ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA

Pruebas de diagnóstico de virus: Inhibición de la Hemoaglutinación y Neutralización
ASIGNATURA : Virología DOCENTE : Dra. Graciela Albino Cornejo. ALUMNO : Rómulo Aycachi Inga. CICLO : 2007 - I

Lambayeque, Agosto del 2007.

Pruebas de Diagnóstico de Virus: Inhibición de la Hemoaglutinación y Neutralización
I. Introducción: La inhibición de la hemoaglutinación se basa en la pérdida de la capacidad hemoaglutinante de un virus al formarse el complejo antígenoanticuerpo. Cuando se enfrenta un virus conocido a un virus problema, estos se unen impidiendo la hemoaglutinación viral (provocando la IHA). Esta técnica es utilizada para tipificar (identificar) virus con capacidad hemoaglutinante presentes en una muestra dada (virus influenza, parainfluenza, etc.), que al unirse a los anticuerpos específicos, pierden esta propiedad. Esto se demuestra haciendo reaccionar la mezcla de antígeno con anticuerpo (suero del paciente) con glóbulo rojo, los que no se unen y sedimentan formando un botón o punto; en ausencia del anticuerpo específico se expresa la propiedad hemoaglutinante del virus, que se visualiza por la formación de una malla de aglutinación en el tubo o pocillo en que se realiza la reacción. Actualmente se usa principalmente en diagnóstico y caracterización de virus influenza. Los anticuerpos de la hemoaglutinación tienen buena correlación con los neutralizantes en reflejar nivel de inmunidad y su relación es mas sencilla (p.ej. sarampión, rubéola). Para realizar esta técnica previamente es necesario e imprescindible realizar la titulación mediante la técnica de hemoaglutinación. La neutralización viral (o reacción de neutralización) se basa en la pérdida de la capacidad infectiva de un virus al unirse al anticuerpo específico, formando un complejo antígeno-anticuerpo. Demuestra anticuerpos por su efecto inhibitorio en la infectividad viral. Este ensayo mide funciones virales específicas, por lo que es bastante selectivo, de esta forma la neutralización viral sólo mide anticuerpos para antígenos específicos sobre la superficie viral. Si los anticuerpos se encuentran en el suero del paciente que se pone a incubar con una suspensión del virus, los anticuerpos reaccionarán con los antígenos virales y cuando la suspensión se ponga en presencia de las células permisivas al virus (en cultivo celular) el resultado será la neutralización de la invasión celular y la no evidencia del EC. Esta técnica se ha utilizado para el diagnóstico de las infecciones por dengue. II. • • Objetivo: Reconocer el fenómeno de Inhibición de la hemoaglutinación utilizando suero sanguíneo de pollo (vacunado previamente viru New Castle). Reconocer el fenómeno de Neutralización, mediante el uso del suero antifago (suero sanguíneo de conejo). Materiales: Material Biológico: 2

III.

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Antígeno vírico (vacuna virus New Castle) Suero anti-New Castle (de los pollos vacunados previamente) Suspensión vírica (fago). Suero antifago (del conejo inmunizado previamente) Cepa problema Sangre de pollo (glóbulos rojos)

Material de Laboratorio: • Caldo Triptosa. • Agar Triptosa. • Agar Agua. • Tubos de ensayo. • Gradillas. • Pipetas. • Solución salina fisiológica IV. Procedimiento: Inhibición de la hemoaglutinación: • Para la prueba, primero realizamos la titulación de la HA, para lo cual se realiza el procedimiento tal cual la practica anterior. • Luego, preparamos el antígeno, como el título de la HA fue el del tubo 10-4 (o sea el título es 40), entonces se deberia preparar 4ml de antígeno (1 de ag y 3 de SSF), pero como 4 ml. no alcanzarían para repartir en toda la bateria de tubos se preparó 1.5 ml de ag y 6 ml de SSF. • Luego obtenemos los glóbulos rojos lavados 0.7% (procedimiento como en la práctica anterior). • Luego, ponemos 9 tubos en una gradilla y rotulamos (tubo Nº 9 control). • Al primer tubo agregamos 0.8 ml del antígeno (4u HA), o sea, la vacuna del virus New Castle. A los demás tubos agregar 0.5 ml. • Luego agregamos 0.2 ml del anticuerpo (suero de pollo vacunado previamente) al primer tubo y homogenizamos (dilución 1/5). • Luego sacamos de este primer tubo 0.5 ml y lo pasamos al tubo Nº 2 y homogenizamos (dilución 1/10). • Realizamos lo mismo hasta el tubo Nº 8 (dilución 1/640), al tubo Nº 9 no se le agrega nada. • Luego dejar en reposo por 30 min. • Pasado el tiempo, agregamos a todos los tubos 0.5 ml de los glóbulos rojos lavados (0.7%). • Luego dejar reposar un momento y observar. • Si hay inhibición no se observa la hemoaglutinación (formación característica de la malla o película). El anticuerpo impide que el antígeno se adsorba al glóbulo rojo. 3

