Año de la Universalización de la Salud

UNIVERSIDAD NACIONAL MAYOR DE SAN MARCOS

(Universidad del Perú, DECANA DE AMÉRICA)

FACULTAD DE FARMACIA Y BIOQUÍMICA
Escuela Profesional de Farmacia y Bioquímica

MICROBIOLOGÍA GENERAL
LABORATORIO DE MICROBIOLOGÍA GENERAL

DOCENTE:
- Dra. Mirtha Roque Alcarraz
- MSc. Nelson Bautista Cruz
- Dra. María Elena Salazar Salvatierra
INTEGRANTES:
- Juárez Chacón, Joel
- Mejía Ramos, Cinthia
- Napán Rodríguez, Hugo Franco
- Orihuela Sicos, Kunumy Raquel
- Ramírez Blas, Judith Gabriela

ASIGNATURA: Microbiología General

GRUPO: B3, Jueves

2020
 INFORME N°1
PRÁCTICA I: INTRODUCCIÓN AL LABORATORIO DE
MICROBIOLOGÍA

I. INTRODUCCIÓN

La Microbiología se puede definir, sobre la base de su etimología, como la ciencia

que trata de los seres vivos muy pequeños, concretamente de aquellos cuyo
tamaño se encuentra por debajo del poder resolutivo del ojo humano. Con la
invención del microscopio en el siglo XVII comienza el lento despegue de una
nueva rama del conocimiento. Durante los siguientes 150 años su progreso se
limitó casi a una mera descripción de tipos morfológicos microbianos, y a los
primeros intentos taxonómicos, que buscaron su encuadramiento en el marco de
los “sistemas naturales” de los Reinos Animal y Vegetal. 1

El cultivo de microorganismos, que llega hasta finales del siglo XIX, donde las
figuras de Pasteur y Koch encabezan el logro de cristalizar a la Microbiología
como ciencia experimental bien asentada.1

Un laboratorio de Microbiología es un lugar habilitado para manejar y estudiar

microorganismos. El trabajo debe realizarse de acuerdo con los estándares
técnicos y de seguridad propios de un laboratorio de Microbiología. Es importante
recordar que la finalidad es determinar los microorganismos presentes en la
muestra por lo que es preciso extremar las precauciones para evitar
contaminaciones que den lugar a resultados erróneos. 1

Los procesos de esterilización y/o desinfección son diariamente llevados a cabo

en el laboratorio, donde son fundamentales para evitar la contaminación de
medios, cultivos, placas etc. Cabe señalar además que esterilizacion por
definición, es el proceso de destrucción o remoción de todas las formas de vida
microbiana patógenas o no, tanto en su forma vegetativa como esporulada de un
material o un objeto, o sea la destrucción de toda forma de vida microbiana, como
bacterias, hongos y virus, tanto en su forma vegetativa como esporulada. 2
Los medios de cultivo son una mezcla de nutrientes que, en concentraciones
adecuadas y en condiciones físicas óptimas, permiten el crecimiento de los
microorganismos. Estos medios son esenciales en el Laboratorio de Microbiología

1
por lo que un control en su fabricación, preparación, conservación y uso, asegura
la exactitud, confiabilidad y reproducibilidad de los resultados obtenidos. 1
No todos los microorganismos son cultivables en el laboratorio, pero sí una
enorme cantidad de ellos. Podría hablarse de cultivos bacteriológicos porque en la
mayoría de los casos lo que se cultiva en el laboratorio clínico son bacterias, pero
también lo pueden hacer otro tipo de microorganismos, como es el caso de los
hongos. Debido a esto, es mejor hablar de cultivo de microorganismos. La gran
diversidad metabólica que tiene este conjunto de organismos explica la amplia
gama de medios de cultivo que existen en el mercado. 3

II. OBJETIVOS
● Reconocer los equipos y materiales de laboratorio
● Identificar los procesos de esterilización tanto por calor seco por el método
del horno y por calor húmedo
● Conocer el acondicionamiento previo a los materiales de esterilización
● Conocer la importancia de los medios de cultivo
● Comprender la preparación de medios de cultivo

III. METODOLOGÍA Y FUNDAMENTOS

FUNDAMENTO DEL ACONDICIONAMIENTO DE LOS MATERIALES PARA SU
ESTERILIZACIÓN
El empaquetado tiene como objetivo mantener el instrumental aislado de toda
fuente de contaminación, conservando la esterilidad conseguida en el proceso de
esterilización. El embalaje debe ser adecuado para permitir la penetración del
agente esterilizante.4
Práctica 1A: PROCEDIMIENTO DEL ACONDICIONAMIENTO DE LOS
MATERIALES PARA SU ESTERILIZACIÓN
MATERIALES
● Tubos delgados o similar (para simular pipetas de vidrio)
● Frascos de boca ancha de vidrio
● Algodón
● Ligas o un pedazo de pabilo
● Papel kraft o papel reciclado (tamaño A4) y tiras de papel de 3 cm de
ancho por 30 cm de largo.

2
 Fig 1. Materiales

PROCEDIMIENTO
Acondicionamiento de los materiales para su esterilización:
Pipetas, viales y matraces: se hace tapones de algodón y luego se cubre con
papel kraft.

3
 Fig 2. Acondicionamiento de Materiales

Placas Petri: Se apilan de dos a cuatro en forma invertida y luego se envuelven en

papel kraft.

Fig 3. Acondicionamiento de placas petri

El paso previo es imprescindible para una correcta esterilización es la limpieza

exhaustiva del material a esterilizar. A través de un proceso mecánico se elimina,
por arrastre, la suciedad visible y la materia orgánica de una superficie u objeto,
reduciendo el número de microorganismos y protegiendo los instrumentos contra
la corrosión y el desgaste.
FUNDAMENTO DE LA PREPARACIÓN ADECUADA DE MEDIOS DE CULTIVO

4
Medio líquido: No contiene ningún agente gelificante, por lo que los
microorganismos crecen por todo el medio. El crecimiento en este tipo de medios
es más rápido puesto que la movilidad permite acceder de una forma más fácil a
los nutrientes.5
Medio sólido: Tienen una proporción de agar de, aproximadamente, el 1,5%. El
crecimiento se desarrolla en la superficie del medio. Estos medios pueden
depositarse en placas de Petri o en tubos de ensayo. 5
Medio semisólido: Son aquellos que contienen una proporción de agar inferior al
0,5%. Se utilizan para pruebas bioquímicas y de movilidad. 5

Práctica 1B: PREPARACIÓN ADECUADA DE MEDIOS DE CULTIVO

MATERIALES
● Frascos de boca ancha de vidrio o plástico (simular matraces) o viales
● Envases de manti pequeña con tapa o latas de atún sin tapa limpias y
secas (simular placas)
● Gelatina (10g)
● Azúcar rubia (2g)
● Cuchara sopera
● Agua
● Algodón, papel kraft, liga o un pedazo de pabilo.

Fig 4. Materiales para medio de cultivo

PROCEDIMIENTO
a. Preparación de un medio líquido:
i. Disolver media cucharada de azúcar en agua

5
 ii. Colocar en matraz.
iii. Coloque tapón de algodón

Fig 5. Preparación de medio líquido

b. Preparación de un medio sólido

i. Preparar aproximadamente media taza de gelatina.
Aproximadamente es 1 ½ cucharadas para media taza de agua
ii. Disolver bajo las condiciones necesarias. (concentración alta)
iii. Dispensar en la placa petri. Tapar para evitar que caigan partículas
del ambiente.

Fig 6. Preparación de medio sólido

c. Preparación de un medio semisólido

6
 i. Preparar aproximadamente menos de media taza de gelatina.
Aproximadamente ½ cucharada.
ii. Disolver bajo las condiciones necesarias. (concentración baja)
iii. Dispensar en la placa petri. Tapar para evitar que caigan partículas
del ambiente.

Fig 7. Preparación de medio semisólido

IV.

7
 V. RESULTADOS

Resultados de la práctica 1A

Tabla 1. Acondicionamiento de los materiales para su esterilización

MATRAZ PIPETA

A B

Matraz acondicionado(A), pipeta acondicionada (B)

8
Resultados de la práctica 1B

Tabla 2. Preparación de medios de cultivo

LÍQUIDO SÓLIDO SEMISÓLIDO

B C
A

Medio de cultivo líquido(A), medio de cultivo sólido(B), medio de cultivo

semisólido(C)

VI.

9
VII. DISCUSIÓN
La limpieza del material es un componente esencial en el procedimiento de
esterilización. La esterilización nunca podrá ser alcanzada sin una limpieza
completa. Las prácticas de limpieza seguras son importantes para reducir la carga
microbiana de las superficies de los materiales.6
Todo material para ser esterilizado y almacenado debe estar condicionados en
empaques a fin de garantizar las condiciones de esterilidad del material
procesado. En la práctica realizamos el acondicionamiento de diferentes
materiales para su esterilización y almacenamiento. El propósito de
acondicionamiento es el de contener los materiales y protegerlos de la
contaminación por suciedad, polvos o microorganismos. 7
El empaque debe mantener la esterilidad del material hasta que este sea abierto y
usado. El acondicionamiento de los empaques deben realizarse de tal modo que
el proceso de esterilización sea efectivo, el vapor debe tener la capacidad de
penetrar el empaque y ponerse en contacto con el material a ser esterilizado. 7

Los medios de cultivo para los microorganismos pueden ser sólidos, líquidos o
semisólidos. Estos medios constituyen el aporte de nutrientes indispensables para
el crecimiento de los microorganismos. 8 En la presente práctica se realizó la
preparación de diferentes medios de cultivos. El modelo de medio líquido “caldo”
se realizó disolviendo azúcar en agua, este medio no contiene un agente
gelificante por lo que nos permite obtener suspensiones con un número elevado
de microorganismos. Los medios líquidos se pueden transformar en sólidos al
adicionarles agar, gelatina o gel sílice. 8 El medio de cultivo sólido y semisólido se
realizó en una disolución de gelatina en agua, la concentración de la gelatina a
disolver definirá la consistencia del medio. Los medios sólidos se utilizan con
frecuencia en el aislamiento y mantenimiento de los microorganismos. Al disminuir
la cantidad de agente solidificante se obtiene el medio semisólido. 8 A una
proporción inferior de 0.5% gelatina en agua se realizaron estos medios, este
medio particularmente se usan para apreciar la movilidad de los microorganismos
en ella.

VIII. CONCLUSIONES

10
 ● Se reconoció los equipos y materiales de laboratorio para el correcto
desarrollo de las prácticas en el laboratorio teniendo en cuenta que cada
equipo debe contar con un procedimiento de manejo y un personal
debidamente capacitado para su uso.
● Se identificó los procesos de esterilización tanto por calor seco por el
método del horno el cual se fundamenta en la oxidacion de proteinas, asi
como también por calor húmedo por el método de autoclave el cual se
fundamenta en la coagulación de proteínas estructurales y enzimas
bacterianas cesando así su función biológica..
● El acondicionamiento previo a los materiales de esterilización, en caso sea
un material contaminado debe estar en un lugar apropiado en recipientes
debidamente rotulados en bolsas apropiadas y correctamente cerradas y si
es un material limpio debe lavarse y enjuagarse minuciosamente.
● Es muy importante los medios de cultivo ya que gracias a esto se puede
detectar cuales son las causantes de ciertas afecciones en el organismo y
así mismo crear métodos de prevención de las mismas ya sea mediante
vacunas y/o antibióticos.
● Se comprendió la preparación de medios de cultivo, teniendo en cuenta
que el medio a preparar debe contener las sustancias necesarias para el
crecimiento del microorganismo que se desea estudiar y mantener su
esterilidad hasta el momento de su uso.

