Ingeniería ambiental

MICROBIOLOGIA
Profesor: M. I. Jesús Miguel
Castro Montoya
“Reporte de practica”
UNIDAD 2
Entrega: 27/03/2023
Alumno: Valenzuela Castro
Vanesa Noemy

Práctica 3. Obtención de cultivos puros a partir de cultivos mixtos

utilizando diversas técnicas de aislamiento
Competencia general
 Obtiene cultivos puros a partir de poblaciones mixtas, utilizando técnicas
adecuadas de aislamiento y transferencia. Competencias específicas
 Prepara el área de trabajo y evita contaminación, mediante la aplicación de
la técnica adecuada. Selecciona las técnicas de siembra adecuadas para
alcanzar un objetivo específico.
 Obtiene cultivos puros transfiriendo colonias aisladas por estría cruzada y
diseminación con varilla acodada.
Competencias transversales
 Organiza el material para su fácil identificación y manejo.
 Genera informes de experimentos realizados a partir de la búsqueda,
procesamiento y análisis de información procedente de diversas
fuentes.
Actitudes y valores
 Sustenta una postura personal sobre el tema, considerando otros puntos de
vista de manera crítica y reflexiva.
 Respeta a sus compañeros y las normas del laboratorio.
Antecedentes teóricos
El cultivo de microorganismos consiste en proporcionar a éstos, las condiciones
físicas, químicas y nutricionales adecuadas para su multiplicación de manera
controlada. El cultivo se inicia con la siembra o inoculación del microorganismo
(inóculo) en un medio de cultivo adecuado e incubado a una temperatura
adecuada para el crecimiento de los microorganismos. La siembra puede
realizarse en medio líquido, sólido o semisólido, utilizando punta, asa, hisopo o
pipeta estéril. En la naturaleza los microorganismos se encuentran formando
poblaciones mixtas, en las que unos individuos interaccionan con otros
estableciendo complejas relaciones. En estas condiciones, el grado de dificultad
que implica el estudio de los microorganismos en poblaciones mixtas, es muy alto.
El aislamiento de individuos a partir de poblaciones mixtas y la obtención de
cultivos puros formados por microorganismos de un solo tipo, constituyó un
avance trascendental en la Microbiología, posibilitando su estudio. El cultivo
axénico o puro es aquel que contiene un solo tipo de microorganismo y que
proviene de una sola célula, el crecimiento de ésta, origina en medio sólido, una
masa celular visible que recibe el nombre de colonia. Cada colonia representa una
población de microorganismos procedentes de una sola célula, a partir de la cual
se tiene la seguridad de obtener el cultivo puro de un solo tipo de microorganismo.
La obtención de un cultivo puro a partir de una población mixta, se efectúa
mediante el aislamiento y la transferencia. El aislamiento se realiza mediante
técnicas como la estría cruzada y la diseminación en superficie con varilla
acodada, entre otras, basadas en diluir la muestra inicial para obtener colonias
aisladas. La transferencia consiste en transferir las colonias aisladas a tubos con
medio de cultivo sólido inclinado, para obtener un cultivo puro. El medio de cultivo
utilizado en el proceso de aislamiento dependerá, entre otros parámetros, de los
requerimientos nutricionales de los microorganismos que se desee aislar y de la
presencia de microorganismos que, por sus características y por la cantidad en
que se encuentren en la muestra, dificulten la obtención del microorganismo objeto
del aislamiento. En este último caso, es necesario utilizar medios de
enriquecimiento y medios selectivos que inhiban el desarrollo de microorganismos
contaminantes. Una vez que se ha obtenido un cultivo puro, se puede mantener
haciendo resiembras en tubos de agar inclinado o bien congelando las células en
glicerol (10-30%) a -70° C, en Nitrógeno líquido a -173° C, o mediante liofilización.
Los cultivos puros son esenciales para el estudio y caracterización de los
microorganismos.
Materiales
 Bitácora de laboratorio
 Cronómetro
Equipo
 Cámara fotográfica
 Gabinete de bioseguridad
 Mecheros Fisher
 Espátulas
 Varillas acodadas de vidrio
 Varillas acodadas de poliestireno estériles
 Asas de siembra
 Matraces Erlenmeyer de 100, 250 y 500 ml
  Probetas de 100
 Placas de Petri estériles
 Tubos de cultivo
 Gradilla para tubos
 Pipetas graduadas de 1 ml
 Dispensadores para pipetas
 Micropipetas de 0.1 – 5.0 ml
 Puntillas estériles para micropipetas 0.1 – 5.0 ml
 Pipetas Pasteur
 Vaso de precipitado de 100, 250 y 500 ml
 Piseta
 Algodón
 Gasa
 Parafilm
 Papel estraza
 Papel metálico
 Papel secante
 Guantes de asbesto
 Guantes de latex y cubreboca estériles
 Marcadores indelebles
 Cinta masking con indicador de esterilidad
 Solución de fenol al 5% o benzal al 10%
 Solución de cristal violeta
 Solución de lugol
 Solución alcohol-acetona (3:1)
 Solución safranina al 0,5%
 Alcohol de 96º
 Agua destilada
 Agar nutritivo
 Agar eosina azul de metileno
 Material biológico: cultivos mixtos
 Microscopio óptico
 Autoclave
 Incubadora con termómetro
 Baño María
 Horno Pasteur
 Balanza analítica
 Planchas agitadoras para placas de Petri
Fundamento
Mediante el aislamiento se logra la separación de los microorganismos que se
encuentran en un cultivo mixto, y las colonias aisladas es posible transferirlas a un
medio sólido para obtener un cultivo axénico o puro.
Procedimiento 1
1. Aislamiento de microorganismos por estría cruzada o estría múltiple
 Desinfecte el área de trabajo con una solución de fenol al 5% o de
benzal al 10%.

