AISLAMIENTO DE MICROORGANISMOS DE INTERÉS INDUSTRIAL

Para qué Producto: Células, metabolitos

Cómo Procesos
Qué microbio: Producción, biomasa, rendimiento, recuperación de
costos, estabilidad a gran escala, fácil de manipulación
genética.

Clasificación de muestras; uso de diluyentes; usos

Cómo Procedimientos
de medios de selección, de enriquecimiento;
De aislamiento
aislamiento por método capilar; modificaciones o
creación de procedimientos, personal calificado.

De dónde? Naturaleza: Nichos: realizando descripción como listado de

substratos, evaluación de parámetros como pH,
salinidad, Eh, Tº.

AISLAMIENTO DE ACTINOMICETOS

METODOS DE MUESTREO Y COLECCIÓN

1. Asepcia
2. Representatividad
3. Rotulación
4. Mantención a 4ºC(en exámen no inmediato)

PARÁMETROS ECOLOGICOS Y MEDIOS

1. Tº, pH, [iónica], Eh, [substrato]: en campo y laboratorio

2. Modificación del medio: según ecosistema
- agregado de extracto natural: en aislamiento inicial
- uso de agar con substrato complejo o pobre: ejemplo quitina
 - incorporación de antifúngicos: nistatina, cicloheximida
3. secado de placas x 3 días: evita bacterias
4. tiempo de incubación: 4-20 días: son lentos excepto termofílicos.

AISLAMIENTO NO SELECTIVO DESDE EL SUELO

1. pretratamiento del suelo

2. uso de medio selectivo
Ejemplo:
- mezcla de suelo y agua
- calentamiento a 50-55ºC x 1 h
- uso del medio CYC con antibióticos (ug/mL): cycloheximida (50), novobiocina
(25)
- incubación a 50-55ºC x 1 día
- crecimiento de Thermoactinomyces

AISLAMIENTO DESDE PLANTAS Y MATERIAL DE PLANTAS

1. Toma aséptica de partes de plantas

2. Secado (2-7 días)
3. Sembrado en medio con agar con extracto de planta (1-5mL): Por introducción,
rodamiento o estrías, uso de su diluyente previo agitado en buffer fosfato o
extracto de planta diluído 1/4 y de diluciones menores.

AISLAMIENTO DESDE AGUAS

Centrifugación (6000g) o filtración (filtro: poro 0,54um).

1. Diluciones
2. Plaqueo.

SUBCULTIVO Y PURIFICACION

1. transplante de colonias a agares de mantenimiento y de réplica para selección.

AISLAMIENTO DE ALGAS

METODOS DE MUESTREO Y COLECCIÓN

1. Muestras: aguas, suelos y lodos, rocas, matas, musgos, ramas

2. Número de muestreo por hábitat: 2-3 (en botellas o tubos de polipropileno).
3. Examen microscópico
4. Técnicas y medios de aislamiento según muestra y observación microscópica.

MEDIOS Y PARÁMETROS ECOLÓGICOS

1. Parámetros ecológicos: Tº, salinidad, pH, proporción superficie/ volumen, fuente

de nitrógeno
2. Medios:
- sintéticos y naturales
 - básicos: con ajuste según necesidad, Ejm: en fijadores de nitrógeno se omite
fuente de nitrógeno (NaNO3, KNO3, etc.)

MÉTODOS DE AISLAMIENTO BASADOS EN DILUCIÓN

1. Dilución de muestras hasta 104 cel/mL

2. Siembra: placa vertida, extensión, estriamiento, en caldo
3. Incubación: a Tº adecuada con luz cíclica (12 horas)

MÉTODOS DE AISLAMIENTO SIN DILUCIÓN

1. Filtración/estampado:
- Filtración de muestra de agua (10-20 mL)
- Estampados del filtro sobre la superficie del medio con equivalencias a 10
veces de dilución con retención del filtro en el último estampado.
- Agregado de agar sobrecapa (a 45ºC)
- Incubación con luz cíclica.
2. Estampado, implante, rotación: muestras de rocas, ramas, suelo