IX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Difco y BBL. 2003. Manual de Medios de Cultivo Microbiológicos.
2. Colectivo de autores. Introducción a la Salud Pública. Editorial Ciencias
Médicas. Ciudad de la Habana 2004.
3. Barrero L., Microbiología Clínica, España,Editorial Síntesis, S.A.,2016
4. Hernández M. Celorrio J. Moros C. Solano V. Fundamentos de antisepsia,
desinfección y esterilización. Enferm. Infecc. Microbiol Clin. 2014
5. Barrero L. Microbiología Clínica. Editorial Síntesis S.A. España 2016. pg.
40
6. Acosta S, Valeska S. Manuela de esterilización para centros de salud.
Organización Panamericana de la Salud, Washington DC: 2008.

11
 7. Negroni M. Fundamentos y guía práctica. Microbiología y estomatología. 2°
Ed. Buenos Aires: Editorial Médica Panamericana; 2009.
8. Rodríguez E, Gamboa M, Hernández F. Bacteriología General - Principios
y prácticas de laboratorio. 1ra edición. San José: Editorial UCR; 2005

ANEXO
CUESTIONARIO 1
1. ¿Qué precauciones se deben tener en cuenta para la esterilización en
autoclave?
Antes de la esterilización, se debe verificar la válvula de seguridad del autoclave,
esta se dispara automáticamente cuando hay un exceso de presión en la cámara,

12
así aseguramos que no ocurra una explosión cuando la presión sea demasiado
alta.1

Verificar que la resistencia esté cubierta por debajo del agua para que genere
vapor.
Cuando el autoclave esté funcionando siempre debemos estar pendientes del
manómetro y el termómetro, ellos nos dirán lo que está sucediendo dentro de la
cámara.1

Es muy importante para la esterilización que el vapor sea:

◦ Limpio: Es decir un vapor formado a partir de agua limpia, es decir, agua
desionizada o destilada, que tenga bajo contenido de sales como calcio, cloro,
magnesio y fosfatos (agua dura). Al hervir este tipo de agua, estos minerales se
depositarán en el fondo del recipiente formando una capa de sarro o minerales
precipitados, este sarro no es un buen conductor de calor lo cual reduciría la
eficacia de las resistencias.1

Es importante revisar la válvula de descarga, ya que cuando llega a los 15 min,

se tiene que esperar que la presión baje poco a poco hasta llegar a cero antes de
abrir la tapa, para evitar un posible accidente. 1

2. Indique método de esterilización y cómo se acondicionan (si fuera el

caso) los siguientes:

13
 a. Una solución de antibiótico
Se puede realizar la esterilización a través de óxido de etileno, teniendo en
cuenta que se trata de medicamentos termolábiles (antibióticos).
Las etapas en la esterilización por ETO son cinco: acondicionamiento y
humidificación, ingreso del gas, exposición al gas, evacuación y aireación.
Las temperaturas varían entre 35º C y 55º C y los tiempos entre 1.20 y 4
horas de exposición, seguidos por el proceso de aireación que suele tener
entre 50º C y 60º C y una duración entre 6 y 12 horas; terminando todo el
proceso entre 8 y 16 horas. Siempre valorando ello con la premisa de
menores temperaturas requieren mayores tiempos de aireación. 2
b. Mandiles
En el caso de textiles (algodón, hilo, fibras sintéticas) también por autoclave,
el apresto del tejido puede dificultar el paso del vapor y la succión por la
bomba de vacío, por lo que se recomienda, en el caso de la ropa nueva, su
lavado previo a fin de disminuirlo. 2
c. Hisopos
Se puede esterilizar por óxido de etileno.2
d. Pinzas y tijeras metálicas
El material metálico requiere un lavado y secado previo a la esterilización. 2

3. ¿Cuál es el fundamento del funcionamiento de la cinta testigo?

¿Cuántos tipos de cinta testigo existen en el mercado?
La Cinta testigo para vapor está diseñada para utilizarse con empaques
desechables, tanto como una identificación de los paquetes se han sometido a
un proceso de esterilización como para sellar los paquetes. El adhesivo de esta
cinta es más suave pero tiene un nivel de adhesión superior.
Después del proceso de esterilización las líneas químicas indicadoras cambian a
un color café oscuro sobre un fondo azul cuando se exponen a un proceso de
esterilización por vapor.
● Cinta Testigo Autoclave Vapor Calor Seco 1x30yds
● Cinta Testigo 24 Mm 1 x 60 yds. Para Autoclave Vapor Indicador
● Cinta Testigo Sterrad Indicador Químico

14
 ● Cinta Testigo Autoclave
● Cinta Testigo ¾
● Cinta de ¾’ Testigo Vapor
● Cinta de Testigo 19 mm x 50m
● Cinta Testigo para Embalar Meditest en 6
● Cinta Testigo 1 Pulgada

4. Complete los cuadros:

AGAR MANITOL SALADO

USO PRINCIPAL Utilizado para el aislamiento y diferenciación

de estafilococos a partir de diversas
muestras.3
FUNDAMENTO DE SU USO En el medio de cultivo, el extracto de carne,
la peptona de carne y la tripteína,
constituyen la fuente de carbono, nitrógeno,
vitaminas y minerales que promueven el
desarrollo microbiano. El manitol es un
hidrato de carbono fermentable. El cloruro
de sodio (que se encuentra en alta
concentración) es el agente selectivo que
inhibe el desarrollo de la flora acompañante,
el rojo fenol es el indicador de pH y el agar
es el agente solidificante.
Se trata de un medio altamente selectivo por
la alta concentración salina y diferencial
debido a la capacidad de fermentación del
manitol por los microorganismos.3
TIPO DE MEDIO POR SU Definido
COMPOSICIÓN
TIPO DE MEDIO POR SU Selectivo
UTILIZACIÓN
DESCRIBA CÓMO SE PREPARA Suspender 22.2 g del polvo en 200 mL de
200 ML. DEL MEDIO. agua purificada. Reposar 5 minutos y

15
 calentar con agitación frecuente llevando a
ebullición durante 1 o 2 minutos para
disolución total.3
MÉTODO DE ESTERILIZACIÓN Distribuir el contenido en recipientes
DEL MEDIO DE CULTIVO apropiados y esterilizar en autoclave a 118 -
121 °C durante 15 minutos. Enviar y
distribuir en placas de petri estériles. 3

CALDO SELENITO - CISTINA

USO PRINCIPAL Medio que permite el enriquecimiento

selectivo de Salmonella spp. a partir de
nuestras clínicas, especialmente heces y
orinas.4
FUNDAMENTO DE SU USO En el medio de cultivo, la peptona aporta los
nutrientes necesarios para el adecuado
desarrollo bacteriano, la lactosa es el hidrato
de carbono fermentable, el selenito de sodio
inhibe la flora Gram positiva y la mayoría de
la flora entérica excepto Salmonella spp.
durante las primeras 8 - 12 horas de
incubación.4
TIPO DE MEDIO POR SU Definido
COMPOSICIÓN
TIPO DE MEDIO POR SU Selectivo
UTILIZACIÓN
DESCRIBA CÓMO SE PREPARA Suspender 4.6 g del polvo que contiene
200 ML. DEL MEDIO. peptona, lactosa, fosfato de sodio, selenito
de calcio en 200 mL de agua purificada.
Mezclar bien y calentar ligeramente hasta su
disolución completa. Evite el calentamiento
excesivo.4
MÉTODO DE ESTERILIZACIÓN Calentar agitando hasta disolver. Ajustar el
DEL MEDIO DE CULTIVO pH a 7.0 ± 0.2 a 25°C. Distribuir 10 ml en
tubos estériles. NO AUTOCLAVAR.4

16
 5. Para el aislamiento de Listeria monocytogenes se requiere incorporar
un suplemento de enriquecimiento al medio de cultivo. Conteste:

a) ¿Cuáles son los componentes de dicho suplemento?

b) ¿Cuál es la función de cada componente?

Las sales de fosfato, forman un sistema buffer que evitan cambios bruscos de pH
y así se favorece el desarrollo de Listeria spp. El piruvato de sodio permite
recuperar células dañadas o injuriadas presentes en la muestra. Si se agrega,
acriflavina 0,01 g, ácido nalidíxico 0,04 g y cicloheximida 0,05 g por litro de medio
de cultivo, se logra el enriquecimiento selectivo de Listeria spp.5

c) ¿Cómo se realiza la incorporación del suplemento?

Generalmente se procesan 25 ml o gramos de alimento en 225 mL de Caldo de
Enriquecimiento Bufferado según FDA. Incubación en aerobiosis a 30°C durante
48 horas. Luego subcultivar en Oxford Modificado Agar Base y/o en PALCAM
Agar Base.5

Referencias bibliográficas
1. Acosta S., Valeska S. Manuela de esterilización para centros de salud.
Organización Panamericana de la Salud, Washington DC: 2008.
[INTERNET] Laboao. Precaution for automatic autoclave at work.

17
 [Actualizado el 22 de Marzo del 2016] Disponible en:
https://es.laboao.com/news/technical-knowledge/precautions-for-automatic-
autoclave-at-work
2. Huamán A. Manual de normas de esterilización [Internet]. 1ª ed. Lima:
Minsa; 2012 [consultado el 18 de junio de 2020]. Disponible en:
http://www.hma.gob.pe/calidad/GUIAS-PRAC/GUIAS-15/GUIAS-14/GUIA-
ENFER-2014/Manual%20de%20Normas%20de%20Esterilizacion
%202012%20-22 % 20oct..pdf
3. MacFaddin. 1985. Media for isolation-cultivation-identification- maintenance
of medical bacteria, vol. 1. Williams & Wilkins, Baltimore, Md.Murray P.R.,
Baron, Pfaller, Tenover and Yolken. 1999. Manual of clinical microbiology,
7th ed. American Society for Microbiology, Washington, D.C.
4. American Public Health Association (1976) Compendium of Methods for the
Microbiological Examination of Foods. Fricker CR. (1987) J. Appl. Bact. 63:
99-1 16.
5. [INTERNET] Laboratorio Britania S.A. [Actualizado en noviembre de 2015,
citado en junio 2020] Disponible en:
https://www.britanialab.com/back/public/upload/productos/upl_5a28302de0
321.pdf

INFORME N°2
PRÁCTICA II: TÉCNICAS DE CULTIVO

I. INTRODUCCIÓN
Desde la época de Koch hasta hoy en día se ha incrementado enormemente el
arsenal de medios de cultivo, puesto que resulta fundamental en el estudio de la
microbiología.1,2

18
La ejecución de técnicas microbiológicas con calidad exige reactivos y colorantes
de calidad, así como de medios de cultivo y patrones de referencia óptimos. Para
lograr resultados satisfactorios y deseados en el campo de la investigación, es
necesario disponer de microorganismos que sean capaces de facilitar y garantizar
la calidad en el desarrollo del trabajo. 3
Estos medios pueden ser de diferente composición, según las necesidades
nutricionales del organismo que se busca crecer o aislar. En todo caso, se pueden
clasificar por su estado como medios sólidos, y medios líquidos, según contengan
o no agar respectivamente. Dado que los microorganismos se pueden detectar
casi en cualquier hábitat, los medios de cultivo y los instrumentos deben ser
esterilizados antes de su empleo.4
Existen diversas técnicas de siembra, de las cuales se puede mencionar algunas
de ellas.
En un caldo nutritivo, donde se utiliza una pipeta estéril para tomar muestra de un
caldo nutritivo con crecimiento de organismos.
En agar inclinado, con un asa de platino esterilizada se toma una porción de
muestra de un caldo con crecimiento bacteriano.
Por incorporación, se toma, con una pipeta estéril 1 mL de caldo con crecimiento
y se coloca en el centro de una placa estéril agregándole posteriormente 25 mL
de agar. Por extensión con una pipeta estéril se tomaron 0,1 mL de la muestra de
caldo con crecimiento, agregandolos en el centro de una placa con agar. Luego
con un rastrillo previamente esterilizado con el mechero se procede a distribuir
uniformemente la muestra por toda la superficie del agar.
Por estriado con un asa de platino esterilizada, se toma una muestra de un caldo
con crecimiento, pasándolo por una placa sobre la superficie del agar sub-dividido
en 3 o 4 cuadrantes.5

II. OBJETIVOS
● Identificar y entender la siembra en medio líquido o caldo, sólido y
semisólido.
● Reconocer las técnicas de medio de cultivo que se realiza en cada tipo de
siembra.
● Conocer el procedimiento para el crecimiento bacteriano en medio líquido.