 Prepare una placa de agar eosina azul de metileno estéril por cada
integrante del equipo de trabajo, y una placa más que se usará como
control. Siga el mismo procedimiento para la preparación y esterilización
de medios de cultivo, que realizó en la práctica no. 2.
 En caso de no utilizar el gabinete de bioseguridad, encienda los
mecheros y coloque junto a los mecheros, todo el material necesario de
modo tal, que trabaje sin dificultad a una distancia no mayor a 15 cm de
la llama de los mecheros.
 Esterilice el asa de siembra de manera directa en el mechero hasta que
alcance el rojo incandescente y enfríe 10 segundos en la proximidad de
la llama del mechero. En caso de trabajar en el gabinete de
bioseguridad, utilice asa desechable, o bien, utilice mecheros Fisher
para esterilizar el asa.
  Utilice los cultivos mixtos que obtuvo en la práctica anterior. Si el
microorganismo a aislar se encuentra en medio de cultivo líquido, abra
el tubo del cultivo sosteniendo la tapa del tubo con el dedo meñique de
la misma mano con la que sostiene el asa, NUNCA deposite la tapa
sobre la mesa o gradilla, pues está cargada de microorganismos.
Flamee la boca del tubo y tome el inóculo agitando suavemente el asa
dentro del mismo, quedando la muestra adherida por tensión superficial
en el extremo del asa de siembra. Flamee nuevamente la boca del tubo
antes de cerrar, para fijar al vidrio los microorganismos que pudieran
estar presentes en ésta.

1) Esterilice el asa y deje enfriar.

2) Destape y lame la boca del tubo.
3) tome el inóculo, vuelva a flamear y tape el tubo. Precauciones: El asa de
siembra se maneja como si se tratase de un lápiz. La boca del tubo de
cultivo se flamea después de abrir y antes de cerrar el tubo. El tapón del
tubo se mantiene en el dedo meñique de la misma mano con la que
sostiene el asa. Absolutamente todo el procedimiento es realizado cerca del
mechero o bien, en el gabinete de bioseguridad.
 Si el microorganismo a aislar se encuentra en medio de cultivo sólido,
coloque la placa en forma invertida sobre la mesa de trabajo junto al
mechero.