SUBCULTIVO Y PURIFICACIÓN

1. Transferencia
2. Micromanipulación (uso de micromanipulador): para trasladar colonias solas
desde medio líquido.

AISLAMIENTO DE BACTERIAS

MÉTODOS DE MUESTREO Y COLECCIÓN

1. Similar a actinomicetos

PARÁMETROS ECOLÓGICOS Y MEDIOS

1. Simulación de parámetros ecológicos en medios de cultivo.

2. Incorporación de extractos naturales, a veces de 10-50% (en vol. o peso) en
medios.
3. Uso de antifúngicos cicloheximida y nistatina (50 ug/ml ) en medios.
4. Secado de medios: 1 a 2 días.

AISLAMIENTO DESDE EL SUELO

A.DIRECTO:

1. Obtención de infusión de suelo (1/4).

2. Mezclado de infusión con 5 g de suelo y agitación a 150-200 rpm x 25 min a
26ºC.
3. Dilución.
4. Extensión sobre el medio.
5. Incubación por 4 a 10 días a 22- 26ºC (con las placas volteadas).
A.ENRIQUECIMIENTO DE SUELO:

1. Suspensión de un sustrato apropiado para el microbio a aislar en extracto de

suelo (1/4), o solución de Ringer (1/2), o agua destilada.
2. Mezclado de 1 g de suelo con 2 a 10 ml de la suspensión más sustrato.
3. Ajuste de pH.
4. Tapado (cubrir) de la mezcla con grass desecado, desmenuzado y
esterilizado con óxido de etileno.
5. Recubrimiento de lo ejecutado en el paso anterior con papel estéril.
6. Incubación por 2 a 12 días a temperatura adecuada dentro de una jarra vacía
sellada conteniendo 200 ml de agua.
7. Remoción periódica de muestras; dilución; y plaqueado por extensión de 0,1
ml sobre placas con extracto de suelo con y sin el substrato de
enriquecimiento.

AISLAMIENTO DESDE RIZOSFERA

1. Incorporación de extracto de planta, raíz y suelo en medios.

AISLAMIENTO DESDE PLANTAS

A.DIRECTO:

1. Obtención de diluyente.
2. Mezclado de 1 g de planta con 99 ml de diluyente más perlas de vidrio
(opcional) por 15 a 20 min a 150 rpm.
3. Dilución de 1 ml del mezclado.
4. Sembrado de 0,1 ml por diseminación en el medio.

A.ENRIQUECIMIENTO:

1. Similar al del aislamiento por enriquecimiento del suelo.

AISLAMIENTO DESDE AGUAS

1. Empleo de botellas de plástico de boca ancha de 100 ml

2. Colección del agua a 30 cm por debajo de la superficie del agua. En
corrientes, la boca del frasco orientar hacia ella, sin llenar al tope.
3. Análisis inmediato o guardado de muestra a 5ºC por 24 horas.

A.DIRECTO:

1. Filtrado de 50 ml de a gua con filtro de 0,22 um.

2. Añadido sobre la membrana de 1 ml de diluyente estéril (extracto de suelo o
de lodo (1/4), con suelo o lodo del alrededor del cuerpo de agua.
3. Raspado suave de la superficie de la membrana.
4. Transferencia del sedimento (raspado) hacia 9 ml del diluyente y
remolineado por 5 minutos.
5. Dilución sucesiva.
6. Plaqueado por diseminación similar al descrito para suelos.

A.POR IMPRESIÓN DE MEMBRANA FILTRANTE:

 1. Filtrado de 50 ml de agua con filtro de 0,22 um.
2. Retiro del filtro.
3. Extensión sucesiva del filtro con la cara del sedimento hacia abajo sobre el
agar para conseguir efecto de disminución.

A.ENRRIQUECIMIENTO:

1. Incubado de 50 ml de muestra de agua.

2. Muestreo y plaqueo periódico de la muestra de agua sobre agares con
muestra de agua (50-100%)(esterilizado por filtrado).
Otros: añadidos de sustratos específicos, incubaciones en luz y en oscuridad por
separado, con añadidura de antifúngicos (15 a 35 ug/ml).