19
III. METODOLOGÍA Y FUNDAMENTOS
FUNDAMENTO
El medio de cultivo constituye el aporte de nutrientes indispensables para el
crecimiento de los microorganismos. La composición precisa dependerá de la
especie que se quiera cultivar, porque las necesidades nutricionales varían
considerablemente. Hay microorganismos muy poco exigentes que crecen bien
en medios de laboratorio normales y microorganismos muy exigentes que
necesitan determinadas sustancias como vitaminas, suero o sangre para crecer.
MATERIALES
● Tubos con azúcar de la semana anterior
● Envases de gelatina de la semana anterior
● Mascarillas
PROCEDIMIENTO
Después de colocarse la mascarilla. Se procederá a observar y determinar si
hubo crecimiento en los medios preparados de la semana anterior.

Tabla 1. Medios de cultivo

Medio líquido Medio Sólido Medio Semisólido

20
 Placa petri con
gelatina
Placa petri con
Tubo con azúcar concentración baja
gelatina concentración
alta

IV. RESULTADOS

Tabla 2. Resultados del Medio de cultivo

Medio líquido Medio Sólido Medio Semisólido

Placa Petri con gelatina

Tubo con azúcar Placa Petri con gelatina
concentración baja
concentración alta

Negativo, no se observó
Enturbiamiento, color Positivo, formación de
movilidad de algún
opaco puntos negros
microorganismo

21
 V. DISCUSIÓN
El medio más utilizado para cultivar las bacterias es el agar-agar. Éste proviene
de las algas rojas (Filo Rodophyta), como las que pertenecen al género:
Gelidium, Euchema, Gracilaria.
En la práctica se observa si hubo crecimiento en los medios de cultivo líquido,
sólido, semisólido preparados en la práctica pasada. Lo cual se confirma el uso de
la gelatina y azúcar como medio casero.
La gelatina es un medio que contiene muchos nutrientes necesarios para que las
bacterias y los hongos se desarrollen normalmente y es mucho más barato. Sin
embargo tiene un pequeño inconveniente las bacterias se entierran en el medio, y
con el paso de los días dificulta su posterior manipulación. Por eso es
recomendable seleccionar la colonia de interés y cultivarla en otra placa petri,
después de unos días.6
Por su parte, la glucosa es la fuente de carbono universal en la mayoría de los
procesos microbianos y el sustrato más ampliamente utilizado en el cultivo del B.
licheniformis para la producción de diversos metabolitos. Se ha informado su
empleo en la síntesis del ácido γ -poliglutámico.7,8

22
VI. CONCLUSIONES
● Se identificó y entendió la siembra en medio líquido o caldo, sólido y
semisólido, teniendo en cuenta que solo una persona debe hacer la
siembra por lo tanto es importante que todo el material que necesitará este
preparado con la debida anticipación.
● Las técnicas de medio de cultivo que se realiza en cada tipo de siembra
depende de la procedencia de cada tipo de muestra que se va realizar si es
sólido, semisólido y líquido o caldo.
● Para el crecimiento bacteriano en medio líquido se debe de introducir en el
caldo de cultivo haciendo movimientos de rotación, en medio semisólido se
debe introducir verticalmente a una profundidad aproximada ⅔ del medio y
en un medio sólido se debe observar que no estén presentes gotas de
agua en la superficie del medio, si lo hubiera eliminarlas colocando las
placas en la estufa durante 20 a 30 minutos.

VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Miranda C, López L. Lloret A., Farga A., Recomendaciones sobre el

aseguramiento de la calidad de medios de cultivo y reactivos. CCI-SEIMC-
02. En: Gimeno Cardona C. Recomendaciones generales para el control de
calidad interno en Microbiología Clínica. CCI-SEIMC-00. versión 1
[Internet]. Valencia: Grupo colaborador GEGMIC; 2004 [citado: 1 de julio de
2020]. p. 22. Disponible en:
http://www.seimc.org/grupos/gegmic/fuentes/gegmic_dyc1_2004.pdf
2. Arora D., Quality assurance in microbiology. Indian J Med Microbiol
[Internet]. 2004[citado: 1 de julio de 2020];22(2):81-6. Disponible desde:
http://www.ijmm.org/article.asp?issn=0255-
0857;year=2004;volume=22;issue=2;spage=81;epage=86;aulast=Arora
3. Ortega Y, Quevedo F. Control de la calidad en los laboratorios de
microbiología sanitaria. 1 ed, México DC: OPS/OMS,
1991:p.152[ STANDARDIZEDENDPARAG]
4. Gamazo C, López-Goñi I, Díaz R. Manual práctico de microbiología.

23
 Tercera edición. Barcelona: Editorial MASSON; 2005. p 235.
5. Khrisaeroth K. Técnicas básicas de siembra y observación de
microorganismos — Steemit [Internet]. Steemit.com. 2018 [citado: 1 de julio
de 2020]. Disponible en: https://steemit.com/stem-
espanol/@khrisaeroth/tecnicas-basicas-de-siembra-y-observacion-de-
microorganismos
6. Ewing W., Edwards and Ewing's Identification of Enterobacteriaceae. 4ª ed.
Elsevier Science Publishing Co., New York 1986.
7. Bajaj, I.; Singhal, R. Poly (glutamic acid) - An emerging biopolymer of
commercial interest. Bioresource Technol 102: 5551-5561, 2011.
8. Ko, Y. ; Gross, R. Effects of glucose and glycerol on -poly (glutamic acid)
formation by Bacillus licheniformis ATCC 9945A. Biotechnol Bioeng 57(4):
430-437, 1998.

ANEXO
CUESTIONARIO 2
1. ¿Por qué es importante evitar que la aguja se introduzca bajo la
superficie del agar cuando siembra en medio inclinado o semisólido?

24
La superficie inclinada del agar les da a las bacterias una mayor superficie donde
pueden crecer dentro del tubo de ensayo.
En esta siembra se debe tener mayor cuidado, puesto que un contaminante del
aire puede superar en crecimiento al microorganismo de estudio, además si la
aguja se introduce bajo la superficie del agar, esta se rompe, afectando la
esterilidad y medio de cultivo para el crecimiento de microorganismos; por lo que
también es importante mantener inclinado el tubo que contiene el cultivo que se
va a transferir, de modo que los microorganismos del aire caigan en las paredes
externas del tubo y no en la boca de este. 1

2. ¿Solo se puede sembrar utilizando el asa de kolle? Fundamente y cite

ejemplos
a. Asa en argolla o anillos, no calibrada.
Generalmente son de alambre de nichrome. Sirve para la siembra
por estrías e inoculaciones en general.
b. Asa recta o en hilo.
Sirve para trasladar una sola colonia a medios de identificación, o
sub-cultivo.
c. Asa de platino en anillo.
Calibrada para tomar 0.001 ml, para uro-cultivo.
d. Asa espatulada.
Para manipular colonias duras y tomar muestras.
e. Asa de alambre grueso en “L”
Para purificar colonias de hongos y procedimientos especiales.
f. Aguja de disección con punta aguda.
Para purificar colonias pequeñas y distribuir las preparaciones de
hongos en fresco.2

3. Investigue y complete el cuadro:

MEDIO DE CULTIVO BACTERIA DESCRIPCIÓN DE

COLONIA

25
 Una colonia típica de S.
Agar Baird Parker Staphylococcus aureus
Aureus es circular, de 2-3
mm de diámetro, de color
negro azabache a gris
negro, y está rodeada de
un halo opaco y una zona
clara. Las colonias que
son grises o aquellas sin
halos o zona despejada
pueden considerarse
sospechosas de S.
aereus.3

Agar Mc Conkey Escherichia coli Colonias rosáceas con

halo turbio.4

Agar EMB Escherichia coli Colonias de 2 a 4 mm de

diámetro, un centro
grande de color oscuro
hasta negro, tiene un
brillo verde metálico
cuando se observan en
luz refleja.4

Agar Manitol Sal Staphylococcus aureus Colonias amarillas de

tamaño mediano,
rodeadas de una zona
del mismo color.5

Crece en colonias
Agar Endo Klebsiella pneumoniae
mucosas rosáceas más
grandes.6

26
 4. Señale dos bacterias que presentan pigmento en un medio de cultivo
general.

Los medios de cultivo general contienen nutrientes que favorecen el desarrollo de

la mayoría de los microorganismos sin requerimientos especiales y sin brindar
ventaja alguna en el crecimiento de un microorganismo en particular.
-Streptococcus agalactiae
-Flavobacterium psychrophilum: En el medio Agar Anacker & Ordal (AOA), F.
psychrophilus produce colonias convexas, brillantes, con borde entero o difusos
que no se adhieren al agar y que producen un pigmento amarillo no difusible del
tipo flexirrubina.7

a. ¿Cómo se puede conservar una cepa por tiempo prolongado?

¿Qué consideraciones hay que tener?
Los métodos recomendados para preservar el microorganismo por períodos
mayores a dos años son la criopreservación o ultracongelación y la liofilización.
Aunque la inversión inicial para adquirir el equipamiento es significativa, debemos
considerar que esta metodología es menos laboriosa, más efectiva, requiere
menos espacio para el almacenamiento y principalmente reduce
significativamente la probabilidad de ocurrencia de mutaciones, aunque ha sido
documentada la pérdida de elementos genéticos móviles durante el
almacenamiento a temperaturas de -80ºC.
Durante la criopreservación y la liofilización, las células microbianas son
expuestas a temperaturas de congelamiento que promueven la formación de
cristales de hielo tanto en la suspensión como dentro de las células, provocando
un desequilibrio osmótico que induce cambios bioquímicos y físicos, por ejemplo,
la ruptura de membranas celulares que lleva a muerte celular. Para proteger a los
microorganismos del daño producido durante el proceso de congelamiento,
liofilización y descongelamiento, se añaden a la suspensión del cultivo, agentes
químicos denominados crioprotectores (criopreservación) o lioprotectores
(liofilización). La tasa de éxito de un determinado método de crioconservación
depende de muchos parámetros. Desafortunadamente, la preservación de
material biológico es un campo de investigación netamente empírica, con

27
informes principalmente sobre una cepa o especie en particular. Además, es
ampliamente reconocido que diferentes especies de bacterias, incluso cepas
dentro de una misma especie pueden exhibir gran variabilidad en la tasa de éxito
de las diferentes condiciones de conservación. Aunque los métodos de
ultracongelación y liofilización han demostrado buenos resultados en términos de
viabilidad y mantenimiento de la integridad genética, es necesario profundizar la
optimización de protocolos, condiciones, y el uso de otros agentes crioprotectores
o lioprotectores con un grupo más diverso de microorganismos.

VENTAJAS Y DESVENTAJAS DE LOS MÉTODOS DE PRESERVACIÓN

A LARGO PLAZO

28
Referencias bibliográficas
1. Patrones de crecimiento en agar inclinado [Internet].
Labdemicrobiologia.wixsite.com. 2019 [consultado el 1 de julio de 2020].
Disponible en: https://labdemicrobiologia.wixsite.com/scientist-
site/patrones-de-crecimiento-en-agar-inclinad
2. Asas microbiológicas y su uso [INTERNET], [Actualizado en 5 de octubre
de 2014, citado en 30 de junio 2020] Disponible en:
http://microbiologia3bequipo5.blogspot.com/2014/10/asas-microbiologicas-
y-su-uso.html
3. Malbrán C., MANUAL DE PRESERVACIÓN : Colección de Cultivos Servicio
Bacteriología Especial, Instituto Nacional de Enfermedades Infecciosas, Edición

29
 2018, Revisado: el 1 de julio del 2020. Disponible en: http://www.anlis.gov.ar/wp-
content/uploads/2018/11/manual-CCBE-2018.pdf
4. Yousef A, Carlstrom C. Food Microbiology: A laboratory Manual. 1ra edición.
New Jersey: Editorial John Wiley & Sons; 2003. p 123.
5. Becton Dickinson GmbH. Instrucciones de uso-medios en placas listos para usar:
BD Mannitol Salt Agar. Revisado: Abril del 2013.
6. Yousef A, Carlstrom C. Food Microbiology: A laboratory Manual. 1ra edición.
New Jersey: Editorial John Wiley & Sons; 2003. p 207.
7. Jay M., et al., 2005. Modern Food Microbiology. 7ª ed. Springer, New York,
p 13.

