ribulosa-1,5-bisfofato RuB-P y forma como
primer producto estable de este proceso dos moléculas de 3- fosfoglicerato que luego es
reducido a gliceraldehido 3-P, una triosa precursora de la regeneración de RuB-P y de la
síntesis de sacarosa y almidón.

En la naturaleza las plantas experimentan un amplio rango de estrés tanto biótico como
abiótico operan simultáneamente o en diferentes combinaciones y afectan el crecimiento y
el desarrollo. El estrés provocado por alta radiación, radiación UV, déficit hídrico, altas
concentraciones de sales, patógenos, metales pesados y temperaturas extremas puede
afectar la fotosíntesis (Larcher 2003; Herrera et ál. 2010). El fotodaño de los cloroplastos es
la respuesta principal y común de todos los factores de estrés que operan en condiciones de
campo en presencia de luz, entonces el cloroplasto es considerado como el blanco del estrés
ambiental. Este daño se causa por incremento desmesurado de la producción de especies
reactivas de oxígeno (ROS) consecuencia del incremento en el traspaso de energía hacia
moléculas de O2 formando una serie de complejos que alteran el estatus redox del estroma
y de la membrana tilacoidal, lo cual causa una baja en la eficiencia de los fotosistemas,
disminución en el fijación de CO2, pérdida del uso eficiente del agua, entre otras (Murata et
ál. 2007). Sin embargo, cuando las plantas experimentan diferentes estreses en secuencia, la
exposición a un estrés puede desarrollar tolerancia a otro (Shanker 2005), debido a que, el
aparato fotosintético es una maquinaria molecular flexible que puede aclimatarse a
fluctuaciones metabólicas y de luz en minutos o segundos o a escalas mayores de tiempo,
en donde los cambios ambientales disparan respuestas de señalización que finalizan en
modificaciones en la biogénesis del aparato fotosintético (Eberhard et ál. 2008). El estudio
de los pigmentos es importante desde el punto de vista ecofisiológico ya que aporta
información sobre productividad y eventos de estrés, entre otros. Las alteraciones en la
composición de pigmentos fotosintéticos pueden estar relacionados con la fotoaclimatación
(Richardson et ál. 2002). En general, las células aclimatadas a alta irradiación pueden
contener altas concentraciones de carotenoides en relación a Chl a.

En el proceso de fotosíntesis se utilizan como componentes esenciales de la maquinaria


pigmentos tetrapirrólicos denominados clorofilas. Se conoce que el primer precursor de las
clorofilas en plantas es el ácido α-aminolevulínico (ALA), un compuesto de 5 carbonos que
proviene del ácido glutámico (Castelfranco y Beale 1983). La clorofila a se puede convertir
en clorofila b mediante la oxigenación enzimática activada por la clorofila a monoxigenasa
(CAO) (Tanaka y Tanaka 2002). En ocasiones la biosíntesis de clorofila a se puede ver
inhibida, en algunos casos la clorofila b puede re convertirse en clorofila a vía 7-
hidroximetil clorofila a por las enzimas clorofila b reductasa y 7 hidroximetil clorofila a
reductasa (Tanaka y Tanaka 2002). Estos pigmentos son esenciales para la conversión de
energía. La clorofila a está asociada a proteínas del centro de reacción y a los pigmentos
antena del fotosistema I (PSI) y fotosistema II (PSII), además esta clorofila junto con la Chl
b se asocian a los complejos externos cosechadores de energía del PSI y PSII denominados
LHCI y LHCII respectivamente (Nelson y Yocum 2006).
Además existen otros pigmentos accesorios en las plantas superiores, como los
carotenoides (carotenos y xantofilas). La mayoría de los pigmentos sirven como antenas
que colectan luz y transfieren la energía a los centros de reacción, además de cumplir otras
funciones de protección. Los carotenoides consisten en una serie de dobles enlaces
conjugados, lo cual les da la capacidad de capturar y transducir energía. Los carotenoides
están asociados con proteínas y embebidos en las membranas dentro de los cloroplastos,
donde interactúan con las moléculas aceptoras y transportadoras; así mismo, están
relacionados con la protección contra daño fotooxidativo del aparato fotosintético, al
disipar el exceso de luz absorbida por los pigmentos.

