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ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA

Pruebas de diagnóstico de virus: Inhibición


de la Hemoaglutinación y Neutralización
ASIGNATURA :

Virología

DOCENTE :

Dra. Graciela Albino Cornejo.

ALUMNO :

Rómulo Aycachi Inga.

CICLO :

2007 - I

Lambayeque, Agosto del 2007.


Pruebas de Diagnóstico de Virus: Inhibición
de la Hemoaglutinación y Neutralización
I. Introducción:

La inhibición de la hemoaglutinación se basa en la pérdida de la


capacidad hemoaglutinante de un virus al formarse el complejo antígeno-
anticuerpo. Cuando se enfrenta un virus conocido a un virus problema, estos se
unen impidiendo la hemoaglutinación viral (provocando la IHA).
Esta técnica es utilizada para tipificar (identificar) virus con capacidad
hemoaglutinante presentes en una muestra dada (virus influenza, parainfluenza,
etc.), que al unirse a los anticuerpos específicos, pierden esta propiedad.
Esto se demuestra haciendo reaccionar la mezcla de antígeno con
anticuerpo (suero del paciente) con glóbulo rojo, los que no se unen y sedimentan
formando un botón o punto; en ausencia del anticuerpo específico se expresa la
propiedad hemoaglutinante del virus, que se visualiza por la formación de una
malla de aglutinación en el tubo o pocillo en que se realiza la reacción.
Actualmente se usa principalmente en diagnóstico y caracterización de
virus influenza.
Los anticuerpos de la hemoaglutinación tienen buena correlación con los
neutralizantes en reflejar nivel de inmunidad y su relación es mas sencilla (p.ej.
sarampión, rubéola). Para realizar esta técnica previamente es necesario e
imprescindible realizar la titulación mediante la técnica de hemoaglutinación.
La neutralización viral (o reacción de neutralización) se basa en la pérdida
de la capacidad infectiva de un virus al unirse al anticuerpo específico, formando
un complejo antígeno-anticuerpo. Demuestra anticuerpos por su efecto inhibitorio
en la infectividad viral.
Este ensayo mide funciones virales específicas, por lo que es bastante
selectivo, de esta forma la neutralización viral sólo mide anticuerpos para
antígenos específicos sobre la superficie viral. Si los anticuerpos se encuentran en
el suero del paciente que se pone a incubar con una suspensión del virus, los
anticuerpos reaccionarán con los antígenos virales y cuando la suspensión se
ponga en presencia de las células permisivas al virus (en cultivo celular) el
resultado será la neutralización de la invasión celular y la no evidencia del EC.
Esta técnica se ha utilizado para el diagnóstico de las infecciones por dengue.

II. Objetivo:

• Reconocer el fenómeno de Inhibición de la hemoaglutinación utilizando


suero sanguíneo de pollo (vacunado previamente viru New Castle).
• Reconocer el fenómeno de Neutralización, mediante el uso del suero
antifago (suero sanguíneo de conejo).

III. Materiales:

Material Biológico:
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• Antígeno vírico (vacuna virus New Castle)
• Suero anti-New Castle (de los pollos vacunados previamente)
• Suspensión vírica (fago).
• Suero antifago (del conejo inmunizado previamente)
• Cepa problema
• Sangre de pollo (glóbulos rojos)

Material de Laboratorio:
• Caldo Triptosa.
• Agar Triptosa.
• Agar Agua.
• Tubos de ensayo.
• Gradillas.
• Pipetas.
• Solución salina fisiológica