INFORME N°3
PRÁCTICA III: Tinciones Microbianas

I. INTRODUCCIÓN

30
En microbiología el microscopio se utiliza de forma rutinaria, ya que proporciona
importante información para la identificación temprana y definitiva de los
microorganismos.1

El tamaño de la mayoría de las células bacterianas es tal que resultan difíciles de

ver con el microscopio óptico. La principal dificultad es la falta de contraste entre
la célula y el medio que la rodea, y el medio más simple de aumentar el contraste
es la utilización de colorantes. Estos pueden emplearse para distinguir entre tipos
diferentes de células o para revelar la presencia de determinados constituyentes
celulares, tales como flagelos, esporas, cápsulas, paredes celulares, centros de
actividad respiratoria, etc.2

El examen microscópico requiere la utilización del microscopio. Puede hacerse

una visualización microscópica en 2 momentos: a) directamente de la muestra
clínica y b) a partir de los microorganismos obtenidos por cultivo como primer
escalón en la identificación.3

Las tinciones se pueden clasificar como simples cuando toda la muestra se tiñe
del mismo color y se utiliza un solo colorante (azul de lactofenol o tinta china);
tinción diferencial, cuando se visualiza más de un color porque se utiliza más de
un colorante (Gram o Ziehl-Neelsen); tinción específica, cuando se utilizan
anticuerpos marcados con una molécula fluorescente para identificar una
estructura celular en particular (inmunocitoquímico). 4

En una bacteria por su menor tamaño es difícil la diferenciación o resolución de

estructuras en su interior, además de que no están tan bien diferenciadas como
sucede en las células superiores.5

Entre algunos tipos de tinciones principales en el laboratorio de microbiología

tienen:

● Tinción simple: colorantes básicos, colorantes ácidos.

● Tinción diferencial: tinción gram, tinción acidorresistente.
● Tinción de estructuras: tinción de pared celular, flagelos, endosporas,
cápsulas.5

31
Las tinciones utilizadas en el laboratorio de microbiología permiten el diagnóstico
oportuno y sugerente de los agentes infecciosos, por lo que juegan un papel
importante en la decisión del tratamiento inicial de las enfermedades infecciosas.
Se debe practicar la tinción adecuada de acuerdo con el agente infeccioso en
sospecha y el tipo de muestra clínica. Las tinciones son herramientas
elementales, vigentes y de uso universal que coadyuvan al diagnóstico
microbiológico.6

II. OBJETIVOS
● Conocer los pasos para realizar un frotis bacteriano
● Describir las diferentes tinciones de algunas estructuras bacterianas con
énfasis en la tinción simple, gram y ácido - alcohol resistente
● Establecer cuándo se debe utilizar la tinción microbiana
● Comprender las etapas para la observación microscópica de un frotis
bacteriano
III. METODOLOGÍA Y FUNDAMENTOS
FUNDAMENTO: Tinción Negativa

No se trata de una tinción propiamente dicha ya que no se utilizan colorantes con

cromóforos, ni se lleva a cabo ninguna reacción entre estructuras celulares y los
colorantes. En este caso el frotis se hace con una gota de una solución de
nigrosina o tinta china, ambos son productos particulados, insolubles, que
formarán una película opaca a la luz. En este tipo de tinción se prescinde de la
fijación por calor, se deja secar la preparación y se observan los microorganismos
brillantes sobre un fondo oscuro.7

32
 Fig 1. Tinción negativa de Bacillus cereus. Microscopía óptica de campo
claro (100x).

FUNDAMENTO: Tinción Simple

La tinción simple nos proporciona exclusivamente información acerca de la forma,

tamaño y tipo de agrupación de los microorganismos. Sin embargo tiene la
ventaja de ser un método muy sencillo y rápido.7

Materiales: Cultivos bacterianos de Staphylococcus aureus, frasco lavador,

cristalizador, soporte y colorantes (cristal violeta), asa de siembra, aceite de
inmersión.

Procedimiento:

● Poner sobre un portaobjetos una gota de agua y una pequeña alícuota de

un cultivo bacteriano con el asa de siembra estéril.
● Hacer el frotis, formando una película homogénea sobre el portaobjetos
con el asa de siembra.
● Dejar secar.
● Fijar la preparación, pasando a través de la llama del mechero el
portaobjetos.
● Cubrir con una película de colorante (cristal violeta o safranina) durante 1
minuto.
● Lavar el exceso de colorante con agua.

33
 ● Dejar secar al aire.
● Añadir una gota de aceite de inmersión.
● Observar con objetivo de inmersión (100x).

Fig.2 Tinción simple con cristal violeta de Staphylococcus aureus.

Microscopio óptico de campo claro (100x).

Tinción diferencial

A) FUNDAMENTO: Tinción de Gram

La diferente estructura y organización de la pared celular en estos dos tipos de

organismos hace que ambos grupos responden de manera distinta, así mientras
las bacterias gram positivas mantienen y conservan el complejo cristal violeta-
iodo, las bacterias gram negativas se decoloran rápidamente con la aplicación del
alcohol, admitiendo el colorante de contraste que proporciona un color entre rosa
y rojo que contrasta con el intenso color violeta. 7

Materiales:

Cultivos de bacterias gram positivas: Bacillus cereus y gram negativas:

Escherichia coli, frasco lavador, cristalizador, soporte, portaobjetos, asa de
siembra, cristal violeta, safranina, lugol y alcohol, aceite de inmersión.

34
Procedimiento:

Tabla 1. Representación esquemática del procedimiento de la tinción de Gram.

35
 Fig 3. Tinción de Gram de Bacillus cereus (bacilos gram positivos).
Microscopía de campo claro (100x)

Fig 4. Tinción de Gram de Escherichia coli (bacilos gram negativos).

Microscopía de campo claro (100x)

B) FUNDAMENTO: Tinción ácido alcohol-resistente

36
Estas bacterias son resistentes al tratamiento con alcoholes y ácidos suaves
conservando el colorante fundamental, mientras que organismos que no posean
esta característica son rápidamente decolorados y pueden teñirse con el colorante
de contraste en este caso azul de metileno.7

Materiales:

Cultivos de micobacterias: Mycobacterium phlei, vaso lavador, cristalizador,

soporte, portaobjetos, hisopo de lana de vidrio, asa de siembra, fucsina fenicada,
azul de metileno, ácido nitrico al 33% y alcohol de 96 º, aceite de inmersión.

Procedimiento:

Tabla 2. Procedimiento de la tinción ácido-alcohol resistencia

Fig 5. Aplicación de calor a la preparación con un hisopo de lana de vidrio

37
Fig 6.Tinción de ácido-alcohol resistentes (Ziehl-Neelsen) de Mycobacterium
phlei. Las flechas señalan estos bacilos ácido-alcohol resistentes teñidos de
rojo. Microscopía de campo claro (100x)

Tinción de estructuras microbianas

A) Tinción de cápsulas

Materiales:

Azotobacter vinelandii.

Procedimiento:

El procedimiento para la realización de la tinción de cápsulas es el mismo que se

ha explicado para la tinción negativa. Las cápsulas aparecen rodeando a las
células como estructuras sin teñir sobre un fondo oscuro .

38
 Fig 7. Tinción de cápsulas de Azotobacter vinelandii. Las flechas indican
estas estructuras. Microscopía de campo claro (100x)

B) Tinción de esporas

Material:

Cultivos de Bacillus subtilis, vaso lavador, cristalizador, soporte, portaobjetos, asa

de siembra, verde malaquita y safranina, hisopo de lana de vidrio, alcohol de 96,
aceite de inmersión.

Procedimiento:

Tabla 3. Procedimiento de la tinción de espora.

39
 Fig 8. Tinción de esporas de Bacillus subtilis. La flecha indica esta
estructura en verde. Microscopía de campo claro (100x)

IV.

40
V. RESULTADOS
Tabla 4. Tabla de observaciones.

OBSERVACIONES AL MICROSCOPIO

Bacterias Gram (-) en forma de Bacilos Bacterias Gram (+) en forma de

estafilococo

Clostridium tetani Clostridium sp.

Bacteria Gram (+) en forma de bacilo Forma de bacilo Gram (+)

esporulado.

41
 Streptococcus sp. Lactobacillus acidophilus

Bacterias Gram (+) en forma de coco Bacteria Gram (+) en forma de

en cadena. bacilos aislados o también en
pares.

Bacillus anthracis Micrococcus luteus

Bacterias Gram (+) en forma de Bacteria Gram (+) en forma de

Bacilos en cadena racimos de cocos.

42
 Pseudomonas aeruginosa Escherichia Coli

Bacterias Gram (-) en forma de bacilos Bacteria Gram (-) en forma de

bacilos agrupados

Cápsula de Streptococcus Esporas con verde de malaquita

pneumoniae
Tinción de esporas por la técnica
Tinción negativa de cápsula con de Wirtz
nigrosina
Esporas libre y bacteria
esporulada

VI. DISCUSIÓN

La tinción Gram es un tipo de tinción diferencial. La tinción Gram distingue dos

grupos de bacterias: Las bacterias Grampositivas que presentan una pared
celular gruesa de peptidoglicano, pero no cuenta con membrana celular externa, y
las Gramnegativas, presenta una capa delgada de peptidoglicano a los que se le
superpone una capa denominada membrana externa. 8 La tinción de Gram se

43
basa en colocar como colorante primario cristal violeta, el cual tiene afinidad con
el peptidoglicano de la pared bacteriana. Posteriormente, se coloca lugol, el cual
sirve como mordiente e impide la salida del cristal violeta por la formación de un
complejo cristal violeta-yodo que satura los espacios del peptidoglicano de la
pared bacteriana. En seguida, se coloca una mezcla de alcohol-acetona, la cual
deshidrata la pared bacteriana y cierra los poros de la misma, también destruye la
membrana externa de las bacterias Gram negativas debido a que ésta es soluble
a la acción de solventes orgánicos, como la mezcla de alcohol-acetona. Las
bacterias Grampositivas, al contener una gran cantidad de peptidoglicano,
retienen con mayor fuerza este complejo, mientras que las Gramnegativas no lo
pueden retener por tener menos cantidad de peptidoglicano. Por último, se coloca
safranina, la cual funciona como un colorante secundario o de contratinción y
sirve para teñir las bacterias que no pudieron retener el complejo cristal violeta-
yodo. Las bacterias Grampositivas se observan de color azul oscuro a morado,
mientras que las Gramnegativas se observan de color rosa a rojo. 9

Según la tinción Gram en la bacteria Clostridium tetani, se observó un

microorganismo de forma alargada con un notorio bulto en su interior y una
coloración violeta. El Clostridium tetani es una bacteria Grampositiva en forma de
bacilo y en su forma esporulada se presenta como Gramnegativo. Es por esto que
en la práctica se observó esta coloración violeta por ser Grampositiva, que al
contener una gran cantidad de peptidoglicano, retienen con mayor fuerza el
complejo cristal violeta-yodo. La endospora de Clostridium tetani no se tiñen con
los colorantes, requieren de colorantes especiales como la de Wirtz, con la tinción
de Gram solo se observa el perfil de la espora sin teñir. 10

Los Streptococcus sp. son bacterias esféricas u ovoides que crecen en pares o en
cadenas, son Gram Positivos, no formadores de esporos. En la práctica se
apreció la bacteria en forma de cocos en cadena y una coloración violeta,
característica por ser una bacteria Gram positiva. 10

La Lactobacillus acidophilus son bacterias ácido lácticas. El Streptococcus

pneumoniae es un coco Gram Positivo, encapsulado. Se presenta forma

44
lanceolada y se caracteriza por su agrupación en pares o en cadenas cortas.
Tiene una pared de peptidoglicano que rodea a la membrana citoplasmática.