 Esterilice el asa en el mechero. Levante la parte que contiene el medio de

cultivo con los microorganismos, llévela a la proximidad de la llama del
mechero (si es que no trabaja en gabinete de bioseguridad) enfríe el asa en
la orilla del medio de cultivo, donde no se ve masa microbiana y tome una
pequeña porción de una colonia aislada mediante un ligero roce con el asa
de siembra.

 Una vez que ya tiene el asa cargada con microorganismos procedentes de

un cultivo en medio líquido o sólido, tome una placa de Petri con agar
nutritivo estéril y extienda sobre un área pequeña de la superficie del medio
de cultivo, en forma de estrías muy juntas (carga), pero sin hacer presión
para no dañar el agar.
 Flamee y enfríe el asa y después roce la siembra realizada previamente,
extienda de nuevo por otra zona de la placa haciendo nuevas estrías. Este
proceso se repite sucesivamente, flameado y enfriando el asa al comienzo
de las sucesivas siembras en estría.

 Deje una placa sin inóculo como control de esterilidad del medio.
 Incube las placas a 35ºC durante 24 horas, en posición invertida (las
inoculadas y el control.
2. Aislamiento de microorganismos por diseminación en superficie con
varilla acodada o asa Digralsky.
 Prepare 5 tubos de cultivo con 9 ml de agua destilada estéril y 11 placas de
Petri con agar nutritivo estériles. Siga el mismo procedimiento para la
preparación y esterilización de soluciones y medios de cultivo, que realizó
en la práctica no. 2.
 Coloque en una gradilla los 5 tubos de cultivo con 9 ml de agua destilada
estéril. Con mictropipeta y puntilla estéril, tome1 ml del cultivo mixto en
medio líquido que obtuvo en la práctica anterior, y deposítelo en el primer
tubo, homogeneice y rotule como 10-1 . De este tubo tome 1 ml y
deposítelo en el segundo tubo, homogeneice y rotule como 10-2 , siga el
mismo procedimiento hasta llegar a la dilución 10-5. Utilice una puntilla
estéril diferente para cada dilución. No deseche los tubos de dilución, ya
que se requerirán para realizar el método de vertido en placa.
 Si utiliza varilla de vidrio, introduzca el brazo más corto de la varilla
acodada, en alcohol al 70%. Si utiliza varilla acodada de poliestireno, esta
puede esterilizarla por radiación.
 Use una micropipeta y deposite 0,1 ml de de la dilución 10-1 en una placa
con agar nutritivo estéril (por duplicado). Tome la varilla acodada,
expóngala a la llama del mechero durante unos segundos, enfríe unos
segundos, y luego utilice el brazo más corto de la varilla para dispersar el
inóculo, de manera uniforme sobre la superficie completa del agar, hasta
que se absorba, como se muestra en la figura de la parte inferior. Siga el
 mismo procedimiento para cada una de las diluciones. Considere que las
placas han de hacerse por duplicado.
 Deje una placa más, sin inóculo como control de esterilidad del medio.
 Incube las placas a 35ºC durante 24 horas, en posición invertida (las
inoculadas y el control)
3. Transferencia de colonias aisladas para obtener cultivos puros
La técnica que se aplica depende de la consistencia de los medios de cultivo y del
tipo de recipiente que los contiene. Se pueden presentar los siguientes casos:
 Siembra de un medio líquido a medio líquido: el procedimiento se puede
realizar con asa, aguja o pipeta y en tubos de cultivo, matraces o frascos de
dilución.

