UNIVERSIDAD NACIONAL PEDRO RUIZ GALLO

FACULTAD DE CIENCIAS BIOLOGICAS

ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGIA CON ESPECIALIDAD EN

MICROBIOLOGÍA Y PARASITOLOGÍA

RECUENTO DE CLOSTRIDIOS SULFITO REDUCTORES

DE AGUAS DE POZOS: MÉTODO DE LOS TUBOS
MÚLTIPLES

INFORME
Práctica N° 7

INTEGRANTES: GRUPO 11

Moreno Tafur Carlos

Sandoval Flores José

Diaz Valdera Alex

Infante Requejo Cesar

DOCENTE

Dra. Olga Francia Arana

Lambayeque – Perú

2020
 PRACTICA N° 7

RECUENTO DE CLOSTRIDIOS SULFITO REDUCTORES DE AGUAS DE

POZOS: MÉTODO DE LOS TUBOS MÚLTIPLES

I. Introducción
Los clostridios sulfito reductores son aquellas bacterias de morfología bacilar, gran
positivos, anaerobias estrictas, formadores de esporas y con capacidad de reducir el sulfito
a sulfuro. Se encuentra normalmente en las heces, aunque en un numero mucho más
reducido que E. coli. Las especies del género Clostridium tienen una supervivencia más
alta que cualquier otro indicador bacteriano de contaminación fecal, y esto se debe a la
capacidad formadora de esporas, por lo que resiste a gran temperatura a comparación de
otras bacterias. El origen fecal de la contaminación se evidencia coliformes y clostridium,
sin embargo, si solo se detectara clostridium indicaría una contaminación fecal remota
(UTEC, 2020).
Sin embargo, el origen de los anaerobios sulfito reductores no es exclusivamente fecal,
ya que pueden proceder de otras fuentes ambientales como suelo, sedimentos marinos,
vegetación en descomposición, heridas infectadas de hombre y animales, aguas
superficiales, como también en los alimentos, especialmente cuando las condiciones de
higiene en la elaboración son deficientes, son deteriorantes, ya que producen malos
olores. Uno de los microorganismos patógenos para el hombre es Clostridium
perfringens, el cual la intoxicación por esta bacteria, se manifiesta por nauseas dolor
abdominal, diarrea y vomito. Debido a que las células vegetativas ingeridas resisten la
acidez del estómago, pasan al intestino delgado donde crecen y esporulan y liberan una
enterotoxina de naturaleza proteica asociada a la envoltura de la espora que en ocasiones
son resistentes al calor hasta 100 °C durante 1 hora. (Salinas, Valle, Sevilla y Huamán
2013, pág. 1-5).

II. Objetivos
2.1. Objetivo general
• Hacer el recuento de colonias de clostridios sulfito reductores

2.2. Objetivos específicos

• Aprender a utilizar el método de los tubos múltiples

III. Fundamento teórico

El método de cuantificación de bacterias en agua es el de “Tubos Múltiples”,
identificando corrientemente como NMP (número más probable), siendo un valor
probabilístico de la cantidad de bacterias en 100 ml de agua y que, para la determinación
de anaerobiosis de sulfito reductores de agua, la cual esta descrita en la norma
internacional ISO 6461 (ISO, 1986).
El método de NMP, si bien da un valor aproximado sobre la cantidad de bacterias
presentes en la muestra, corresponde a la técnica usualmente empleada para la detección
de coliformes en agua, sin embargo, llevada a cabo para la cuantificación de clostridios
sulfitoreductores. Esta técnica se basa en contar el número de colonias de bacterias
esporuladas u con capacidad sulfito reductora desarrolladas en medio de cultivo solido
glucosado con sulfito sódico y una sal de hierro (Campuzano, Mejía, Madero y Pabón
2015, Pág. 85-90).
Las especies del género Clostridium tienen supervivencia mucho mayor que cualquier
otro indicador bacteriano de contaminación fecal, debido a su capacidad formadora de
esporas, por lo que resiste a gran temperatura a comparación de otras bacterias (Silva,
Ramírez, Alfieri, Rivas y Sánchez 2004, pag.46-47).
Sus esporas son resistentes al calor, a los procesos de desinfección y a los tratamientos de
depuración habituales de las aguas (cloración), por lo que su supervivencia en agua
esmayor. La diferenciación de C. perfringens de otras especies de Clostridium, se basa en
su capacidad de fermentar la sacarosa con producción de ácido, en su incapacidad de
fermentar la celobiosa (debido a la ausencia de β-D-glucosidasa) y en la producción de
fosfatasa ácida (Warek 2014, pág. 17-18).
Si se evidencian simultáneamente coliformes y Clostridium es evidente el origen fecal de
la contaminación. Si solo se detectaran Clostridium indicaría una contaminación remota
(Gesche, Vallejos y Saez 2003, pág. 100-101).