Para la tinción de esporas por técnica de Wirtz se compara con la técnica de

Shaeffer-Fulton, el verde de malaquita es un colorante débilmente básico (tiene
una carga positiva débil) y por tanto, se une débilmente a la bacteria. Penetra en
las células vegetativas. Cuando se calienta la preparación también penetra las
endosporas. Esta técnica confirma que se observa Esporas teñidas de verde y
células vegetativas teñidas de rosa. De la misma manera la forma, tamaño
relativo y posición de la espora en la célula vegetativa. 11

VII. CONCLUSIONES
● Se conocieron los tres pasos para la frotis bacteriana siendo el primero
extension, secado y fijación.
● En la tinción simple se utiliza un solo colorante, por lo que todas las
estructuras celulares se tiñen con la misma tonalidad a diferencia de la
tinción ácido - alcohol - resistente estas bacterias no se tiñen con los
colorantes convencionales sino que se fuerza la tinción con fucsina a
través del calentamiento de la preparación.
● Para ver varias estructuras de las células bacterianas deben usarse
métodos de tinción especiales como: tinción de endosporas, tinción de
pared celular, tinción de flagelos y tinción de cápsula.
● Se comprendió las etapas de la frotis bacteriana siendo la primera la
extensión en el cual se toma la muestra con el asa estéril y se suspende en
solución salina fisiológica, la segunda de secado en donde se deja secar la
lámina a temperatura ambiente y la tercera de fijación en el que la lámina
se pasa tres veces por la llama de mechero con la capa de frotis hacia
arriba.

VIII.

45
IX. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Decré D, Barbut F, Petit JC. Role of the microbiology laboratory in the
diagnosis of nosocomial diarrhea. Pathol Biol (París). 2000; 48: 733-744.

2. Técnicas de tinción [Internet]. Microinmuno.qb.fcen.uba.ar. 2020 [citado

9 julio 2020]. Disponible desde:
http://www.microinmuno.qb.fcen.uba.ar/SeminarioTinciones.htm

3.Keller PJ. Imaging morphogenesis: technological advances and biological

insights. Science. 2013; 340: 123-168.

4.Guarner J, Brandt ME. Histopathologic diagnosis of fungal infections in

the 21st century. Clin Microbiol Rev. 2011; 24: 247-280.

5. Tinciones microbianas. 1a ed. Lima: Dpto de Microbiología general,

UNMSM; 2020.

6. López-Jácome L, Hernández-Durán M, Colín-Castro C, Ortega-Peña S,

Cerón-González G, Franco-Cendejas R. Las tinciones básicas en el
laboratorio de microbiología [Internet]. Medigraphic.com. 2014 [citado 9
julio 2020]. Disponible desde: https://www.medigraphic.com/pdfs/invdis/ir-
2014/ir141b.pdf

7. Vázquez C. Martín A. Técnicas básicas de Microbiología Observación de

bacterias Reduca (Biología). Serie Microbiología. 2010 3 (5): 15-38

8. Rodríguez E, Gamboa M, Hernández F. Bacteriología General.

Principios y prácticas de laboratorio. 1a ed. San José: Editorial UCR; 2005.

9. López L, Hernández M, Colín C. Las tinciones básicas en el laboratorio

de microbiología. Investigación en discapacidad, Ciudad de México: 2014,
Enero. Vol 3. pp 10-18.

10. Tulio J., Prado D. ,Microbiología lo esencial y lo práctico, 2005, 1ra

Edición, Guatemala

11. Universidad de Granada, Métodos y Tinciones [Internet], [citado: 13 de

julio del 2020], disponible: https://www.ugr.es/~pomif/pom-bac/pb-iii/pb-iii-3-
esporas.htm

46
ANEXO

CUESTIONARIO 3
1. En la estructura química de Azul de metileno señale cómo se da su
disociación y en que ion reside el calor.

47
 El azul de metileno posee una masa molecular de 373,9 g/mol, lo que
corresponde a clorhidrato de azul de metileno con tres grupos de agua
como lo muestra su fórmula química C16H18N3SCl.3H2O. El carácter
catiónico de su molécula se debe a las cargas positivas del nitrógeno que
esta posee como se observa en la imagen. 1

Sumado a esto, el azul de metileno pertenece a un grupo de colorantes

conocido como fotosensibilizador, ya que a la luz visible (en el rango de
585-670 nm) excita la estructura de fenotiazina a un estado de radical libre
o triplete. Adicionalmente, este colorante en solución en estado triplete
pasa a electrones oxígeno diatómico permitiendo la formación de radicales
superóxidos, una molécula biológicamente dañina capaz de oxidar ADN,
polisacáridos y lípidos directamente o por generación secundaria de otros
radicales.1

2. En el área de control de calidad en qué casos podría utilizar la tinción

simple y la diferencial. Fundamente su respuesta

El control de calidad de los métodos tintoriales es importante, ya que así se

asegura que la preparación de la muestra haya sido adecuada, por lo que
se recomienda realizar al mismo tiempo de la evaluación de la muestra
clínica, la tinción de un agente infeccioso ya identificado mediante esa
tinción, el cual funcionará como un control positivo.

En la tinción simple pueden teñir positivamente ciertos componentes como

las proteínas.

48
 En la tinción diferencial consisten en la aplicación de dos colorantes que
contrastan en su intensidad o color y un paso intermedio que provoca una
respuesta diferente entre microorganismos distintos o entre determinadas
células dentro de una población. La diferenciación puede ser provocada
por un agente químico o físico, permitiendo observar dos tipos de
respuestas diferentes a la tinción en una misma muestra. 2,3

3. Señale 3 precauciones que el analista debe tener en cuenta para hacer

el frotis de muestras: viscosas o grumosas
- Colocar una gota de solución salina fisiológica (SSF) en el
portaobjetos para facilitar la homogeneización y extensión de la
muestra grumosa.
- Seleccionar el tipo de asa estéril adecuado para facilitar la toma de
la muestra, de lo contrario podría desprenderse la muestra del
filamento del asa debido a su viscosidad en el laboratorio
microbiológico, generando un peligro de contaminación.
- Considerar la variación de la viscosidad de la muestra al someterse
al calor del mechero, durante el proceso de fijación del frotis.
4. ¿Se pueden cambiar los colorantes inicial y de contraste en la tinción
gram? Fundamente su respuesta

Los microorganismos que se tiñen débilmente de Gram negativos con la

tinción de Gram-Hucker, como ciertos anaerobios, Legionella sp,
Campylobacter sp y Brucella sp, pueden teñirse mucho mejor si se usa la
modificación que realizó Kopeloff a la tinción de Gram-Hucker, denominada
tinción de Gram-Kopeloff.

Esta técnica cambia el colorante de safranina por fucsina básica. Con esta
modificación es posible colorear eficazmente a los microorganismos antes
mencionados.

Las levaduras también se distinguen con esta coloración. Ellas toman el

cristal violeta, es decir, se tiñen de Gram positivo. Por otra parte, se pueden
distinguir bacilos Gram positivos formadores de esporas, en el que se
observa un espacio claro dentro del bacilo, donde se formó la endospora,

49
 aunque las esporas no se tiñen bien. Para teñir esporas se usa otras
técnicas como Shaeffer-Fulton. Cabe destacar que esta tinción no sirve
para colorear todo tipo de bacterias, es decir, existen casos en el que la
tinción no funciona.4

5. Indique que tinciones podría utilizar para observar hongos

Tinciones simples

● Safranina: útil para el estudio de cultivos y productos biológicos

líquidos. Los elementos fúngicos se tiñen de color rojo intenso y el
resto del campo toma un tono incoloro o rosa pálido.

● Azul de algodón: es útil para realizar el examen directo de cultivos,

ya que es una técnica rápida que permite visualizar perfectamente
las estructuras fúngicas.

50
● Anaranjado de acridina: se utiliza para la detección de hongos y
bacterias en muestras clínicas. El pigmento se intercala en el ácido
nucleico con PH neutro las bacterias, los hongos y el material celular
se tiñen de naranja rojizo; con PH ácido las bacterias y los hongos
se mantienen de color naranja rojizo pero el material de fondo se
tiñe de amarillo verdoso.

● Tinción de azul de algodón de lactofenol: La tinción de azul

algodón de lactofenol no es considerada una tinción diferencial, sin
embargo, posee características tintoriales que permiten observar
cada uno de los componentes fúngicos y apreciar fácilmente las
estructuras para una adecuada identificación. El fenol inactiva las
enzimas líticas de la célula e impide que ésta se rompa; de igual
forma, destruye la flora acompañante e inactiva a la célula,

51
 quitándole el grado de patogenicidad; además, actúa como
mordiente cuando se usa en combinación con colorantes.

El ácido láctico preserva las estructuras fúngicas al provocar un

cambio de gradiente osmótico con relación al interior fúngico, lo que
genera una película protectora. El azul de algodón es un colorante
ácido, que tiñe el citoplasma y la quitina presente en las células
fúngicas, mientras que el glicerol mantiene húmeda la preparación.
Una vez preparado el colorante, se debe colocar la muestra
microbiológica en un portaobjetos por medio de una impronta
(proceso en el cual se coloca una impresión de la muestra sobre una
estructura utilizando una cinta adhesiva transparente). 5

Referencias bibliográficas
1. Meléndez N, Navarro M. Evaluación de la degradación de azul de metileno
mediante la técnica de oxidación de aire húmedo con peróxido de
hidrógeno empleando óxidos mixtos de Mn, Cu y/o Fe como catalizador
para el tratamiento de aguas residuales provenientes del laboratorio de
microbiología de la Pontificia Universidad Javeriana [Ingeniero químico].
Fundación Universidad de América Facultad de Ingenierías; 2019.
2. Vázquez C. Martín A. Técnicas básicas de Microbiología Observación de
bacterias Reduca (Biología). Serie Microbiología. 2010 3 (5): 15-38
3. Lopez L. et al. Las tinciones básicas en el laboratorio de microbiología
Investigación en Discapacidad 2014 3(1): 10- 18
4. Koneman E, Allen S, Janda W, Schreckenberger P, Winn W. (2004).
Diagnóstico Microbiológico. (5ta ed.). Argentina, Editorial Panamericana
S.A.
5. López L., Hernández M., Colín C., Ortega S., Cerón G., Franco Las
tinciones básicas en el laboratorio de microbiología. Investigación en
Discapacidad. 2014; 3 (1):10-18.