Neutralización viral: • Diluir la suspensión viral (fago). • Luego, en una gradilla colocamos 10 tubos y los marcarmos (1 al 9, tubo 10 control). • Luego, a cada uno de los tubos añadir 0.5 ml. de SSF a todos los tubos. • Al primero de ellos agregamos 0.5 ml. del suero antifago (suero de conejo) y homegenizamos. • Luego, de este tubo tomar 0.5 ml. y llevar al tubo N° 2 y así sucesivamente hasta el tubo 9 (diluciones ½ hasta 1/512), tubo 10 no recibe suero. • Luego, agregamos a cada tubo 0.3 ml. del fago diluido (antígeno) • Dejar reposar al medio ambiente por 1 hora. • Pasado el tiempo titular: cogemos de cada tubo 0.1 ml. y lo pasamos a un tubo con Agar Agua, agreganos la cepa problema, mezclamos y luego llevar a placas Petri (con agar triptosa). Incubar a 37°C por 24 horas. • Hacer la lectura • A mayor dilución mayor número de calvas y menos colonias (el antifago impide que el virus se adsorba a la bacteria). V. Resultados: En la inhibición de la hemoaglutinación no se obtuvieron datos verdaderos y aceptables ya que el ave al que se le extrajo la sangre (gallo) no había sido inoculado con la vacuna contra New Castle. Aunque en la HA que se le realizó a los glóbulos rojos nos dio 10-4 (o sea título 40) como último tubo de HA (+), no se pudo hallar la IHA. Con respecto a la neutralización viral se obtuvo: Diluc. ½ Diluc. ¼ Diluc. 1/8 Diluc. 1/16 Diluc. 1/32 Diluc. 1/64 Diluc. 1/128 Diluc. 1/256 Control = = = = = = = = = No calvas 4 calvas 36 calvas 40 calvas 25 calvas 32 calvas 30 calvas 12 calvas 25 calvas

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De los resultados obtenidos se toman como verdaderos los resultados de las diluciones hasta 1/16, ya que los demás resultados son poco coherentes con el verdadero resultado. Los falsos resultados obtenidos en las últimas diluciones de pueden deber a mala manipulación en el desarrollo de la práctica. 4

VI. • •

Conclusiones: Sólo se pudo reconocer el fenómeno de Neutralización, mediante el uso de un suero antifago (no hubo resultados satisfactorios en la IHA). En la neutralización viral a medida que la dilución aumenta del suero antifago, aumentará el número de calvas y disminuirá el número de colonias ya que el antifago impide que el virus se adsorba a la bacteria. Referencias: ARBIZA, J. y colb. (2005). Curso de Microbiología: Módulo de Virología Práctico 2005. Universidad Politécnica Andrés Bello. Santa Fe de Bogotá. CRESPO, María del Pilar (2004) El diagnóstico viral por laboratorio. Clínica Fundación Valle del Lili. Cali. Artículos varios. Diagnóstico Viral. Versión de Lufi 2004. PDF.

VII. -

Anexos:

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RESULTADOS DEL NUMERO DE PLACAS RESULTANTES POR LOS EFECTOS DE LA NEUTRALIZACION EN CADA UNA DE LAS PLACAS DE TITULACION

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