La energía lumínica absorbida por los pigmentos fotosintéticos puede ser utilizada en las
reacciones fotoquímicas, ser re-emitida por la clorofila como fluorescencia o ser disipada
térmicamente hacia moléculas accesorio.

De allí que la ecuación general por medio de la cual se da la fotosíntesis corresponde a:

Técnica para la medición de nivel fotosintético

La espectrofotometría UV-visible es una técnica analítica que permite determinar la


concentración de un compuesto en solución. Se basa en que las moléculas absorben las
radiaciones electromagnéticas y a su vez que la cantidad de luz absorbida depende de forma
lineal de la concentración. Para hacer este tipo de medidas se emplea un espectrofotómetro,
en el que se puede seleccionar la longitud de onda de la luz que pasa por una solución y
medir la cantidad de luz absorbida por la misma. En esta práctica se darán a conocer las
características generales y conceptos relacionados con la espectrofotometría. A
continuación y tras la explicación del funcionamiento del espectrofotómetro se harán
espectros de absorción con el fin de determinar la longitud de onda donde la muestra
presenta la máxima absorción, y tras realizar las correspondientes rectas de calibrado se
cuantificarán las concentraciones de distintas biomoléculas.

El análisis bioquímico de sustancias contenidas en sangre, tejidos, orina, alimentos, entre


otros en la mayoría de los casos requiere del uso de la técnica espectrofotométrica, la cual
relaciona la intensidad del color de una solución con la concentración de la sustancia
coloreada.

Todo método espectrofotométrico se basa en la comparación de la absorbancia de una


sustancia de concentración desconocida con la de una solución de la misma sustancia cuya
concentración se conoce y a la cual se denomina solución patrón o estándar.

La absorbancia de una solución es la resultante de la absorbancia del soluto cuya


concentración se desea conocer y la de otros componentes del sistema (solventes, reactivos)
que absorben también a esa longitud de onda. Estos compuestos se denominan
interferencias. Se debe descartar la absorbancia de las interferencias, para ello es necesario
hacer siempre una muestra que contenga todos los componentes del sistema menos aquel
que se desea medir. Esta muestra se llama blanco y la absorbancia de éste debe restarse a
las muestras problema y a los patrones, o bien, con el blanco se calibra el instrumento a
absorbancia igual a 0.
El estudio a nivel bioquímico de cualquier biomolécula requiere la utilización de técnicas
analíticas que permitan su determinación cualitativa y cuantitativa, así como su
caracterización físico-química y biológica. Uno de los métodos más sencillos, accesibles,
útiles y utilizados es la espectroscopía, en general, y la espectroscopía ultravioleta-visible,
en particular. Se pueden identificar y cuantificar biomoléculas en solución y en muestras
biológicas, con el empleo
El fundamento de la espectroscopía se debe a la capacidad de las moléculas para absorber
radiaciones, entre ellas las radiaciones dentro del espectro UV-visible. Las longitudes de
onda de las radiaciones que una molécula puede absorber y la eficiencia con la que se
absorben dependen de la estructura atómica y de las condiciones del medio (pH,
temperatura, fuerza iónica, constante dieléctrica), por lo que dicha técnica constituye un
valioso instrumento para la determinación y caracterización de biomoléculas.

Las moléculas pueden absorber energía luminosa y almacenarla en forma de energía


interna. Esto permite poner en funcionamiento ciclos vitales como la fotosíntesis en plantas
y bacterias. Cuando la luz (considerada como energía) es absorbida por una molécula se
origina un salto desde un estado energético basal o fundamental, E1, a un estado de mayor
energía (estado excitado), E2. Y sólo se absorberá la energía que permita el salto al estado
excitado. Cada molécula tiene una serie de estados excitados (o bandas) que la distingue del
resto de moléculas. Como consecuencia, la absorción que a distintas longitudes de onda
presenta una molécula -esto es, su espectro de absorción- constituye una seña de identidad
de la misma. Por último, la molécula en forma excitada libera la energía absorbida hasta el
estado energético fundamental. Figura 1

En espectroscopía el término luz no sólo se aplica a la forma visible de radiación


electromagnética, sino también a las formas UV e IR, que son invisibles. En
espectofotometría de absorbancia se utilizan las regiones del ultravioleta (UV cercano, de
195-400 nm) y el visible (400-780 nm).figura 2
Figura 2. Espectro electromagnético