52
 INFORME N°4
PRÁCTICA IV: Genética microbiana. Acción de agentes físicos y
químicos

I. INTRODUCCIÓN
Las circunstancias físicas y químicas en que los microorganismos se encuentren
tienen una influencia favorable o desfavorable decisiva en su crecimiento y
desarrollo. Para obtener el desarrollo óptimo de los microorganismos, no solo son
indispensables los requerimientos nutricionales, sino otros factores ambientales
tanto físicos como químicos. El crecimiento de los microorganismos se modifica al
cambiar los factores ambientales. El conocimiento de estos factores limitantes del
crecimiento microbiano se puede utilizar para su control y explicarnos la
distribución de los microorganismos.1

Los agentes físicos que más influencia tienen en la fisiología de los

microorganismos son: la temperatura, la humedad, las radiaciones y los agentes
mecánicos. La temperatura es uno de los factores físicos más importantes que
afectan directamente el funcionamiento de las enzimas bacterianas, mismas que
se inactivan por debajo de la mínima y por encima de la máxima. La temperatura
óptima de crecimiento de un microorganismo es la temperatura a la cual se
multiplica a su máxima velocidad. Los microorganismos varían ampliamente en
cuanto a su susceptibilidad a temperaturas elevadas. 2

El efecto destructivo del calor sobre las bacterias está en relación con el grado de
humedad del ambiente, así se distingue entre calor húmedo y calor seco. El calor
húmedo tiene un efecto mayor sobre las bacterias, porque el agua es un buen
conductor, destruye los microorganismos por coagulación y desnaturalización de
las estructuras proteicas y enzimas. La ebullición a 100°C aplicados durante 10-
30 minutos, destruye toda forma vegetativa de las bacterias. 2

En las radiaciones UV, los procesos bactericidas de la luz UV son múltiples, por
un lado alteran las bases púricas y pirimidínicas del ADN, por otra, producen
ozono en contacto con el aire, actuando sobre las bacterias para finalmente
producir agua oxigenada, siendo esta nociva para las bacterias. En radiaciones

53
ionizantes como gamma, inactivan el genoma bacteriano y la bacteria muere.
Permiten la radioesterilización o esterilización en frío. 2

Un agente químico es una sustancia que se caracteriza por tener una

composición molecular definida y que causa una reacción. Por ejemplo los
compuestos fenólicos, loa acoholes, los halógenos y sus derivados como el cloro,
el bromo y el yodo; los metales pesados y sus compuestos, los detergentes, los
aldehídos y los quimioesterilizantes gaseoso como el óxido de etileno. 3

En agentes químicos se usan desinfectantes y antisépticos . Los desinfectantes

son aquellas sustancias capaces de destruir en 10-15 minutos los gérmenes
depositados en un material inerte o vivo. Los antisépticos son sustancias que se
oponen a la existencia o desarrollo de gérmenes. Los agentes químicos
inorgánicos tienen efecto sobre las bacterias por su acción oxidante o disolución
de iones, como ácidos y álcalis, sales minerales u oxidantes. En los oxidantes lo
más usados son los compuestos halogenados como el yodo que se usa en una
solución alcohólica. En caso de los agentes químicos orgánicos, los alcoholes
como el etílico tienen poder deshidratantes y desnaturalizantes sobre las
proteínas bacterianas.3

II. OBJETIVOS
● Lograr observar el efecto de la luz UV sobre el crecimiento bacteriano.
● Aislar un mutante resistente a estreptomicina.
● Observar el comportamiento de las cepas de estudio, bajo los efectos de la
ebullición.
● Comprobar la acción de los agentes químicos (antisépticos y
desinfectantes) frente a las cepas de trabajo.

III. METODOLOGÍA Y FUNDAMENTOS

PRÁCTICA 1: OBTENCIÓN DE MUTANTES RESISTENTES A LA LUZ

ULTRAVIOLETA

FUNDAMENTO:

54
Existen radiaciones que son muy mutágenas. Como las radiaciones
electromagnéticas mutágenas no ionizantes y las ionizantes. Las radiaciones no
ionizantes como la ultravioleta (UV) se usan mucho más. La radiación ultravioleta
entre 220 nm y 300 nm es absorbida por el DNA y puede causar mutaciones y
otros graves efectos en el DNA que llevan a la muerte al organismo expuesto. 4

La radiación ultravioleta (UV) ejerce un efecto nocivo sobre el ADN de muchos

microorganismos, principalmente la luz UV-C.5

MATERIALES

▪ Cultivos en caldo nutritivo de Escherichia coli, Klebsiella, Staphylococcus aureus

y Bacillus subtilis

▪ Placas de TSA

▪ Lámpara de luz UV

▪ Espátulas de vidrio (Drigalsky)

PROCEDIMIENTO

▪ Aplicar 0,1 mL de la suspensión bacteriana en la placa de TSA y hacer una

extensión con una espátula de vidrio.

▪ Dividir las placas en cuadrantes con ayuda del marcador.

▪ Exponer las placas destapadas a la luz UV; manteniendo constante la distancia

de 50 cm a los tiempos de 0, 5, 10 y 15 minutos.

▪ Hacer el experimento por duplicado y a una de las placas envolverla con papel
Kraft antes de incubar.

▪ Llevar a incubar las placas a 37 ºC por 24 horas.

PRÁCTICA 2: OBTENCIÓN DE MUTANTES RESISTENTES A ANTIBIÓTICOS

FUNDAMENTO

La resistencia bacteriana adquirida, es la forma más habitual de su presentación y

puede ser por mutación o por la adquisición de nuevos genes. La resistencia por
mutación sólo afecta a un pequeño porcentaje (del 1% al 2%) de cepas aisladas

55
en clínica. El fenómeno de la mutación aparece espontáneamente con una
frecuencia de 106 a 109, según el tipo de bacterias y las características
ambientales. La contribución del antibiótico es seleccionar los mutantes que
aparecen en la población bacteriana sensible. 6

Las mutaciones cromosómicas pueden conferir resistencia simultánea a varios

antibióticos pertenecientes a familias diferentes, haciendo inútil la aplicación de
una terapia antibiótica múltiple. En efecto, en el medio hospitalario se aíslan
regularmente gérmenes multirresistentes a los betalactámicos, cloranfenicol,
trimetropin y tetraciclinas. La causa de esta multirresistencia es la mutación que
modifica unas moléculas llamadas porinas que permiten el paso de estos
antibióticos a través de la pared bacteriana y provocan la impermeabilidad de la
célula bacteriana. Este tipo de resistencia se da con particular frecuencia en
algunas enterobacterias como Klebsiella, Enterobacter y Serratia.6

MATERIALES

● Placa de Petri estéril

● Varilla de vidrio o de madera (1,6 cm en diámetro)

● 2 tubos de agar TSA que contienen de 6 a 7 mL de agar

● 1 tubo de agar TSA que contiene 0,05 mg de estreptomicina en 6 a 7 mL de

agar Pipeta de 1 mL con pipeteador

● Cultivo de caldo TSB de 24 horas de Staphylococcus aureus (ATCC 25903)

● Alcohol etílico de 95%

● Varilla de extensión

● Tubos de caldo TSB

● 2 tubos de caldo TSB que contienen 0,01 mg de estreptomicina en 6 a 7 mL

de caldo

● 2 tubos de caldo TSB que contienen 0,05 mg de estreptomicina en 6 a 7 mL

de caldo

PROCEDIMIENTO

56
A. Primer periodo

1. Preparación de placa de “gradiente en placa”

a. Colocar una placa de Petri estéril en ángulo colocando una varilla de vidrio
o una varilla debajo de un lado (figura 2a).

b. Vertir asépticamente un tubo de agar tripticasa de soya derretida en la

placa de Petri, inmediatamente cubrir la placa y permitir que el agar se
endurezca.

c. Etiquetar la placa con tu nombre y fecha.

d. Después de que el agar tripticasa de soya se haya endurecido, retirar la

varilla de vidrio o la espiga y coloque la placa sobre la mesa plana.

e. Vertir asépticamente un tubo de agar tripticasa de soya que contiene 0,05

mg de estreptomicina en la superficie de la placa de gradiente de agar
(figura 2b). Cubrir la placa y permitir que el nuevo agar para endurecer.

2. Pipetear 0,3 mL de cultivo de Staphylococcus aureus sobre la superficie de

agar. Usando una espátula de Drigalsky estéril (esterilizar sumergiéndolo en
alcohol al 95%, flameando y enfriamiento en la superficie estéril de la placa),
extender el cultivo sobre la superficie de la placa.

57
 3. Dejar que la superficie de la placa de agar se seque antes de incubar.
Incubar invertido a 37 ° C durante 24 a 48 horas.

B. Segundo período

1. Observar la placa gradiente de agar por el desarrollo de colonias resistentes

de S. aureus en las áreas de mayor concentración de estreptomicina.

2. Registrar los resultados en el informe del ejercicio. 50

3. Usando el cultivo de tripticasa de soya inicial, inocular un tubo de control de

TSB, un tubo que contiene 0.01 y un tubo que contiene 0,05 mg de
estreptomicina. (Estos representan la bacteria original de S. aureus.)

4. De la misma manera, con un asa de inoculación estéril, realizar una

suspensión bacteriana en TSB de colonias que crecen en la región de mayor
concentración de antibiótico de la placa de gradiente de agar. (Estas
representan S. aureus resistente o mutante).

5. De esta suspensión de caldo, inocular un bucle de bacterias en un tubo de

TSB que contiene 0,01 mg de estreptomicina y una que contiene 0.05 mg de
estreptomicina. Hacer lo mismo para un tubo de TSB regular (esto sirve como
su control).

6. Incubar todos los tubos a 37 ° C durante 24 a 48 horas.

PRÁCTICA 3: EFECTO DE LA TEMPERATURA DE EBULLICIÓN EN UN

CULTIVO BACTERIANO

FUNDAMENTO

La temperatura afecta a los organismos de dos formas opuestas. Cuando la

temperatura sube, la velocidad de las reacciones enzimáticas aumenta y el
crecimiento se acelera. Sin embargo, por encima de una temperatura
determinada, las proteínas y otros componentes celulares pueden
desnaturalizarse o dañarse irreversiblemente. Para cada microorganismo existe
una temperatura mínima por debajo de la cual no es posible el crecimiento, una
temperatura óptima a la que el crecimiento es más rápido, y una temperatura
máxima por encima de la cual tampoco es posible el crecimiento. Estas tres

58
temperaturas, llamadas temperaturas cardinales, son características para cada
microorganismo y pueden diferir enormemente entre especies. 7

La temperatura máxima de crecimiento de un organismo refleja la temperatura por

encima de la cual se produce la desnaturalización de uno o más componentes
celulares esenciales, como alguna enzima fundamental. Por ejemplo, la
membrana citoplasmática tiene que permanecer en estado semifluido para que
puedan tener lugar el transporte de nutrientes y las funciones bioenergéticas. Es
decir, si la membrana citoplasmática de un organismo se vuelve rígida hasta el
punto en que no realice correctamente el transporte o no pueda seguir
desarrollando o consumiendo fuerza motriz de protones, el organismo no podrá
crecer.7

59
 MATERIALES

● Tubo con cultivo bacteriano de:

- Pseudomonas aeruginosa

- Bacillus subtilis

- Escherichia coli

- Staphylococcus aureus

● Placa Petri con TSA

PROCEDIMIENTO

1. Separar la placa en cuatro partes iguales con el marcador de vidrio y

nombrar cada parte con el tiempo de incubación a estudiar. Es decir 0, 10, 20,
y 30 minutos. 2. Tomar, con una asada del cultivo y extenderlos sobre la parte
de la superficie de la placa correspondiente al tiempo t = 0. Utilizar una placa
para cada microorganismo.

3. Luego, colocar el tubo en el baño de agua que esté en ebullición. Repetir el

paso 2 a t = 10, 20, y 30 minutos (el tiempo es acumulativo).

4. Incubar la placa a 37ºC durante 24 horas.

5. Al día siguiente, hacer un recuento de las colonias a los diferentes tiempos.

PRÁCTICA 4: ACCIÓN DE LOS ANTISÉPTICOS Y DESINFECTANTES SOBRE

UN CULTIVO BACTERIANO

FUNDAMENTO

La actividad antimicrobiana se puede evaluar usando medios sólidos. Se añade a

discos de papel de filtro cantidades conocidas de un agente antimicrobiano, y se
disponen los discos sobre la superficie de una placa de agar inoculada
uniformemente. Durante la incubación, el agente se difunde desde el disco hacia
el agar y se establece un gradiente; cuanto más lejos se encuentre la sustancia
del papel de filtro, menor es su concentración. Se crea una zona de inhibición con
un diámetro proporcional a la cantidad de agente antimicrobiano añadido al disco,
a la solubilidad del agente, al coeficiente de difusión y a la eficacia total del

60
agente. El método de difusión en disco se usa de manera rutinaria para
determinar la sensibilidad a los antibióticos en patógenos aislados clínicamente. 8

Los antisépticos son biocidas o sustancias químicas que se aplican sobre los
tejidos vivos, con la finalidad de destruir o inhibir el crecimiento de
microorganismos patógenos. No tienen actividad selectiva ya que eliminan todo
tipo de gérmenes. Las altas concentraciones pueden ser tóxicos para los tejidos
vivos.9

Los desinfectantes no tienen actividad selectiva. Su elección debe tener en cuenta

los posibles patógenos a eliminar. Son tóxicos protoplasmáticos susceptibles de
destruir la materia viviente, y no deben ser utilizados sobre tejidos vivos. 10

MATERIALES

● Antisépticos:

- Alcohol yodado

- Peróxido de hidrógeno

- Yodopovidona al 10%

- Timerosal o similar.