IV. Materiales y Métodos

Los materiales y métodos fueron extraídos del trabajo realizado por Hernández
L. (2015)

4.1. Materiales
❖ Muestra de agua obtenida de un pozo (agua cristalina, extraída de un
pozo abierto cubierto con plásticos y a su alrededor se encontraron
animales de granja y en el fondo de residuos de pajas.)

❖ Medios de cultivo:
• 2 tubos con caldo diferencial para Clostridios sulfato
reductores de doble concentrado.

• 4 tubos con caldo diferencial para Clostridios sulfato

reductores de simple concentrado.

❖ Tubos de ensayo con tapa de rosca de 150 x 15 mm

 Se utilizó para el transporte y el cultivo de la muestra

❖ Estufa: Son utilizadas para la incubación de los microorganismos

facilitando su desarrollo. Su temperatura está calibrada en 35 – 37ºC.

❖ Pipetas (10 ml y 1 ml): utilizado para medir o transvasar pequeños

volúmenes de líquido de un recipiente a otro, con
gran exactitud.
❖ Frascos de vidrio: Se utilizó para recolección de la muestra.

❖ Gradilla: Son los elementos que se utilizan para colocar tubos de

ensayo en posición vertical.
❖ Mascarilla: Es un dispositivo diseñado para proteger al portador de la
inhalación atmósferas peligrosas.
❖ Guantes: Sirve para proteger de sustancias dañinas.
❖ Baño María: Se utilizó para calentar la muestra, uniforme y
lentamente, sumergiendo el recipiente que la contiene en otro mayor
con agua que se lleva a ebullición.
❖ Láminas portaobjetos, coloración Gram y microscopio: Utilizados
para la identificación microscópica de Clostridios sulfatos

4.2. Metodología

La persona encargada
de tomar las
Recolección de las
muestras del agua
muestras del pozo para el
aislamiento de
Clostridios sulfatos
tendrá que vestir
correctamente

Preparación de la
muestra
PRUEBA PRESUNTIVA PARA CLOSTRIDIOS
SULFITO REDUCTORES
1.Se aplicará el
método de los tubos
múltiples, realizando
la serie de dos tubos.
4. Finalmente tomar 0.1 ml y
colocarlo en los dos 2 tubos con
caldo diferencial para Clostridios
sulfatos reductores en
concentración simple.
5. Incubar en
anaerobiosis por 24 – 48
horas
Homogenizar la muestra
(agitar 25 veces la
muestra de agua antes
de utilizarla).
2. Primero tomar 10
ml de la muestra y
colocarlo en 2 tubos
con caldo diferencial
para Clostridios
sulfito reductores en
concentración doble.
3. Tomar 1ml de la
muestra y colocarlo en
los dos 2 tubos con
caldo diferencial para
Clostridios sulfito
reductores en
concentración simple.
6. Lectura:
Precipitado negro
(Positividad de la
prueba)
 PRUEBA CONFIRMATIVA

De los tubos positivos, con

formación de precipitado negro,
sembrar tres asadas de cada uno
en un tubo con leche tornasolada

Incubar en anaerobiosis
por 24 – 48 horas.

Lectura:

Producción de gas

Coagulación

Fermentación.

Se observa presencia de gas,

fermentación y coagulación,
confirmando la presencia de
Clostridios.

Al realizar una tinción Gram a los tubos

positivos se pudo observar Clostridium
Perfringens
V. Resultados e interpretación

5.1. Resultados
Cuadro obtenido del trabajo realizado por Salinas, Valle, Sevilla y
Huamán, (2013)

Ensayo Muestra Factor de Recuento de

dilución colonias

10-1 10

Clostirdium Agua 10-2 7

sulfito- procedente de
un pozo de
reductores
granja 10-3 4

5.2. Interpretación
Según el Reglamento de la Calidad de Agua para el Consumo Humano de
BSN°0312010SA, Dirección General de Salud Ambiental, Ministerio de
Salud, LimaPerú-2011, estipula que, al realizar un recuento de bacterias
sulfito reductoras, no deben encontrarse presentes en el agua para el
consumo de la población, según los resultados obtenidos en esta agua de
pozo hay presencia de bacterias sulfitoreductores en las 3 series de tubos
por lo tanto esta agua no es apta para consumo humano.