 Siembra de medio sólido a medio líquido: el procedimiento se realiza con

asa o aguja y en tubo de cultivo, matraces o frascos de dilución.
 Siembra de medio sólido a medio sólido: el procedimiento se puede realizar
con asa o aguja y en tubo de cultivo, ya sea en superficie en placa de Petri
por estría o en profundidad en tubo de cultivo.
 Siembra de medio líquido a medio sólido: El procedimiento se realiza con
asa, aguja o pipeta Pasteur y en tubo de cultivo inclinado o en placa de
Petri por estría.
 Tras la incubación de las placas inoculadas por estría cruzada y las
inoculadas con varilla acodada, realice frotis del crecimiento bacteriano a
partir de ambas placas y tíñalos con la tinción de Gram, si todas las células
observadas coinciden morfológicamente, proceda a transferir la colonia a
tubo con agar inclinado para obtener un cultivo puro.
 Usando el asa de siembra estéril, transfiera a un tubo con agar nutritivo
estéril e inclinado, una pequeña porción de una colonia completamente
aislada, de cualquiera de las placas de Petri utilizadas para el aislamiento
en superficie con varilla acodada o estría cruzada.
  Introduzca el asa en el tubo de agar inclinado hasta el fondo, diluyendo el
inóculo en el agua de condensación que se acumula en esa parte, luego
mueva el asa suavemente sobre la superficie del agar con un movimiento
de zig-zag ascendiendo desde el fondo hasta la parte superior del medio.

 Deje un tubo de cultivo con agar inclinado, sin inocular, como control.
Incube los tubos, incluyendo el control, a una temperatura de 35ºC durante
24 horas.
 Después de la incubación, observe en los tubos de cultivo, la aparición de
crecimiento bacteriano sobre la superficie del agar.

 Mantenga los cultivos puros, previamente rotulados, entre 2-8ºC para

formar un cepario.
Observaciones y resultados

Conclusiones
Evaluación
 La evaluación es sistemática con una planeación flexible y criterios
definidos. Continua a través de la observación de los desempeños en los
aspectos puntuales relacionados con el trabajo de laboratorio; formativa y
 sumativa, los desempeños logrados abonan a la competencia general del
curso.
 Se centra en recabar evidencias (de conocimiento, producto, desempeño y
actitud), de los aprendizajes de los alumnos, para lograr el desarrollo de las
competencias propuestas para esta actividad.
 Se evalúa el reporte que elabora el alumno, considerando los criterios
establecidos en la rúbrica diseñada para tal fin, además de las respuestas
del siguiente cuestionario:
1. ¿Qué entiende por cultivo mixto y qué por cultivo puro? Un cultivo mixto es
aquel en el cual hay una siembra y salen diferentes tipo de
microrganismos, por ejemplo e.coli, Salmonella, etc, y el puro es aquel en
el cual se extrae del cultivo mixto pero de una sola especie como el e.coli
solo.
2. ¿En qué consiste el aislamiento por estría cruzada? Consiste en separar
las colonias y así poder hacer la observación mejor
3. ¿Por qué se recomienda enfriar el asa en el medio de cultivo antes de
realizar las estrías cruzadas? Para que el microrganismo no se muera
4. ¿Cuáles fueron las ventajas y desventajas que presentaron los métodos
utilizados? Las ventajas fueron que al realizar este método se obtuvieron
las colonias que se estaban buscando (una colonia aislada de las demás) y
la desventaja fue que no se lograba distinguir entre una estria y otra, por lo
tanto hubo pequeños errores
5. ¿En qué ocasiones o circunstancias se debe emplear cada uno de los
métodos anteriores? Al estar buscando un microorganismo patógeno que
dañe las plantas, o que beneficie.
Bibliografía
Bibek, R. 2009. Fundamental Food Microbiology. First Edition. Wiley-Blackwell Ed.
Madigan, M.T., Martinko, J.M., Dunlap, P. V. y Clark, D.P. 2009. Brock Biología de
los microorganismos. 12ª edición. Editorial Pearson.
Tortora, Gerard J.Funke, Berdell y Case, C. 2007. Introducción a la Microbiología.
9ª.edición. Ed. Panamericana Winn, W. et al. 2008. Koneman. Diagnóstico
microbiológico. Texto y Atlas en color. 6a. ed. Ed. Panamericana.