ANÁLISIS DE AGREGADOS

La respuesta inmune de proteínas terapéuticas da lugar a dos tipos de problemas:

1.- Relacionados con la seguridad para el paciente:

- Eventos inmunológicos adversos como choque anafiláctico, síndrome de liberación de las

citoquinas, neutralización cruzada de proteínas endógenas de funciones vitales, etc.

2. Relacionados con la eficacia del producto:

- Respuesta inmune que neutraliza la acción terapéutica de la proteína, inactivándola y

eliminando su acción.

Factores que pueden influenciar la respuesta inmune de los bioterapéuticos

Factores externos que pueden promover la formación de agregados y que forman parte del
proceso biotecnológico de producción de las proteínas terapéuticas.
Modelo esquemático de la agregación de proteínas: Tamaños

Herramientas analíticas para la determinación de agregados en función del tamaño de

partícula.

Ventajas y desventajas de DLS y SEC

Con DLS no hay resolución. Sólo nos da un intervalo en el que hay agregados.
Principales técnicas analíticas

SEC: caracterización de oligómeros normalmente empleada en el control de calidad.

Agregados grandes, normalmente de alrededor de 200 nm, taponan la columna y no pueden
ser detectados. Indica sólo la presencia de pequeños agregados.

DLS: se suelen usar a lo largo de todo el ciclo de vida de los biofármacos para medir el tamaño
y la distribución del tamaño de las proteínas en disolución. Es un método rápido y no invasivo,
sensible para la determinación de los agregados de mayor tamaño. Es muy empleado como
técnica de screening para monitorizar el estado de los oligómeros de la proteína de interés.
Pero sólo da información cualitativa, no cuantitativa ni de concentración.

Es mucho más rápida que SEC

Técnicas emergentes

NTA: Nanoparticle Tracking Analysis emplea una cámara de alta resolución digital y un
software especialmente diseñado para seguir el movimiento de las partículas en un
microscopio. Realmente lo que sigue es el movimiento Browniano mediante cual determina el
tamaño de las partículas presentes en la disolución. Genera una distribución del tamaño de
partícula con una alta resolución ya que mide el tamaño de cada partícula de forma individual
y además da valores de concentración. Pero como el índice de refracción de las proteínas es
pequeño, NTA tiene un límite de detección de 30 nm de diámetro, por lo que no se detectan
los monómeros, detecta agregados desde decenas de unidades de proteína hasta miles de
unidades, determinado tamaño y concentración.

RMN: De reciente uso, la Resonancia Magnética Nuclear. Detecta y cuenta con exactitud
partículas en el intervalo crítico de 50 nm a 5 μm, indicando de manera bastante segura la
masa flotante, la masa seca y el tamaño. Además, puede distinguir entre material proteico y
contamínate, tales como silicona, mediante la comparación de sus frecuencias resonantes
relativas y sus masas flotantes.
ANÁLISIS MEDIANTE SEC: Cromatografía líquida de alta resolución de exclusión por tamaño

Generalidades de la cromatografía líquida de alta resolución (HPLC):

a) Fundamento de la cromatografía líquida.

 La cromatografía: ¿qué es? (https://www.youtube.com/watch?v=WO0OsxaPYs8)

La cromatografía de adsorción es la forma clásica de cromatografía ideada por Tswett por

primera vez en 1903, con la que logró separar diferentes pigmentos vegetales (clorofilas).