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MTODOS DE SIEMBRA
INTRODUCCION Un aspecto importante en microbiologa es lograr el crecimiento de los microorganismos mediante el uso de medios de cultivos que ofrezcan las caractersticas nutricionales requeridas para stos. Una vez obtenido este crecimiento, es necesario tambin aislarlos en medios slidos que permitan observar sus caractersticas macroscpicas y posteriormente poder realizar su caracterizacin bioqumica y aproximacin a su taxonoma. En esta gua encontrar diversos mtodos de siembra en medios slidos y lquidos y, adicionalmente, las tcnicas de aislamiento usadas clsicamente para el manejo de bacterias y hongos. En la plataforma, en la carpeta del laboratorio de semana 4, encontrar informacin detallada sobre los diferentes mtodos de siembra y aislamiento de bacterias. OBJETIVOS Aprender diferentes mtodos de siembra de bacterias y hongos. Adquirir destreza en el manejo del material de laboratorio utilizado para siembra de microorganismos. MATERIALES Estudiante: 1 caja de Petri con agar sangre. 4 cajas de Petri con agar nutritivo (AN). 1 caja de Petri con agar Saboureaud + Cloranfenicol (50 ppm) 1 tubo de ensayo 13 x 100 con agar SIM. 1 tubo de ensayo 16 x 100 con caldo nutritivo (CN). 1 tubo de ensayo 16 x 150 con AN en pico de flauta. 2 escobillones estriles. Grupo de trabajo:

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1 caja de Petri con AN sembrado con Escherichia coli. 1 caja de Petri con AN sembrado con Salmonella sp. 1 caja Petri con agar Sabouraud sembrado con Aspergillus sp. 1 tubo de ensayo 16 x 100 con CN previamente cultivado con una muestra de suelo. 1 tubo de ensayo 13 x 100 con solucin salina (0.85% p/v) estril. Asas bacteriolgicas (asa recta y redonda o de argolla, aguja de diseccin recta). Cinta de enmascarar o marcador para vidrio. Vinilpel. Cinta de enmascarar o bandas elsticas.

PROCEDIMIENTO 1. Mtodos de siembra y aislamiento de bacterias 1.1 Mtodo de siembra para aislamiento de colonias bacterianas a partir de una muestra humana y de una superficie inerte - Siembra por agotamiento. Marque la base de la caja con el agar sangre: nmero de grupo, fecha y origen de la muestra. Antes de iniciar un aislamiento verifique que la superficie del medio de cultivo est seco, si no es as colquelo en una incubadora a 37 oC por dos horas con la tapa de la caja ligeramente levantada. En el laboratorio espere indicaciones de su profesor para acelerar el proceso de secado del agar. Con la ayuda de un escobilln estril y con solucin salina (0.85% p/v) estril tome una muestra de placa dental rotando el escobilln suavemente sobre la superficie de los dientes. Frente al mechero abra la caja de Petri con agar sangre y realice una siembra masiva en un borde de la superficie del medio slido. Realice el aislamiento de las colonias bacterianas como se indica a continuacin. Tome otra muestra a partir de una superficie (ej. mesones, paredes, sillas, etc.) rotando igualmente el escobilln previamente humedecido en la solucin salina. Realice una siembra masiva en un borde de la superficie del medio slido (AN) y luego el aislamiento. o Nota:

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Queme los escobillones utilizados y descrtelos en el recipiente destinado para ello. El asa debe esta previamente estril (a la llama del mechero) o usar asas desechables. Recuerde que la caja con la tapa debe estar en una de sus manos. Para ello tome la caja, la base de esta debe sostenerse con los dedos meique, anular y corazn, la tapa se asegura con los otros dos dedos. Levante la tapa cerca al mechero para hacer la siembra (nunca deje la tapa sobre la mesa).

Con el asa previamente esterilizada, tome la muestra masiva realizada, una sola vez y realice una siembra inicial realizando estras en forma de Z sobre una pequea rea del borde del agar. Nuevamente esterilice el asa, deje enfriar y extienda la muestra en forma de Z, las lneas de la Z no deben tocarse entre s. El ngulo del asa debe ser cercano a 45o con el fin de que no queden estras gruesas que impidan separar las colonias. Re-esterilice el asa y a partir de la ltima estra realice nuevamente 4 a 6 lneas en sentido perpendicular conservando la forma de Z.

http://www.qb.fcen.uba.ar/microinmuno/GUIA_archivos/image004.jpg http://mail.fq.edu.uy/~microbio/MGral/practico/placa2.JPG