VI. Conclusiones
Se determinó la presencia de clostridos sulfitoreductores en agua de pozo, y que
el número de estos no están dentro de los permitidos por la norma técnica por lo
tanto la calidad de esta agua no es apta para consumo humano ya que está
contaminada con sulfitorreductores los cuales están asociados a cuadros de
intoxicación o infección intestinal.

Los Clostridios sulfito reductores sirven como indicadores de contaminación fecal

en un plazo mediano, ya que resisten por más tiempo en el ambiente que los
coliformes y Escherichia coli, por ello es importante su detección en aguas de
consumo humano para prevenir infecciones en el humano.
 El método del recuento de Clostridios sulfito reductores es el adecuado para
evaluar Clostridium el cual es un Anaerobio estricto y siendo los pozos ambientes
anaerobios se necesita para su detección de una incubación en anaerobiosis para
que puedan crecer, además de la alta temperatura a la que debe ser sometido para
que se elimine la forma vegetativa.

Como esta bacteria está ampliamente distribuida en la naturaleza y se halla en la

tierra, en las aguas, en el polvo, y en el tracto intestinal de las personas y de los
animales; por lo tanto, podría haber llegado a las aguas directamente desde los
animales, por pozos ciegos, o incluso por el polvo. Además, por tratarse de un
microorganismo que forma esporas es capaz de soportar condiciones adversas
como la desecación y calentamiento.

VII. Recomendaciones
Se recomienda observar los tubos a las 24, 48 y 72 horas debido a que los
microorganismos pueden producir a partir de las 24 horas ácido sulfhídrico
tornando el medio de cultivo de color negro impidiendo así su lectura.

Hacer de conocimiento a las autoridades locales de salud pública los resultados

obtenidos para que se encarguen de la inspección y desinfección de estos pozos.

Construir pozos ciegos separados de los pozos y evitar la presencia de ganado

cerca a estos para así evitar contaminación del agua por infiltración.

VIII. Referencias bibliográficas

Anonymous. (1986). ISO 6461-Water quality-detection and enumeration of the

spores of sulfite-reducing anaerobes (clostridia), Part 1–method by

enrichment in a liquid medium. Recuperado de:

https://www.iso.org/standard/12818.html

Gesche, E., Vallejos, A., y Sáez, M. (2003). Eficiencia de Anaerobios sulfito-

reductores como indicadores de calidad sanitaria de agua. Método de

Número Más Probable (NMP). Archivos de medicina veterinaria, 35(1),

99-107. Recuperado de:

https://scielo.conicyt.cl/scielo.php?script=sci_arttext&pid=S0301-

732X2003000100011

Miranda, C. (s.f). Clostridium perfringens: Infecciones de Piel y Tejidos Blandos.

SEIMC, 1-10.
 https://www.seimc.org/contenidos/ccs/revisionestematicas/bacteriologia/

Clostper.pdf

Silva, J., Ramírez, L., Alfieri, A., Rivas, G., y Sánchez, M. (2004). Determinación

de microorganismos indicadores de calidad sanitaria. Coliformes totales,

coliformes fecales y aerobios mesófilos en agua potable envasada y

distribuida en San Diego, estado Carabobo, Venezuela. Revista de la

Sociedad Venezolana de Microbiología, 24(1-2), 46-49. Recuperado de:

http://ve.scielo.org/scielo.php?pid=S1315-

25562004000100008&script=sci_arttext

Salinas, P., Valles, M., Sevilla, W., y Huamán, A. (2013). Clostridium perfringens

sulfito reductores en hamburguesas que se comercializan en mercados de

la ciudad de Trujillo, Perú. REBIOL, 33(1). Recuperado de:

https://revistas.unitru.edu.pe/index.php/facccbiol/article/view/170

Warek, Z. (2014, Julio 17). Análisis microbiológico del agua. [Diapositivas de

PowerPoint]. Recuperado

de: https://www.upct.es/~minaeees/analisis_microbiologico_aguas.pdf

Campuzano, S., Mejía, D., Madero, C., y Pabón, P. (2015). Determinación de la

calidad microbiológica y sanitaria de alimentos preparados vendidos en la

vía pública de la ciudad de Bogotá D.C. Nova, 13(23), 81-92.

https://doi.org/10.22490/24629448.1708 Recuperado de:

https://hemeroteca.unad.edu.co/index.php/nova/article/view/1708

Hernández, L. (2015). Clostridios sulfitoreductores. Microbiología Acuática.

