UNIVERSIDAD NACIONAL JORGE BASADRE GROHMANN

ESCUELA PROFESIONAL DE BIOLOGÍA Y MICROBIOLOGíA

PRACTICA N° 3: CULTIVO Y SIEMBRA FUNGICA

I. Fundamento teórico:

Para el aislamiento primario de los hongos, se utilizan diversos medios de cultivo. Estos
medios se deben seleccionar en función del hongo que se sospeche y del tipo de
muestra. Si la muestra procede de una zona con flora mixta, se deben utilizar medios
que contengan inhibidores como cloranfenicol o estreptomicina para inhibir el desarrollo
bacteriano y cicloheximide, rosa de bengala o dicloran para inhibir el desarrollo de
hongos de rápido crecimiento.

Medio de cultivo.- es toda preparación artificial, sólida, semisólida o líquida que

suministra al microorganismo cada una de las sustancias fundamentales, una fuente de
energía y condiciones ambientales adecuadas para la síntesis y mantenimiento de su
protoplasma.
Son mezclas de sustancias que se usan para el aislamiento y desarrollo de hongos. El
medio de cultivo sustituye parcialmente las propiedades nutricionales del hospedante o
sustrato natural del hongo por cultivar.

Cultivo: son las poblaciones de microorganismos que se obtienen en los medios de

cultivo. La mayoría de hongos fitopatógenos se pueden cultivar de manera sencilla en
medios adecuados. Sin embargo, existen grupos de patógenos denominados parásitos
obligados cuyo cultivo aún no se ha logrado.
Los cultivos pueden ser:
a)puros o axénicos, cuando la población está constituida por una única clase de
microorganismos.
b)mixtos, cuando la población está constituida por más de una clase de
microorganismos.
Siembra: Es el procedimiento que consiste en acondicionar un microorganismo a un
medio de cultivo fértil, de acuerdo a sus exigencias vitales, para que, en condiciones
óptimas de temperatura y tiempo de incubación, pueda desarrollar y multiplicarse in
vitro. Se siembra con dos finalidades: para hacer aislamiento y trasplante.
Aislamiento: permite la separación de los microorganismos al estado de pureza a
partir de una muestra problema.
Trasplante: Significa la separación primaria del hongo a un medio de cultivo apropiado
en tubo.
Tipos de siembra: Los tipos de siembra varían de acuerdo al fin y el tipo de muestra y
pueden ser: Siembra en superficie, en estrías por agotamiento, por diseminación
(extensión en superficie), por diluciones sucesivas, espontanea o sedimentación en
placa.

I. Objetivos:
- Adiestrar al estudiante en la ejecución de los tipos de siembra para el aislamiento y
recuento de hongos de muestras diversas.
III. Materiales:
- Muestra: Alimentos con micelio (tomate, fresa, papa, con presencia de micelio),
suelo rizosférico, chicha de jora, leche etc.
- 10 placas con Agar PDA mas cloranfenicol
- 08 placas PDA mas rosa de bengala (50 mg/L) y estreptomicina (48 mg/L)
- 02 matraces con 90 ml de solución salina estéril
- 01 matraz con 99 ml de solución salina estéril.
- 01 matraz con 99 ml de solución salina fisiológica estéril
- 01 matraz con agua destilada estéril
- 01 sacabocado de 0,5 cm de diámetro.
- Asa de siembra dispuesta en aguja, ángulo recto y en aro.
- Espatula de Drigalsky estéril
- Mechero.

IV. Procedimiento:

1.Siembra por colocación superficie

a) fruto o producto alimenticio con signo de micelio visible

 Cortar un pedazo de micelio, con un asa en ángulo recto y colocar en el
centro de la superficie del medio PDA más cloranfenicol, en condiciones
asépticas.
 Rotular las placas: muestra, fecha de siembra y grupo.
 Incubar a 25 °C hasta su completo desarrollo (aprox. 7 dias).
 Observar si hay crecimiento a partir del segundo día de la incubación.
Cuando la colonia haya desarrollado, exponer a la luz para su fructificación.
 Repicar en viales para su conservación. Cortar un pedazo de cultivo del borde
de la colonia y depositar en el centro del agar PDA dispuesto en viales y
tubos. Incubar a 25 ºC hasta su completo desarrollo y guardar en refrigeración
a 4ºC.
b) Cuando se trata de órganos suculentos con pudrición o alimentos
particulados como granos con síntoma de enfermedad (manchado)
 Cortar un pedazo de la zona de avance de la enfermedad y desinfectar
colocándolo en una solución de hipoclorito de sodio al 2% durante 1 minuto.
Enjuagar en agua destilada estéril por tres veces consecutivas y dejar secar
colocándolo sobre papel toalla.
 Colocar un grano o pedazo de muestra de la zona de avance en 4 zonas
equidistantes de la superficie del agar PDA con cloranfenicol .
 Rotular e incubar a 25ºC hasta su completo desarrollo.
 Repicar en viales para su conservación