Envuelva las cajas en papel vinilpel e incube a 37C durante 24 horas para

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permitir el desarrollo bacteriano. Las cajas deben ponerse en la incubadora con el medio hacia arriba (es decir la tapa hacia abajo), para que el agua de condensacin que se libera durante la incubacin caiga sobre la tapa de la caja de Petri y no perjudique el cultivo. Este proceso se denomina siembra por aislamiento o por agotamiento, debido a que las bacterias presentes en una muestra se distribuyen sobre la superficie del agar y cada clula se reproduce independientemente hasta formar una agrupacin de bacterias observables a simple vista, con las mismas caractersticas fenotpicas y genotpicas. A este grupo de bacterias se le denomina colonia bacteriana. De esta manera es posible observar sobre la superficie del agar, colonias de diferentes caractersticas en cuanto a forma, superficie, borde, color, aspecto y elevacin, lo que indica a simple vista la presencia de diferentes tipos de bacterias en la muestra. As se puede estudiar e identificar independientemente cada especie bacteriana. Ver Tabla 1. Tabla 1. Caractersticas de las colonias bacterianas FORMA Puntiforme Circular Rizoide Irregular Filamentosa BORDE Entero Lobulado Ondulado Rizado Filamentoso ELEVACIN Plana Elevada Convexa Umbilicada Levantada SUPERFICIE Lisa brillante Rugosa Seca pulverulenta Algodonosa Granulosa

1.2 Mtodo de siembra para aislamiento de colonias bacterianas a partir de una muestra lquida - Siembra por agotamiento. Marque la caja (AN) con el nmero de grupo, fecha y origen de la muestra, como se indic anteriormente. Tome una muestra del cultivo de suelo en CN (realizado previamente por el monitor), introduciendo el asa de argolla estril y fra, en el tubo. En la caja de AN, distribuya la muestra pasando suavemente el asa redonda sobre una pequea rea en un borde de la superficie del medio (siembra masiva). Recuerde que la caja con la tapa debe estar en una de sus manos. Para ello tome la caja, la base de esta debe sostenerse con los dedos meique, anular y corazn, la tapa se asegura con los otros dos dedos. Levante la tapa cerca al mechero (nunca deje la tapa sobre la mesa). Luego extienda la muestra con el asa recta o redonda previamente esterilizada en forma de Z. Siga el procedimiento enunciado anteriormente.

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Envolver las cajas en vinilpel y llevar a incubar a 37C. 1.3 Mtodo de siembra para aislamiento de colonias bacterianas a partir de un cultivo slido - Siembra por agotamiento. Marque la caja (AN) con el nmero de grupo, fecha y origen de la muestra. Cada bacteria se siembra en una caja separada. Tome una muestra del cultivo de Escherichia coli o del cultivo de Salmonella sp. sembrado en AN con el asa recta previamente esterilizada. Para esto, toque con la punta del asa, el centro de una colonia aislada. Coloque la muestra cerca de uno de los bordes de la caja con AN. Extienda la muestra, en forma de Z y repita el procedimiento enunciado anteriormente. Envolver las cajas en vinilpel y llevar a incubar a 37C. Nota: Si despus de la incubacin no obtiene colonias aisladas, deber realizar un nuevo aislamiento, en especial si estas colonias se van a utilizar para identificaciones bioqumicas. Consideraciones adicionales importantes: Los microorganismos son microscpicos por lo que en la carga de un asa pueden existir muchos microorganismos aunque no se vean, por lo cual solo tome muestra una sola vez, entre ms inculo, menor probabilidad de aislamiento tendr. Se considera un buen aislamiento cuando al menos logra tener 10 colonias aisladas. Verifique antes de usar un contaminaciones. medio que ste realmente no presenta

Asegrese de cumplir con las buenas prcticas de laboratorio (BPL) y las normas de bioseguridad. 1.4 Mtodo de siembra masiva. Estas siembras se hacen cuando se parte de muestras puras y se requiere tener un crecimiento masivo para poder verificar resultados de inhibicin de crecimiento microbiano como antibiogramas, pruebas de desinfectantes y pruebas de antagonismo. Normalmente en esta tcnica el inculo es un medio lquido con crecimiento del microorganismo a evaluar a una concentracin conocida. El procedimiento es el siguiente:

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Tome la muestra a evaluar del medio lquido con escobilln estril, humedzcalo bien, cuando vaya a retirar el escobilln del tubo presione ste con la parte interna del tubo para evitar que se riegue la muestra. o Nota: si la siembra se va a realizar a partir de colonias aisladas, debe tomar estas con asa de argolla y hacer una suspensin en medio lquido, siga las instrucciones anteriores. Con el escobilln extienda la muestra sobre la superficie de una caja de petri con medio agarizado con movimientos rotatorios, hasta cubrir toda la superficie del agar, para garantizar un crecimiento uniforme. Envolver las cajas en vinilpel y llevar a incubar de acuerdo a las recomendaciones. 1.5 Mtodo de siembra por picadura en medio semislido. Este mtodo se realiza para sembrar microorganismos microaerfilos o para pruebas bioqumicas como la determinacin de motilidad o la licuefaccin de la gelatina. Marque cada tubo con medio SIM con el nmero de grupo, fecha y origen de la muestra. Tome una muestra del cultivo de Salmonella sp. o Escherichia coli con el asa recta estril y fra. Siembre por picadura el medio, introduciendo el asa por la parte central del medio hasta dos terceras partes de profundidad, procurando sacar el asa por el mismo sitio de picadura y, as, evitar falsas interpretaciones de movilidad bacteriana. Lleve a incubar a 37C. 1.6 Mtodo de siembra en medio lquido. Marque el tubo de medio lquido (CN) con el nmero de grupo, fecha y origen de la muestra. Antes de iniciar la siembra verifique la temperatura del medio a sembrar y la esterilidad de este. Tome la muestra con asa de argolla previamente esterilizada y enfriada Introduzca el asa con la muestra dentro del medio lquido y agtela, lleve a incubar de acuerdo a las condiciones que necesita. 1.7 Mtodo de siembra en medio inclinado (pico de flauta) Este mtodo se utiliza para la determinacin de caractersticas bioqumicas bacterianas, por ejemplo asimilacin de diferentes azcares en medio TSI (agar hierro triple azcar) o para conservar cultivos bacterianos. Marque el tubo de medio de cultivo AN con el nmero de grupo, fecha y

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origen de la muestra. Tome una muestra del cultivo de Salmonella sp. o Escherichia coli con el asa recta estril y fra. Siembre por picadura el tubo con AN, introduciendo el asa hasta el fondo, saque hasta la superficie de pico de flauta y sobre esta realice estras.

2.

Siembra de hongos miceliales y levaduriformes. 2.1 Siembra de hongos levaduriformes. Para sembrar Saccharomyces sp. (hongo levaduriforme) realice el mismo procedimiento explicado para sembrar bacterias por agotamiento a partir de un cultivo slido. Incubar a 30C de 24-48h. 2.2 Siembra de hongos miceliales Para sembrar Aspergillus sp. (hongo micelial), tome la aguja de diseccin estril y fra y con la punta realice una puncin sobre la colonia del cultivo, deje la caja sobre el mesn y tome la caja de agar Sabouraud. Sin que la punta de la aguja toque ninguna superficie, realice una puncin en el centro de la caja de Petri. Incube a temperatura ambiente (18-25C) durante 5-7 das.

. RESULTADOS Realice la descripcin de las diferentes colonias de bacterias obtenidas en cada medio. Dibuje el aspecto macroscpico (colonias formadas, cambio de color, cambio de textura, etc.) de todos los medios. Interprete los cambios presentados en cada medio. Explique por qu se desarrollan algunos microorganismos y no otros sobre los medios de cultivo.

Cuestionario complementario: 1. Cmo se define una colonia microbiana?

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2. Cules son los componentes del medio SIM y qu caractersticas de crecimiento de los cultivos bacterianos se pueden observar en este medio? 3. Cules son los tipos de hemlises que se pueden resentar tras el crecimiento bacteriano sobre agar sangre? Cul es el fundamento de cada uno? 4. Cules son los componentes del agar TSI? Cules son las reacciones bioqumicas que se pueden evidenciar en este mdio tras el crecimiento bacteriano? 5. De acuerdo con la siguiente tabla sobre la clasificacin de las colonias bacterianas, dibuje en el espacio asignado las colonias segn su forma, borde, elevacin y superficie.

FORMA Puntiforme

BORDE Entero

ELEVACIN Plana

SUPERFICIE Lisa brillante

Circular

Lobulado

Elevada

Rugosa

Rizoide

Ondulado

Convexa

Seca pulverulenta

Irregular

Rizada

Umbilicada

Algodonosa

Filamentosa

Filamentoso

Levantada

Granulosa