IV. Procedimiento:

Inhibición de la hemoaglutinación:
• Para la prueba, primero realizamos la titulación de la HA, para lo
cual se realiza el procedimiento tal cual la practica anterior.
• Luego, preparamos el antígeno, como el título de la HA fue el del
tubo 10-4 (o sea el título es 40), entonces se deberia preparar 4ml de
antígeno (1 de ag y 3 de SSF), pero como 4 ml. no alcanzarían para
repartir en toda la bateria de tubos se preparó 1.5 ml de ag y 6 ml de
SSF.
• Luego obtenemos los glóbulos rojos lavados 0.7% (procedimiento
como en la práctica anterior).
• Luego, ponemos 9 tubos en una gradilla y rotulamos (tubo Nº 9
control).
• Al primer tubo agregamos 0.8 ml del antígeno (4u HA), o sea, la
vacuna del virus New Castle. A los demás tubos agregar 0.5 ml.
• Luego agregamos 0.2 ml del anticuerpo (suero de pollo vacunado
previamente) al primer tubo y homogenizamos (dilución 1/5).
• Luego sacamos de este primer tubo 0.5 ml y lo pasamos al tubo Nº 2
y homogenizamos (dilución 1/10).
• Realizamos lo mismo hasta el tubo Nº 8 (dilución 1/640), al tubo Nº 9
no se le agrega nada.
• Luego dejar en reposo por 30 min.
• Pasado el tiempo, agregamos a todos los tubos 0.5 ml de los
glóbulos rojos lavados (0.7%).
• Luego dejar reposar un momento y observar.
• Si hay inhibición no se observa la hemoaglutinación (formación
característica de la malla o película). El anticuerpo impide que el
antígeno se adsorba al glóbulo rojo.
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Neutralización viral:
• Diluir la suspensión viral (fago).
• Luego, en una gradilla colocamos 10 tubos y los marcarmos (1 al 9,
tubo 10 control).
• Luego, a cada uno de los tubos añadir 0.5 ml. de SSF a todos los
tubos.
• Al primero de ellos agregamos 0.5 ml. del suero antifago (suero de
conejo) y homegenizamos.
• Luego, de este tubo tomar 0.5 ml. y llevar al tubo N° 2 y así
sucesivamente hasta el tubo 9 (diluciones ½ hasta 1/512), tubo 10
no recibe suero.
• Luego, agregamos a cada tubo 0.3 ml. del fago diluido (antígeno)
• Dejar reposar al medio ambiente por 1 hora.
• Pasado el tiempo titular: cogemos de cada tubo 0.1 ml. y lo pasamos
a un tubo con Agar Agua, agreganos la cepa problema, mezclamos y
luego llevar a placas Petri (con agar triptosa). Incubar a 37°C por 24
horas.
• Hacer la lectura
• A mayor dilución mayor número de calvas y menos colonias (el
antifago impide que el virus se adsorba a la bacteria).

V. Resultados:

- En la inhibición de la hemoaglutinación no se obtuvieron datos


verdaderos y aceptables ya que el ave al que se le extrajo la sangre
(gallo) no había sido inoculado con la vacuna contra New Castle.
Aunque en la HA que se le realizó a los glóbulos rojos nos dio 10-4 (o
sea título 40) como último tubo de HA (+), no se pudo hallar la IHA.
- Con respecto a la neutralización viral se obtuvo:

Diluc. ½ = No calvas
Diluc. ¼ = 4 calvas
Diluc. 1/8 = 36 calvas
Diluc. 1/16 = 40 calvas
Diluc. 1/32 = 25 calvas
Diluc. 1/64 = 32 calvas
Diluc. 1/128 = 30 calvas
Diluc. 1/256 = 12 calvas
Control = 25 calvas

- De los resultados obtenidos se toman como verdaderos los


resultados de las diluciones hasta 1/16, ya que los demás resultados
son poco coherentes con el verdadero resultado.
- Los falsos resultados obtenidos en las últimas diluciones de pueden
deber a mala manipulación en el desarrollo de la práctica.

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VI. Conclusiones:

• Sólo se pudo reconocer el fenómeno de Neutralización, mediante el uso


de un suero antifago (no hubo resultados satisfactorios en la IHA).
• En la neutralización viral a medida que la dilución aumenta del suero
antifago, aumentará el número de calvas y disminuirá el número de
colonias ya que el antifago impide que el virus se adsorba a la bacteria.

VII. Referencias:

- ARBIZA, J. y colb. (2005). Curso de Microbiología: Módulo de Virología


Práctico 2005. Universidad Politécnica Andrés Bello. Santa Fe de Bogotá.
- CRESPO, María del Pilar (2004) El diagnóstico viral por laboratorio. Clínica
Fundación Valle del Lili. Cali.
- Artículos varios. Diagnóstico Viral. Versión de Lufi 2004. PDF.

Anexos:

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RESULTADOS DEL NUMERO DE PLACAS RESULTANTES POR LOS EFECTOS
DE LA NEUTRALIZACION EN CADA UNA DE LAS PLACAS DE TITULACION

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