SUBCULTIVO Y PURIFICACIÓN

1. Transferencia de colonias para selección o para mantenimiento (50 ml/l ).

AISLAMIENTO DE HONGOS

MÉTODOS DE MUESTREO Y COLECCIÓN

1. Muestra de todos los ambientes. Para agua: volumen de 50 ml

2. Procesamiento inmediato o guardado a 5ºC de la muestra.

PARÁMETROS ECOLÓGICOS Y MEDIOS

1. En medios: similitud de parámetros ecológicos.

2. Medios: baja proporción de C/N dá más colonias.
3. Incubación : placas invertidas; luz para fructificación; Temp. según psicrófilas,
mesófilas o termófilas.
4. Medios selectivos enrriquecidos: celulosa; antibióticos (claranfenicol,
kanamicina, penicilina, estreptomicina, y tetraciclinas), Rosa de Bengala
(1/30 000) o antifúngicos (nistatina, cicloheximida, pimaricina, alta [CO2] ,
sales de propionato de calcio, oxgall, cristal violeta, Benlate, Botran y
Captan).

AISLAMIENTO DESDE EL SUELO

1. Método de Warcup ( aísla a los de crecimiento lento): Placa Petri + baja

cantidad de suelo dispersado + baja cantidad de agua destilada estéril + agar
fundido.
2. M. implante.
3. M. impresión.
4. M. lavado (empleo 0,05% Tween + agua para lavar)
5. M. maceración (planta es macerada y luego es complementado con otros
métodos).

AISLAMIENTO DESDE AGUAS

 1. Dilución: líquidos a 10 -1; ricos en lodos a 10 -2 ; lodos con 4-6% materia
seca a 10-4 ; lodos con 30- 40 % de materia seca a 10 -4 .
2. Colocación de materiales (ejemplo, pelos para queratinofílicos) dentro del
agua.

AISLAMIENTO DE BASIDIOMICETOS DESDE ESPOROCARPOS

1. Muestra: especímenes frescos: tejido de esporocarpo, basidiosporas.

2. Medios: agar papa dextrosa, agar malta levadura, medio selectivo.

AISLAMIENTO DE BASIDIOMICETOS DESDE ESTRUCTURAS VEGETATIVAS

1. Muestra: rizomorfos, micorrizas, esclerocios.

2. Colectores: bolsas de papel.
3. Tratamiento de muestra: esterilización de superficie de muestra con cloruro
de mercurio o peróxido de hidrógeno (1: 1); lavado por varias veces con
agua destilada estéril.
4. Siembra.

SUBCULTIVO Y PURIFICACIÓN

1. Transplante de colonias.

SELECCIÓN DE MICROORGANISMOS Y METABOLITOS (SCREENING)

SCREEN:

Proceso de búsqueda, selección o separación.

Detección y aislamiento de microorganismos de interés industrial de entre una

población compleja de organismos utilizando procedimientos selectivos.

La selección de un microorganismo puede ser de aquellos microorganismos que ya

presentan características innatas para su uso en un proceso industrial o para
sobrepotenciar éstas características innatas. En la mayoría de los procesos
microbiológicos industriales éstos se basan en la potenciación de las reacciones
microbiológicas que lo microorganismos ya son capaces de realizar, con la finalidad
– en la mayoría de los casos – de sobreexpresar el producto que interese.

Es una tarea de la microbiología industrial que aparte del desarrollo de

procedimientos para el aislamiento se desarrolle procedimientos para la selección
de microorganismos.
Los métodos de selección deben constituir una actividad interdisciplinaria que
combine actividades de microbiología, química, bioquímica, ingeniería y
bibliográficas.

La selección de los microorganismos que se utilizan en un proceso se realiza en

microorganismos que pueden ser obtenidos por aislamiento a partir de fuentes
naturales o de una colección de cultivos. Existen en el mundo un gran número de
colecciones depositarias de cultivos. Entre la diversidad de colecciones se destacan:
"American Type Culture Collection (ATCC)", USA, la cual mantiene bacterias,
levaduras, algas, actinomycetes, mohos, protozoos, virus y líneas celulares;
"Colletion Nationale de Cultures de Microorganismes" del Instituto Pasteur, Francia;
"Northern Regional Research Laboratory" (NRRL), de Peoria, USA, y "National
Collection of Type Cultures", Londres, Inglaterra.