● Desinfectantes:

- Fenol

- Hipoclorito de sodio 5,25%.

● Placas Petri con agar tripticasa de soya

● Espátulas de Drigalsky

● Discos de papel filtro estériles

● Mechero Bunsen

● Tubos con suspensión de:

- Escherichia coli

- Pseudomonas aeruginosa

61
 - Staphylococcus aureus

- Bacillus subtilis.

● Pinzas metálicas

PROCEDIMIENTO

1. Separar la placa en tres partes iguales con el marcador de vidrio y nombrar

cada parte con el antiséptico o desinfectante a estudiar.

2. Tomar 0,1 mL de una suspensión bacteriana, y colocarla en el centro de la

placa con TSA.

3. Luego proceder a esparcirla en toda la superficie de la placa con la ayuda de

una espátula de Drigalsky, y sembrar en 3 direcciones; horizontal, vertical y
oblicua

4. Luego con la ayuda de una pinza previamente flameada tomar un “disco” y

se embebe (cada disco) con cada uno de los desinfectantes o antisépticos
escogidos. Eliminar el exceso del líquido en la pared del frasco.

5. Colocar el disco en el área designada para tal fin.

6. Incubar la placa a 37ºC durante 24 horas.

7. Interpretar el efecto de cada una de las sustancias utilizadas, activo si

presenta halo de inhibición (donde sea posible medir el diámetro del halo de
inhibición), e inactivo si no presenta halo de inhibición.

62
IV. RESULTADOS
● OBTENCIÓN DE MUTANTES RESISTENTES A LA LUZ ULTRAVIOLETA

Fig 1. Colonias sobrevivientes en los diferentes tiempos de exposición

La radiación UV es absorbida por los nucleótidos, las bases moleculares del ADN
y ARN de los microorganismos, según la longitud de onda con valores cerca de
200 y 260 nm debido al enlace doble entre las posiciones 4 y 5 de las bases
púricas y pirimídicas. Es decir, la luz absorbida promueve la formación de enlaces
entre nucleótidos adyacentes, con lo que se crean moléculas dobles o dímeros. Si
bien la formación de dímeros de tiamina - tiamina son los más comunes, también
suelen ocurrir dímeros de citosina -citosina, citosina - tiamina, y dimerización de
uracilo. La formación de un número suficiente de dímeros dentro de un microbio
impide que este replique su ADN y ARN lo que impide su reproducción.

63
 ● OBTENCIÓN DE MUTANTES RESISTENTES A ANTIBIÓTICOS

Fig 2. Crecimiento de la estreptomicina

La estreptomicina, han sido utilizados en protocolos de conjugación-

transformación para el intercambio de genes de virulencia o regulatorios,
especialmente con otras bacterias tales como E. coli.

● EFECTO DE LA TEMPERATURA DE EBULLICIÓN EN UN CULTIVO

BACTERIANO

Fig 3. Cultivo de Escherichia coli y Bacillus subtilis expuesto a la

temperatura de ebullición

Escherichia coli

64
 - Crecen a temperaturas que oscilan entre 7 °C y 50 °C, con una
temperatura óptima de 37 ºC
- A 100ºC no se produce crecimiento bacteriano pasados los 2 minutos

Bacillus subtilis

- Crecen a temperaturas que oscilan de hasta 100ºC

- A 100ºC Bacillus subtilis presenta crecimiento microbiano.

La temperatura es uno de los parámetros ambientales más importantes que

condicionan el crecimiento y la supervivencia de los microorganismos. La
temperatura afecta a la velocidad de crecimiento, por lo tanto al tiempo de
generación de estas. Cada bacteria (y suponiendo que el resto de condiciones
ambientales se mantienen constantes) muestra una curva característica de tasa
de crecimiento en función de la temperatura. A partir de la temperatura óptima, si
seguimos subiendo la temperatura se produce un descenso acusado de la tasa de
crecimiento hasta alcanzar la temperatura máxima. Dicha temperatura refleja:
Desnaturalización e inactivación de proteínas enzimáticas esenciales;
colapsamiento de la membrana citoplásmica; lisis térmica de la bacteria.
Cada especie o cepa bacteriana tiene temperaturas cardinales distintas, de modo
que una bacteria puede presentar una temperatura óptima superior a la
temperatura máxima de otra.
Como en este caso que podemos observar que a una temperatura de 100°C el
Bacillus S. tiene un crecimiento mayor a la Escherichia Coli
-

65
 ● ACCIÓN DE LOS ANTISÉPTICOS Y DESINFECTANTES SOBRE UN
CULTIVO BACTERIANO

Fig 4. Cultivo de Escherichia coli y Staphylococcus aureus expuesto a la

acción de antiséptico y desinfectante respectivamente

Tabla 1. Comparación entre Escherichia coli y Staphylococcus aureus

Bacteria: Escherichia coli Bacteria: Staphylococcus aureus

Desinfectante Halo (mm) Antiséptico Halo (mm)

agua oxigenada 40mm cloro 30mm

alcohol de 70º 20mm peroxido de hidrogeno 10mm

alcohol yodado 30mm alcohol isopropilico ---

jabón antibacterial 20mm tintura de yodo 50 mm

66
 V. DISCUSIÓN
ACCIÓN DE LUZ UV

Una característica única de la luz UV es que un intervalo específico de sus

longitudes de onda, comprendido entre los 200 y los 300 nanómetros, se clasifica
como germicida, es decir, puede inactivar microorganismos como bacterias, virus
y protozoos.

La UV-C producida artificialmente se ha utilizado con éxito como germicida y

bactericida durante décadas. Puede matar microorganismos, como bacterias,
virus y otros patógenos.11 La ciencia no ha descubierto un microorganismo que
sea resistente a los efectos de la radiación ultravioleta germicida. La eficacia de
esta depende de: nivel/duración de radiación, tamaño/dimensiones de la sala,
flujo de aire, porcentaje de humedad relativa y ubicación de la lámpara tal como
se observa en la práctica para el tiempo de 10 y 15 minutos.

Según Rivera et al,12 la luz ultravioleta (UV) es una radiación no ionizante, que
actúa a una longitud de onda entre 100 a 400 nm, y se clasifica en tres tipos: UV –
A (315-400nm), UV– B (280-315 nm) y UV– C (200 a 280 nm); esta última es la
más reconocida por su acción germicida a 254 nm, valor que se ha reportado
como el óptimo para dicho efecto. El efecto del tiempo entre los microorganismos
estudiados, se observa una mayor reducción de la población microbiana en
Salmonella typhimurium que en E. coli.

MUTANTES RESISTENTES A ANTIBIÓTICOS

La resistencia bacteriana a los antibióticos es un aspecto particular de su

evolución natural, seleccionada bajo la presión de los productos antibacterianos,
tanto si se trata de antibióticos como de antisépticos o desinfectantes.

Una cepa de E. coli congelada en 1946 contenía un plásmido con genes que
conferían resistencia a la tetraciclina y a la estreptomicina a pesar de que ninguno
de estos antibióticos se había utilizado en aquellas fechas. También se demostró
que algunas cepas que llevaban el plásmido con genes de resistencia a las
penicilinas semisintéticas existían mucho antes del empleo de estos antibióticos. 13

67
El desarrollo de resistencia a la estreptomicina es más eficaz en el caso de
mutaciones en el gen rrs de M. tuberculosis que en el caso de otras bacterias
debido a que las micobacterias poseen una única copia de dicho gen en
comparación con las múltiples copias de otros microorganismos. En el 30% de
cepas de M. tuberculosis estreptomicina resistentes no se han encontrado
mutaciones presentes en estos genes y se cree que existe otro mecanismo de
resistencia diferente.14

La resistencia a fluoroquinolonas es otro ejemplo donde se atribuye a los efectos

debidos a la mutación que afectan los sitios blanco (ADN girasa y topoisomerasa)
del medicamento.15 En el caso de Staph. aureus resistente a meticilina, la bacteria
altera las proteínas que unen penicilina y evita así la acción del antibiótico. 16

AGENTES FÍSICOS EBULLICIÓN

La Escherichia coli, presenta una temperatura óptima a los 37°C,5 como se

observa en la figura, en un tiempo 0 hay crecimiento bacteriano, posteriormente
decrece hasta los 10’ donde se evidencia que aumenta las colonias de E. coli.
Esto puede deberse a una variación de temperatura. Por otro lado, presenta un
punto térmico mortal a los 55°C.17

Respecto al Bacillus subtilis se muestra en la figura que hay un constante

crecimiento bacteriano, es decir no hay disminución de estas colonias, esto puede
deberse a que se presenta presenta un rango de temperatura óptima entre 30 y
40°C, incluso hasta una temperatura mayor a 100°C. Lo que le brinda esta
capacidad de sobrevivir a altas temperaturas según el género Bacillus se debe a
la producción de esporas y toxina emética, la cual es estable al calor, de esta
manera llega a ser termoestable.7

AGENTES QUÍMICOS ANTISÉPTICOS Y DESINFECTANTES

Los mecanismos de acción de los antisépticos y desinfectantes son múltiples,

pero en todos subyace hasta cierto punto la secuencia, el primer pasos sería la
interacción del agente con la superficie del microorganismo, con el propósito de
penetrar al mismo para alcanzar el blanco de la acción, causando daños
bioquímicos diversos y/o causando alteraciones metabólicas, cuyo resultado final
sea la destrucción microbiana. Es de notar que la propia interacción con la

68
superficie microbiana puede causar daños suficientes para alterar la viabilidad del
microorganismo particular.18

Los fenoles se utilizan más como desinfectantes, tienen propiedades

antibacterianas frente a estreptococos, estafilococos y Escherichia coli, y también
propiedades antifúngicas y antivirales.19

Según García J et al,20 bajo las condiciones del experimento y de muestreo

utilizadas en este trabajo, los resultados muestran un efecto de reducción
bacteriana (E. coli) en todos los desinfectantes durante los tiempos de exposición;
sin embargo, los desinfectantes con mayor efectividad fueron el cloro granulado
HTH 65 % y el agua electrolizada Desy. En todos los tiempos de exposición
obtuvieron un 100 % de eficiencia en ambas concentraciones. En el caso del
ácido peracético, al aumentar la concentración su eficacia se mantuvo en 100 %
hasta el minuto 120. Peróxido de hidrógeno resultó el desinfectante con menor
efectividad a una concentración de 10 ppm con un 83.33 % de efecto de
reducción sobre la bacteria E. coli en el minuto 0.

Algunos de los nuevos agentes químicos que han ganado interés en los últimos
años incluyen el dióxido de cloro, ozono, ácidos orgánicos, ácido peroxiacético,
agua electrolizada oxidante y peróxido de hidrógeno. 21

VI. CONCLUSIONES
● Se observó el efecto de la luz UV sobre el crecimiento bacteriano.
● Se aisló un mutante resistente a estreptomicina.
● Se conoció el comportamiento de las cepas de estudio, bajo los efectos de
la ebullición.
● Se comprobó la acción de los agentes químicos (antisépticos y
desinfectantes) frente a las cepas de trabajo.