La región UV se define como el rango de longitudes de onda de 195 a 400 nm. Es una
región de energía muy alta. Provoca daño al ojo humano así como quemadura común. Los
compuestos con dobles enlaces aislados, triples enlaces, enlaces peptídicos, sistemas
aromáticos, grupos carbonilos y otros heteroátomos tienen su máxima absorbancia en la
región UV, por lo que ésta es muy importante para la determinación cualitativa y
cuantitativa de compuestos orgánicos. Diversos factores -como pH, concentración de sal y
el disolvente- que alteran la carga de las moléculas, provocan desplazamientos de los
espectros UV. La fuente de radiación ultravioleta es una lámpara de deuterio. En la región
visible apreciamos el color visible de una solución y que corresponde a las longitudes de
onda de luz que transmite, no que absorbe. El color que absorbe es el complementario del
color que transmite. Por tanto, para realizar mediciones de absorción es necesario utilizar la
longitud de onda en la que absorbe luz la solución coloreada. La fuente de radiación visible
suele ser una lámpara de tungsteno y no proporciona suficiente energía por debajo de 320
nm.
Tabla 1 Absorbancias comunes.

Transmitancia y Absorbancia

Cuando un rayo de luz de una determinada longitud de onda de intensidad Io incide


perpendicularmente sobre una disolución de un compuesto químico que absorbe luz o
cromóforo, el compuesto absorberá una parte de la radiación incidente (I a) y dejará pasar el
resto (It), de forma que se cumple: Io = Ia + It

La transmitancia (T) de una sustancia en solución es la relación entre la cantidad de luz


transmitida que llega al detector una vez que ha atravesado la muestra, I t, y la cantidad de
luz que incidió sobre ella, Io, y se representa normalmente en tanto por ciento: % T = It/Io x
100 La transmitancia nos da una medida física de la relación de intensidad incidente y
transmitida al pasar por la muestra. La relación entre %T y la concentración no es lineal,
pero asume una relación logarítmica inversa.

La absorbancia (A) es un concepto más relacionado con la muestra puesto que nos indica la
cantidad de luz absorbida por la misma, y se define como el logaritmo de 1/T, en
consecuencia: A = log 1/T = -log T = -log It/ Io. Cuando la intensidad incidente y
transmitida son iguales (Io = It), la transmitancia es del 100% e indica que la muestra no
absorbe a una determinada longitud de onda, y entonces A vale log 1 = 0.
La cantidad de luz absorbida dependerá de la distancia que atraviesa la luz a través de la
solución del cromóforo y de la concentración de éste.
Ley de Lambert-Beer

Esta ley expresa la relación entre absorbancia de luz monocromática (de longitud de onda
fija) y concentración de un cromóforo en solución:

A = log I/Io = ε·c·l

La absorbancia de una solución es directamente proporcional a su concentración –a mayor


número de moléculas mayor interacción de la luz con ellas-; también depende de la
distancia que recorre la luz por la solución –a igual concentración, cuanto mayor distancia
recorre la luz por la muestra más moléculas se encontrará-; y por último, depende de ε, una
constante de proporcionalidad -denominada coeficiente de extinción- que es específica de
cada cromóforo. Como A es adimensional, las dimensiones de ε dependen de las de c y l.
La segunda magnitud (l) se expresa siempre en cm mientras que la primera (c) se hace,
siempre que sea posible, en M, con lo que las dimensiones de ε resultan ser M-1·cm-1. Este
coeficiente así expresado, en términos de unidades de concentración molar (o un
submúltiplo apropiado), se denomina coeficiente de extinción molar (εM). Cuando, por
desconocerse el peso molecular del soluto, la concentración de la disolución se expresa en
otras unidades distintas de M, por ejemplo g·L-1, las dimensiones de ε resultan ser
distintas, por ejemplo g-1·L·cm-1, y al coeficiente así expresado se denomina coeficiente
de extinción específico (εs).
La ley de Lambert-Beer se cumple para soluciones diluidas; para valores de c altos, ε varía
con la concentración, debido a fenómenos de dispersión de la luz, agregación de moléculas,
cambios del medio, etc.
Instrumentación para la medición de absorbancias de la luz visible y ultravioleta:
espectrofotómetro UV-visible
La medición de absorbancia de la luz por las moléculas se realiza en unos aparatos
llamados espectrofotómetros. Aunque pueden variar en diseño, en especial con la
incorporación de ordenadores para el análisis de datos, todos los espectrofotómetros
constan, según se indica en la figura, de:
1. Una fuente de energía radiante: lámpara de deuterio y tungsteno.
2. Un monocromador para la selección de radiaciones de una determinada longitud de onda:
filtros, prismas, redes de difracción.
3. Un compartimento donde se aloja un recipiente transparente (cubetas o tubos) que
contenga la muestra Pueden ser de vidrio, cuarzo o plástico transparente. Para medir en
UV se deben usar las de cuarzo o sílice fundido, porque el vidrio no transmite la radiación
UV.
4. Un detector de luz y un amplificador convertidor de las señales luminosas en señales
eléctricas.
5. Un registrador o sistema de lectura de datos.