Dos son los principales factores que gobiernan el éxito de un Screen:

a. Los microorganismos productores evaluados
b. La prueba de Screen empleado.

Las cualidades claves que se consideran en la elección de un Screen son:

a. Selectividad.
b. Sensibilidad

El desarrollo y Screen de los microorganismos para la evaluación en la producción

de nuevos productos naturales puede ser en :
a. Medio sólido
b. Medio líquido.

Los test de Screen están basados en :

a. Células intactas
b. Preparaciones subcelulares.

Los dos últimos test son los más usados por ser más económicos y más fácil de
manipular.

Por razones de propiedad no es posible ni practicable describir todos los tipos de

Screen.
CLASES DE SCREEN:
S. PRIMARIO:
Detecta y aísla microorganismos o metabolitos que poseen aplicaciones potenciales
de interés industrial.

Para llevar a cabo un screening primario generalmente se parte de una población

mixta (suelo, fermentaciones naturales, etc.) donde existe tanto una gran cantidad
como variedad de microorganismos potencialmente útiles que debemos seleccionar.

Es importante:
- Rapidez
- Sensibilidad
- Bajo costo
- Predicción
- Manejo fácil para muchas muestras.
- Efectivo para un amplio rango de compuestos pero específico para el blanco.

S.SECUNDARIO:

Clasifica o separa en forma posterior al screen primario a microorganismos o

metabolitos que tiene valor real para el proceso industrial separándolos de aquellos
que no lo tienen.

Es importante:
- Identificación
- Comparación de crecimiento de producción en medios líquidos y sólidos.
- Identificaciones empleando técnicas del producto deseado: cromatografía.
- Evaluaciones del producto: para toxicidad.

SELECCIÓN DE METABOLITOS

METABOLITO:

Producto metabólico que se obtiene en el metabolismo celular.

Los considerandos del Sreening de microorganismos también se tienen en cuenta

en el Screening de metabolitos microbianos.
Los microorganismos presentan una gran variedad metabólica por lo que en distintos
aislados microbianos podemos encontrarnos con una amplia variedad de
metabolitos.

TIPOS DE METABOLITO:

M. primario, M. Secundario.

M. PRIMARIO (M.P.):

Los metabolitos primarios son moléculas de bajo peso molecular que intervienen,
bien como productos finales o intermediarios, en las distintas rutas anabólicas y
catabólicas del metabolismo celular, ejemplo:
– Alcoholes: etanol
– Aminoácidos: ácido glutámico, lisina, treonina
– Nucleótidos: ácido 5' guanílico, ácido 5' inosínico
– Acidos orgánicos: ácido cítrico, ácido glucónico .
– Polisacáridos: xantano
– Azúcares: fructosa, sorbosa
– Vitaminas: riboflavina (B2 ), cianocobalamina (B12 )

B
trofofase
B
S
M.P

B= biomasa
S= substrato
t= tiempo

- Se forma en la fase primaria del crecimiento microbiano, en TROFOFASE

(Fase de crecimiento).
- Es esencial para la vida y la reproducción celular.

M. SECUNDARIO (M.S.):
Son moléculas sintetizadas por determinados microorganismos, normalmente en
una fase tardía de su ciclo de crecimiento.

B
idiofase B

S
M.S

B= biomasa
S= substrato
t= tiempo

- Se forma cerca o en la fase estacionaria del crecimiento (IDIOFASE)(Fase de

producción de metabolitos) después de formación de células o del M. primario.
- Cada uno es producido por un grupo muy reducido de organismos.
- No es esencial para la vida y la reproducción aparentemente.
- Es extremadamente dependiente de las condiciones de crecimiento.
- Se producen con frecuencia como grupos relacionados estructuralmente.
- Su regulación biosintética difiere significativamente del de los metabolitos
primarios. Se pueden superproducir.
- Se origina a partir de un substrato primario o generalmente de productos
intermedios (metabolitos primarios).
- La producción puede perderse fácilmente por mutación.
- Ejemplo: antibióticos, giberelinas, toxinas, alcaloides.