2. Siembra en estrías por agotamiento

 Colocar 1 ml de leche fresca y 99 ml de agua destilada estéril en un matraz y
mezclar por agitación suave del matraz.
  Depositar una asada del inóculo en un margen del agar PDA más antibiótico y
distribuir el inóculo haciendo estrías paralelas con la ayuda de un asa de
Kolle en tres sectores.
 Rotular e incubar a 25 ºC hasta su completo desarrollo.
 Elegir la colonia más aislada y sembrar en PDA para obtener un cultivo puro.
Incubar hasta su desarrollo.
 Repicar en PDA en viales para su conservación.

3. Siembra por diseminación (por extensión en superficie)

 Colocar 1 ml de leche fresca y 99 ml de agua destilada estéril en un matraz y
mezclar por agitación suave del matraz.
 Depositar en la superficie del agar papa dextrosa más cloranfenicol, 0.1 ml de
esta dilución.
 Extender sobre toda la superficie del medio de cultivo usando la espátula de
drigalsky estéril. La distribución debe ser uniforme, evitando pasar 2 veces
por el mismo plano.
 Esperar 3 minutos a que seque el inóculo
 Rotular e incubar a 25 ºC por una semana.
 Elegir la colonia más aislada y sembrar en PDA para obtener un cultivo puro.
Incubar hasta su desarrollo.
 Repicar en PDA en viales para su conservación.

4. Siembra por diluciones sucesivas para recuento de hongos

 Adicionar 10 g de la muestra (suelo rizosférico, chicha de jora) en un matraz
con 90 ml de solución salina (NaCl 0,85%) y mezclar por agitación suave.
Corresponde a la dilución 10-1
 Disponer en una gradilla una serie de 4 tubos con 9 ml de solución salina
estéril.
 De la dilución 10 -1 transferir 1 ml al primer tubo, se mezcla por agitación
suave del tubo y se obtiene la dilución 10 -2.
 De la misma manera prepare diluciones hasta 10-5
 Coloque 0,1 ml de la dilución 10-5 en el centro de la superficie del medio de
cultivo (PDA más rosa de bengala y estreptomicina) por duplicado.
 Extender el inóculo en forma uniforme con una espátula de Drigalsky estéril,
por toda la superficie del medio de cultivo.
 Repetir lo mismo con la dilución 10-4
 Rotular e incubar las placas a 25ºC por 1 semana. Evaluar desde el segundo
día de la incubación.
 Realizar el recuento del número de colonias (en aquellas placas que
contengan entre 30 y 300 colonias) y reporta como unidades formadoras de
colonias (UFC)/g de suelo.
 Cálculo: Recuento de hongos (UFC/g) = Nº de colonias contadas x factor de
dilución x 10
 5. Siembra por sedimentación en placa (siembra espontánea)
 Elija un ambiente y coloque una placa con medio PDA más antibiótico, abierta,
sobre una mesa, a una distancia de 1 metro a metro y medio del suelo; por un
lapso de 5 a 30 minutos.
 Cerrar la placa de Petri y rotular: Ambiente, fecha, tiempo de exposición,
grupo.
 Incubar a 25°C por 1semana.
 Aislar en cultivo puro cada una de las colonias crecidas.
 Repicar en PDA en viales para su conservación.

V. Resultados
Esquematizar el crecimiento de cada uno de los tipos de siembra

VI. Discusión de resultados

Contrastar los resultados con los obtenidos por información teórica.
VII. Conclusiones
VIII. Bibliografía
Cuestionario
1. ¿Cuáles son los límites críticos para calificar la calidad ambiental en las salas de
UCI del hospital, sala de trabajo de industrias alimentarias y dormitorios?
2. Con que finalidad se usa el hipoclorito de sodio durante el aislamiento de hongos
fitopatógenos.
3. ¿Cómo se obtiene un cultivo puro?
4. ¿Cuál es el fundamento de la técnica de siembra por diluciones sucesivas?