Desde el punto de vista operativo, el primer paso es seleccionar la fuente de luz y longitud
de onda a la que se va a realizar la medida. Hay espectrofotómetros de un solo haz (con una
sola celdilla para alojar la cubeta con la muestra) y de doble haz (con dos celdillas para dos
cubetas); en nuestro caso se trabajará con los de un solo haz. Se mide primero la
absorbancia del disolvente (conocido como blanco) y al que se le asigna el valor de cero
mediante el ajuste del mando, de forma que la intensidad incidente y transmitida sean
iguales (Io= It), y por tanto la absorbancia es cero. A continuación se pone en la celdilla la
cubeta con la muestra y se lee la absorbancia de ésta. Figura 3

Figura 3. Composición de un espectrofotómetro


Obtención de un espectro de absorción

El espectro de absorción es una representación gráfica que indica cantidad de luz absorbida
(ε) a diferentes valores de λ.

A partir de una solución diluida de un compuesto, cuya absorbancia máxima entra dentro
del rango de medida del espectrofotómetro, se verá el valor de absorbancia a diferentes
longitudes de onda frente a un blanco que contenga el disolvente de la solución de la
muestra a caracterizar. A partir del espectro de absorción se obtendrá el valor de λ al que el
compuesto presenta la mayor absorbancia (λmax). Dicho λ se utilizará a la hora de hacer
determinaciones cualitativas y cuantitativas del compuesto.
El espectro de absorción de un cromóforo depende, fundamentalmente, de la estructura
química de la molécula. Figura 4

Figura 4. Absorbancias de los pigmentos fotosintéticos


Es así como las clorofilas siendo el color verde observado e las plantas, absorben luz en las
longitudes de onda del violeta, azul y también rojo. La clorofila a es una molécula de dos
partes. La primer parte es un anillo de porfirina, que funciona como la parte de absorción de
luz. Este anillo se encuentra en el interior de la membrana celular.

La estructura recuerda a la del grupo hemo, siendo un marco orgánico que apoya la función
de un metal. En la hemoglobina es un átomo de hierro, mientras que en la porfirina es un
átomo de magnesio.
El anillo de porfirina posee una propiedad similar a la del anillo del benceno, sus enlaces
dobles y simples alternantes no son más que una representación del enlace deslocalizado en
donde los electrones fluyen de manera poco unida a sus respectivos núcleos.
Cuando un fotón de luz impacta contra el anillo de porfirina, se causa una redistribución de
la densidad de electrones, los cuales al estar deslocalizados, hace que se pierdan los
electrones muy fácilmente. En otras palabras, la forma en cómo está unido el anillo de
porfirina hace que los electrones de los enlaces dobles y simples sean fáciles de arrancar, y
solo basta la energía contenida en un fotón de luz para lograr ese cometido.
El anillo de porfirina vibra con los fotones de algunas longitudes de onda, mientras que
otras simplemente pasan sin activar el sistema de emisión de electrones. Figura 5

Figura 5. Estructura de la clorofila


PROCEDIMIENTO

Procedimiento 1.

Preparación de la cromatografía en papel: Recortar una tirilla de papel filtro de 10x2cm.


Preparar un vaso de precipitados de 200 o 250mililitros conteniendo 2 a 5mililitros de
etanol (la altura del etanol en el fondo del recipiente no debe exceder los 3 milímetros).