TÉCNICAS DE SELECCIÓN PARA MICROBIOS Y METABOLITOS

Las técnicas de selección son procedimientos, llamados también sistemas de

ensayo, que se utilizan para la selección de un microorganismo o de un
determinado metabolito microbiano de interés.

Se conocen diferentes sistemas de ensayo, algunos de ellos se describe a

continuación.
 SCREEN ANTIBACTERIAL

Organismo prueba

Siembra en caldo

Organismo en fase logarítmica

Dilución hasta 0,3 de densidad óptica a 660nm

Añadidura de dilución 1ml a 10ml de agar ensayo

Vertido en placa Petri

Colocación de discos de papel filtro con muestra prueba en bebido y controles

estándar antimicrobianos

Incubación

Lectura observando halos

 SCREEN DE INHIBIDORES DE BETA LACTAMASA

FASE I
Cultivo de E. coli con plásmido RP1 en liquido

Incubación a 37°C, agitación

Cultivo en fase logarítmica

Centrifugación

Lavado de sedimento en buffer fosfato por resuspensión

Centrifugación

Lavado y resuspensión

Ruptura de células por sonicación

Centrifugar

Sobrenadante con beta lactamasa (enzima) Células y restos sin betalactamasa

FASE II

Colocar caldos de fermentación (prueba) en pozo de placas de microtitulación

Agregar a los pozos enzima diluída y buffer fosfato

Preincubación a 37°C por 15’

Añadir Nitrocefina (sustrato cefalosporina cromogénica que cambia de amarillo a rojo

cuando se escinde anillo beta lactámico)

Incubación a 37°C por 30 minutos

Detención de reacción enzimática agregando buffer citrato pH 3

Hacer lectura
 SCREEN DE CEPAS MICROBIANAS PRODUCTORAS DE
BACTERIOCINAS

I. SELECCIÓN DEL MICROBIO PRODUCTOR DE BACTERIOCINA:

Sembrar en placas con agar TSAYE en forma de botón posibles cepas

productoras de bacteriocinas
(método botón en césped modificado)

Incubar en anaerobiosis a 30ºC toda la noche

Añadir sobre la placa un inóculo de cepa indicadora

Incubar en anaerobiosis a 30ºC por 48 horas

Observar zonas claras (halos de inhibición) alrededor de cepas productoras de

bacteriocinas

NOTA: El medio agar TSAYE está compuesto por caldo tripticasa soya sin glucosa
suplementado con extracto de levadura 0,5% y agar 1,5%.

El inóculo de cepa indicadora se obtiene inoculando 40 ml de un cultivo de cepa

indicadora de 24 horas en BHI en 5 ml de BHI con 0,8% de agar temperado a 45ºC.

II. ENSAYO DE LA ACTIVIDAD BACTERIOCINA:

PREPARACIÓN DEL EXTRACTO DE BACTERIOCINA:

Sembrar en caldo MRS una cepa productora de bacteriocina

Incubar a 30ºC por 48 horas

Centrifugar el caldo a 5 000 rpm por 15 min.

 Descartar el extracto crudo o sedimento y separar el sobrenadante (extracto de
bacteriocina)

Concentrar el sobrenadante 10 veces mediante evaporación centrífugo a vacío y

guardarlo a -20ºC hasta su uso posterior.

ENSAYO DE LA ACTIVIDAD BACTERIOCINA:

(Método difusión en disco)

Añadir sobre una placa con agar TSAYE 5 ml de un preparado de inóculo de un

cultivo indicador

Colocar sobre la placa con agar TSAYE inoculada discos de papel estéril saturado
con 25 ul de extracto de bacteriocina

Incubar la placa a 30ºC por 24 a 48 horas

Observar halos de inhibición alrededor de los discos

NOTA: El preparado de inóculo del cultivo indicador se prepara añadiendo 5 ml de

agar BHI semisólido (agar 0,8%) inoculado con 40 ul de un cultivo indicador de 24
horas .

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