Recuperado de: https://es.scribd.com/document/279987274/Recuento-

de-Clostridios-Sulfito-Reductores-Acuatica
 Scharlab The Lab Sourcing Group. (28 de abril de 2019). Scharlau :: Análisis de

aguas [Archivo de Video]. YouTube.

https://www.youtube.com/watch?v=mEeQNAZzjmQ

UTEC Contenidos. (28 de abril de 2020). Análisis Microbiológico -

Microorganismos patógenos del agua. [Archivo de Video]. YouTube.

https://www.youtube.com/watch?v=DW1Jnj43ij8

IX. Anexos
9.1. ¿Por qué es importante el análisis microbiológico de sulfitoreductores
en aguas?
Es importante porque las enfermedades principalmente se dan por el
consumo de agua, constituyendo un 60% enfermedades diarreicas por
consumo de agua sin tratamiento y el análisis microbiológico, ayuda a
prevenirlos basándose en la normativa legal de los parámetros
microbiológicos para el consumo de agua, lo cual indica que debe estar
libre de clostridios.

Otra importancia que hay que destacar es la resistencia al calor que

tienen los clostridios, debido a que estas forman esporas y son
indicadores de la contaminación fecal, el microorganismo más
representativo es Clostridium perfringes, siendo uno de los segundos
patógenos a aparte de E. coli, en provocar el 30% de enfermedades
diarreicas en la población del Perú, por lo tanto, su estudio así como el de
otras bacterias en el agua son importantes debido a que son indicadores
de la contaminación fecal.

9.2. ¿Qué características de cultivo y de morfología microscópica le

permite reconocer a este grupo de bacterias?
Son bacilos que pueden variar desde bacilos cocoides, cortos a largos
bacilos filamentosos. Son anaerobios y esporulados en los cuales las
esporas pueden tener forma oval o esférica y aparecer en situación terminal
o subterminal, la mayoría son móviles gracias a sus flagelos periticos, son
grampositivos en cultivos jóvenes, pero se decoloran con gran facilidad en
cultivos envejecidos, pueden aparecer sueltos, en parejas o en cadenas. El
tamaño y forma de la colonia es variable; provocan hemólisis en el agar
sangre. Algunas especies como Clostridium perfringes causan
 fermentación tormentosa en la leche tornasolada otras como Clostridium
tetani puede aparecer como gramnegativo después de la formación de
esporas. Algunas especies son sacarolíticas (fermentación de la glucosa),
otras proteolíticas (hidrólisis de la gelatina) y otras pueden tener ambas
características. Algunas especies producen lecitinasa o lipasa que pueden
demostrarse en agar yema de huevo.

9.3. Con relación a los sulfitoreductores, ¿Qué método de análisis

microbiológico es el más indicado para determinar la calidad del
agua de su consumo?
El método ISO 14189:2017 es el mas eficaz debido a las ventajas que
posee con respecto a los anteriores métodos ya estudiados, como NMP,
presencia-ausencia, debido a que este método se basa en la inclusión en
masa de la muestra completa (50-100 ml de agua) y no hay necesidad de
filtración de membrana, por tanto no se estresa a los microorganismos
diana, para su posterior recuento en placa, ya que este novedoso método
tanto como el TSC-Agar como SPS-Agar, tienen añadido hidragar.

Otra ventaja de este método en la no necesidad de generar y controlar

atmosferas de anaerobiosis, ya que gracias al diseño especial que posee, el
crecimiento de colonias se hace en un vacío sin aire, en una bolsa rígida,
hermética y con tapón a rosca, en lugar de placa Petri.

Otras de las ventajas es que las colonias negras no viran a blanquecino,

cuando contactan con el aire tras la incubación, siendo este método un
ahorrador de falsos negativos.
El método ISO 14189:2017 publicado en el 2018, es el
método mas utilizado en Madrid, España