- Obtención del extracto de hojas del material vegetal para cromatografía en papel:
Macerar el material vegetal (traer 2 hojas de material vegetal) en 5 mililitros de etanol y
una pequeña cantidad de carbonato cálcico (Tritura la mezcla hasta que las hojas se
decoloren y el disolvente adquiera un color verde intenso). Con un capilar colocar una gota
del extracto en un extremo de la tirilla de papel filtro y con la gota de extracto hacia abajo
introducir la tirilla de papel filtro hasta que toque el fondo del vaso de precipitados.

Esperar unos treinta minutos y aparecerá en la parte superior de la tira de papel unas bandas
de colores que señalan los distintos pigmentos. Al observar el papel donde hemos hecho la
cromatografía, vemos cuatro bandas o zonas, que corresponden a los distintos pigmentos
fotosintéticos presentes en las hojas de espinaca. Según su grado de solubilidad en etanol se
reconocen las bandas de Clorofila b, Clorofila a, Xantofilas y Carotenos.

Consultar los colores de cada pigmento para realizar el reconocimiento y ubicación en la


práctica. Calcular y reportar las movilidades relativas de los pigmentos usando como
referencia el frente de corrido del solvente.

- Obtención del extracto vegetal para espectrofotometría: Macerar el material vegetal


(hojas frescas) en 10 mililitros de etanol y una pequeña cantidad de carbonato cálcico
(Tritura la mezcla hasta que las hojas se decoloren y el disolvente adquiera un color verde
intenso), medir el volumen del extracto obtenido, luego realizar una filtración con algodón
para remover el material solido (debe quedar cristalino para poder realizar la medida en el
espectrofotómetro), se debe medir también el volumen de extracto después de la filtración.
Procedimiento 2
Pesar aproximadamente 2 g del material vegetal fresco y triturarlo
Adicionarle en un erlenmeyer 20 ml de etanol al 96% y someterlo a ultrasonido durante 10
minutos.
Filtrar utilizando en embudo de caña corta con una capa de algodón.
El filtrado obtenido llevarlos centrifugación a 6000 RPM durante 15 minutos.
Colocar la solución de las clorofilas en una cubeta para hacer su lectura en el
espectrofometro.

Construcción del espectro de absorción de la luz visible por fotopigmentos:

Los datos para esta grafica se obtienen al medir la absorbancia en un rango de 380 a 700nm
para el extracto vegetal filtrado a intervalos de longitud de onda de 20nm, obteniéndose la
siguiente tabla de datos.

Longitud de 380 400 420 440 460 480 500 520 540 560 580 600 620 640 660 680 700
onda
Absorbancia

Realizar una grafica de Absorbancia (y) versus Longitud de onda (x) y ubicar en las
diferentes longitudes de onda los posibles pigmentos responsables de la absorción.

Determinar la concentración de pigmentos, haciendo uso de las siguientes ecuaciones de


Lichtenthaler, (1987) desarrolló las siguientes ecuaciones para obtener la concentración de
clorofilas y carotenoides en mg/L
Preguntas de análisis

1. Cuáles son las diferencias fundamentales entre absorbancia y transmitancia


2. Que es la ley de Beer-Lambert
3. Explique el siguiente gráfico

4. Exprese las siguientes absorbancias en terminus de porcentaje de trasmitancia.


a. 0.050 b. 0.918 c. 0.379 d. 0.261 e. 0.012

5. Convierta las siguientes transmitancias en absorbancias


a. 25.5% b. 32.5% c. 0.085% d. 0.567%

6. Una solución 7.5 x10-5 M de permanganate de potasio presento una transmitancia


de 36.4%, cuando se midio en una celda de 36.4 cm y un alongitud de onda de
525nm.
a. Calcule la absorbancia de la solución
b. La absortividad molar de KMnO4
7. Cuál es la diferencia fundamental cuando se habla de que una molécula absorbe y
cuando refleja.
8. Cuáles son los pasos fundamentales que se deben seguir ene le manejo del
espectrofotometro.

REFERENCIAS:

- Boyer R. MODERN EXPERIMENTAL BIOCHEMISTRY. Third edition. 2000.


Benjamin Cummings.
- Harvey D. MODERN ANALYTICAL CHEMISTRY. 2000. McGraw-Hill.
- Holme D. &Peck H. ANALYTICAL BIOCHEMISTRY. Thirdedition. 1998. Prentice-
Hall.
- Nelson D. & Cox M. LEHNINGER PRINCIPLES OF BIOCHEMISTRY. FourthEdition.
2004. W.H.Freeman.