69
VII. REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS
1. Olivas E, Alarcón L. Manual de prácticas de microbiología básica y
microbiología de alimentos. 1ª ed. Ciudad de Juárez: Universidad
Autónoma de Ciudad Juárez: Instituto de Ciencias Biomédicas; 2004.
2. Granados R, Villaverde C. Microbiología-bacteriología, características y
clasificación bacteriana. 1ra ed. Madrid: Ediciones Paraninfo; 2003.
3. Montoya H. Microbiología básica para el área de la salud y afines. 2da ed.
Medellín: Editorial Universidad de Antioquía; 2008.
4. Oviedo D., Rojas M., Borda R., Durango M., Efecto de la exposición a la luz
ultravioleta uv-c en la viabilidad de especies de Escherichia coli y
Salmonella typhimurium,. 2013, Eng. Technol. Vol.2, N°1.
5. Douillet-Breuil A, Jeandet P, Adrian M, Bessis R. Changes in the
phytoalexin content of various Vitis spp. in response to ultraviolet C
elicitation. J. Agric. Food Chem.1999 47(10):4456-4461.
6. Durich O. Resistencia bacteriana a los antibióticos [Internet]. Elsevier.es.
2000 [citado 14 Julio 2020]. Disponible en: https://www.elsevier.es/es-
revista-medicina-integral-63-articulo-resistencia-bacteriana-los-antibioticos-
10022180
7. Agentes físicos [Internet]. Ugr.es. 2020 [citado 14 Julio 2020]. Disponible
desde:
https://www.ugr.es/~eianez/Microbiologia/13agfisicos.htm#_Toc59451620
8. McDonnell G, Russell AD. Antiseptics and Disinfectants: activity, action and
resistance. Clin Microbiol Rev. 1999;12:147-79
9. Mertz PM, Marshall DA, Eaglestein WH. Occlusive wound dressings to
prevent bacterial invasion and wound infection. J Am Acad Dermatol
1985;12:662-8
10. Grupo Nacional para el estudio y asesoramiento en úlceras por presión y
heridas crónicas. Recomendaciones sobre la utilización de antisépticos en
el cuidado de heridas crónicas. 2002.
www.gneaupp.org/documento/gneaupp/antiseptico.pdf
11. Rivera D., Alfonso P., Béjar, A., Martínez, M., Rivera M., Gustavo, D.,
Aguilar A., et al. (2007). Revista Fitotecnia Mexicana 2007 Postharvest

70
 Biochemical Effects Of Uv-C Irradiation On Fruit And Vegetables , 30, 361–
372.
12. Howar B, Keiser J, Smith T, Weisfeld A, Tilton R. Clinical and Pathogenic
Microbiology. Mosby year book. St. Louis: 1994; 83-99.
13. Oromí J, Resistencia bacteriana a los antibióticos, Medicina Integral, Vol.
36, Núm. 10, Diciembre 2000
14. Honore N, Cole S. Streptomycin resistance in micobacteria. Antimicrob
Agents Chemother 1994; 38: 238-242.
15. Hooper DC. Mechanisms of action and resistance of older and newer
fluoroquinolones. Clin Infect Dis 2000; 31 (Suppl. 2): 24- 28
16. Samaja-Kfoury JN, Araj GF. Recent development in b lactamases and
extended spectrum â lactamases. BMJ 2003; 327: 1209-1213.
17. R Ávila-Sosa, P Aguilar-Alonso, JC Cigarroa-Zárate, G Gastélum-Reynoso.
EVALUACIÓN DE LA SUPERVIVENCIA DE ESCHERICHIA COLI,
STAPHYLOCOCCUS AUREUS Y BACILLUS CEREUS EN UNA SOPA
UTILIZANDO LA DISTRIBUCIÓN DE WEIBULL. CienciaUAT.
2013;7(2):49-55.
18. Poole K. 2002. Mechanisms of bacterial biocide and antibiotic resistance. J
Appl Microbiol; 92: 55S-64S
19. Russell AD, Furr JR. Biocides: mechanisms of antifungal action and fungal
resistance. Sci Prug 1996;79:27-48
20. García J, Medina L, Mercado J, Báez R, Evaluación de desinfectantes para
el control de microorganismos en frutas y verduras [Internet], [citado: 13 de
julio del 2020],
disponible:https://www.redalyc.org/jatsRepo/813/81351597002/html/index.h
tml
21. Joshi K., Mahendran R., Alagusundaram K., Norton T., Tiwari B.K. 2013.
Novel disinfectants for fresh produce. Trends in Food Science &
Technology 34: 54-61.

ANEXO
CUESTIONARIO 4
1. ¿Cómo podría apreciar la mutación inducida por luz UV si usa Serratia
marcescens? Fundamente

71
La cepa de Serratia marcescens produce colonias que pueden ser pigmentadas,
ya que genera un pigmento rojo llamado prodigiosina. Ante la exposición a la luz
254nm UV pueden sobrevivir hasta un máximo de 2 minutos de duración, sin
embargo, pierde la capacidad de producir el pigmento rojo después de exponerlos
durante 15 segundos y cesa por completo después de 15 segundos más de
exposición.1

2. ¿Para qué sirve y cuál es el procedimiento del test de Ames?

El test de Ames es un ensayo biológico de mutagenicidad. Este método es

realizado in vitro y permite evaluar el potencial efecto mutagénico de compuestos
químicos o productos biológicos como una medida indirecta del posible efecto
carcinogénico sobre seres humanos.2,3

Esta prueba utiliza las cepas de Salmonella typhimurium TA 97a, TA 98, TA

100,TA 102, TA 1535 y TA 1538. Estas deben ser provistas por un centro de
referencia que certifique su autenticidad y deberán ser congeladas a -80 ºC (en
freezer) o en nitrógeno líquido para conservarse. Los cultivos congelados se
preparan a partir de cultivos frescos a los que se les agrega un agente
crioprotector, por ejemplo Glicerol al 10 % v/v concentración final. Cada cepa
tiene una mutación en el operón histidina y otras mutaciones que aumentan su
capacidad para detectar mutágenos. 2,3

El procedimiento parte de las muestras control con cultivo bacteriano el cual

cumple la condición de que es auxótrofo para el aminoácido histidina, estas cepas
se denominan His-. A este cultivo se le añaden enzimas hepáticos, ya que estas
enzimas pueden transformar compuestos no mutagénicos en mutagénicos. Se
siembran en una placa de agar. Al cabo de un tiempo emergen unas cuantas
colonias. Serán cepas que han revertido y son capaces de sintetizar la histidina.
Se adiciona un agente mutagénico.3

Hacemos lo mismo pero con un mutágeno potencial. Se adiciona la mezcla a un

círculo y se siembran las bacterias en las placas con histidina. Y se incuba a 37º.
Lo que obtenemos es que ha revertido his +. 3

72
 Fig. 1 Procedimiento del test de Ames

3. ¿Qué factores contribuyen en nuestro entorno al aumento de mutaciones

bacterianas resistentes a diferentes antimicrobianos?

La resistencia antibiótica es un fenómeno biológico natural debido a las

mutaciones y a la gran capacidad de las bacterias de transferir horizontalmente su
material genético, existiendo una clara correlación entre el uso de antibióticos y la
resistencia bacteriana.

Las bacterias se hacen resistentes a los antibióticos desarrollando mecanismos

de resistencia que impiden al antibiótico ejercer su mecanismo de acción. Los
MECANISMOS DE RESISTENCIA de las bacterias son fundamentalmente tres:

● Inactivación del antibiótico por enzimas: La bacteria produce enzimas

que inactivan al antibiótico; las más importantes son las betalactamasas y
muchas bacterias son capaces de producirlas. En los gram positivos suelen
ser plasmídicas, inducibles y extracelulares y en las gram negativas de
origen plasmídico o por transposones, constitutivas y periplásmicas.

73
 También hay enzimas modificantes de aminoglucósidos y aunque no es
éste su principal mecanismo de resistencia, también el cloranfenicol, las
tetraciclinas y los macrólidos pueden ser inactivados por enzimas,
● Modificaciones bacterianas que impiden la llegada del antibiótico al
punto diana: Las bacterias producen mutaciones en las porinas de la
pared que impiden la entrada de ciertos antibióticos (betalactámicos) o
alteran los sistemas de transporte (aminoglucósidos en los anaerobios). En
otras ocasiones pueden provocar la salida del antibiótico por un
mecanismo de expulsión activa, impidiendo que se acumule en cantidad
suficiente para que actúe eficazmente.
● Alteración por parte de la bacteria de su punto diana, impidiendo o
dificultando la acción del antibiótico. Aquí podemos contemplar las
alteraciones a nivel del ADN girasa (resistencia de quinolonas), del ARNr
23S (macrólidos) de las enzimas PBPs (proteínas fijadoras de penicilina)
necesarias para la formación de la pared celular (resistencia a
betalactámicos). Una misma bacteria puede desarrollar varios mecanismos
de resistencia frente a uno o muchos antibióticos y del mismo modo un
antibiótico puede ser inactivado por distintos mecanismos de diversas
especies bacterianas, todo lo cual complica sobremanera el estudio de las
resistencias de las bacterias a los distintos antimicrobianos.

4. ¿Cómo se puede establecer el tiempo que un microorganismo muere a

diferentes temperaturas?

La temperatura es uno de los factores más importantes respecto a la viabilidad y

desarrollo de un microorganismo, por lo cual, la muerte de un microorganismo
dependerá de la temperatura a la que sea sometida. El tiempo de destrucción
térmica indica el tiempo en que un microorganismo muere, además al ser el orden
de termodestrucción logarítmico permite estudiar la evolución de la población de
microorganismos a diferentes temperaturas.5

5. ¿Qué estrategias se deben tener en cuenta a la hora de elegir un

antiséptico o desinfectante?

74
● Tipo y concentración del agente utilizado o intensidad o naturaleza en el
caso de agentes físicos.
● Clase de microorganismo
● Naturaleza de la superficie o material en que se encuentran los
microorganismos
● Número de microorganismos presentes 5. Temperatura 6. Tiempo de
contacto con el agente

Ningún desinfectante o antiséptico es universalmente efectivo contra todos

los microorganismos:

● Deben conocerse las características, el uso e indicaciones, de

cualquier producto antes de utilizarlo.
● Después del lavado es necesario enjuagar bien, ya que algunos
antisépticos se inactivan ante la mezcla de jabones, detergentes y
otros desinfectantes.
● La penetración del antiséptico o desinfectante es bloqueada por la
presencia de polvo, esputo, comida, grasa y sangre. El área se debe
limpiar exhaustivamente antes de la desinfección o esterilización.
● Cuando se utilice el antiséptico en grandes superficies cutáneas,
hay que considerar el grado de absorción y la posible toxicidad
sistémica.
● Antes de utilizar un antiséptico, averigüe las posibles alergias del
paciente, en cuyo caso usar un producto hipoalergénico.
● Las diluciones de estos productos deben prepararse máximo cada
24 horas, o según indicaciones del fabricante. Una mayor duración
las puede convertir en medios de cultivo.
● La solución desinfectante debe estar en contacto con la superficie el
tiempo indicado por el fabricante.
● Vigilar y controlar la fecha de vencimiento de los antisépticos y
desinfectantes.
● La Clorhexidina y el Yoduro de Povidona son sustancias
fotosensibles, por lo que no deben almacenarse en envases
transparentes.

75
 ● Las sustancias deben tener control bacteriológico que garantice su
esterilidad.6

REFERENCIAS BIBLIOGRÁFICAS

1. Das PK, Samal S, Sahoo R, Sabat PK. Resistance of Serratia marcescens

(SPKD15) to various environmental stress conditions: Effect on cell viability and
prodiogisin production. Pharma Tutor, India: 2018, April. 6(4); 18-26.

2. León, M. I. C., & Rodríguez, M. P. (2007). Mineralogía aplicada: salud y medio

ambiente. Editorial Paraninfo.

3. FARMACOPEA - Anmat [Internet]. [Citado 14 julio 2020]. Disponible en:

http://www.anmat.gov.ar/webanmat/fna/flip_pages/Farmacopea_Vol_IV/files/asset
s/basic-html/page99.html

4. Susan M, Joaquim R, José Luis B, Theresa J. Mecanismos moleculares de

resistencia antibiótica en Escherichia coli asociadas a diarrea, Rev Peru Med Exp
Salud Publica. 2011;28(4):648-56.

5. Carrillo L,(2003),Vida y muerte de los microorganismos, Microbiología Agrícola

6. ANTISÉPTICOS Y DESINFECTANTES [Internet],[citado en 14 de julio de 2020]

Disponible en:
https://botplusweb.portalfarma.com/Documentos/2015/3/13/83035.pdf

76